Immunologiske undersøgelser i urologi

At ordinere et immunogram til en urologisk patient betyder, at den behandlende læge har mistanke om tilstedeværelsen af forstyrrelser i immunsystemet. Tilbagevendende bakterielle, virale, svampeinfektioner, allergiske manifestationer, systemiske sygdomme kan være tegn på disse lidelser, som er karakteriseret ved en række syndromer (infektiøse, onkologiske, allergiske, autoimmune, lymfoproliferative). Én patient kan have flere syndromer. For eksempel kan kroniske infektionssygdomme (infektiøst syndrom) forårsage immundefekt, og immundefekt kan manifestere sig som en prædisposition for infektiøse og onkologiske sygdomme (onkologisk syndrom). Prædisposition for infektioner kan forekomme på baggrund af sekundær immundefekt, som er udviklet som følge af en lymfoproliferativ sygdom, såsom leukæmi. Der er tre hovedgrupper af patologiske ændringer i immunsystemet:

• kvantitativ eller funktionel mangel på et eller andet led i immunsystemet, hvilket fører til udvikling af en immundefekttilstand;
• en forstyrrelse i immunsystemets genkendelse af antigener, hvilket fører til udvikling af autoimmune processer;
• et hyperreaktivt eller "perverst" immunrespons, manifesteret ved udvikling af allergiske sygdomme.

Der findes screeningsmetoder (niveau 1-test) og afklaringsmetoder (niveau 2-test) inden for immundiagnostik. Førstnævnte bruges til at registrere forstyrrelser i immunsystemet, sidstnævnte til at fastslå de mekanismer, der er involveret i deres implementering, med henblik på yderligere immunkorrektion.

B-celle immunitet

Screeningsmetoder

• Bestemmelse af det relative og absolutte antal B-lymfocytter ved hjælp af immunofluorescens eller flowcytofluorometri med monoklonale antistoffer mod B-celleantigener (CD19, CD20, hvor CD er differentieringsklynger). Det normale indhold af B-lymfocytter hos voksne er 8-19% af det samlede antal leukocytter eller 190-380 celler/μl. En stigning i indholdet af B-lymfocytter forekommer ved akutte og kroniske bakterielle og svampeinfektioner, kroniske leversygdomme, systemiske bindevævssygdomme, kronisk lymfatisk leukæmi og myelom.
• Bestemmelse af koncentrationen af uspecifikke immunoglobuliner (F, M, G, E) ved simpel radial immunodiffusion, nefelometri eller turbometri, radioimmunoassay eller enzymimmunoassay (ELISA). Normer for voksne: immunoglobulin (Ig) A 0,9-4,5 g/l. IgM 03-3,7 g/l. IgG 8,0-17 g/l. En stigning i koncentrationen af immunoglobuliner forekommer under de samme patologiske tilstande, hvor der forekommer en stigning i indholdet af B-lymfocytter. Et fald i koncentrationen af immunoglobuliner forekommer ved medfødt hypogammaglobulinæmi, neoplasmer i immunsystemet, fjernelse af milten, proteintab, nyre- eller tarmsygdomme, behandling med cytostatika og immunsuppressiva.

Afklaringsmetoder

• Bestemmelse af cirkulerende immunkomplekser i blodet ved selektiv udfældning i polyethylenglycol efterfulgt af spektrofotometrisk densitetstestning (normal 80-20 U). En stigning i cirkulerende immunkomplekser er typisk for akutte bakterielle, svampe-, virusinfektioner, autoimmune sygdomme, immunkomplekssygdomme, serumsyge, allergiske reaktioner af type 3;
• Bestemmelse af specifikke immunoglobuliner i blodet i forhold til bakterielle og virale antigener, deoxyribonukleinsyre (DNA) ved autoimmune sygdomme, påvisning af antisperm (autoimmun infertilitet) og antirenale antistoffer (pyelonefritis og glomerulonefritis) ved hjælp af radial immunodiffusions- eller ELISA-metoden.
• Bestemmelse af antisperm-antistoffer i sædceller [MAR-test (blandet antiglobulinreaktion)], normalt - negativt resultat.
• Bestemmelse af koncentrationen af immunoglobuliner i urin med henblik på differentialdiagnose mellem pyelonefritis og glomerulonefritis (selektivitet af proteinuri).
• Bestemmelse af IgE-indhold i prostatavæske med henblik på diagnosticering af allergisk prostatitis ved hjælp af radial immunodiffusionsmetode eller ELISA.
• Undersøgelse af responsen i reaktionen af B-lymfocyt-blasttransformation på B-celle-mitogen (kermesbærmitogen til stimulering af reaktionen af B-lymfocyt-blasttransformation i nærvær af T-lymfocytter), hvis normative værdi er 95-100%.

T-celle-forbindelsen til immunitet

Screeningsmetoder

• Bestemmelse af det relative og absolutte antal modne CD3 T-lymfocytter ved immunofluorescensreaktion eller flowcytofluorometri ved hjælp af monoklonale anti-CD3-antistoffer. Normen for voksne er 58-76% eller 1100-1700 celler/μl. Et fald i antallet af T-lymfocytter er en indikator for utilstrækkelighed af den cellulære immunitetsforbindelse. Dette er typisk for nogle sekundære og primære immundefekter (kroniske bakterielle og virale infektioner: tuberkulose, erhvervet immundefektsyndrom, maligne tumorer, kronisk nyresvigt, skader, stress, aldring, underernæring, behandling med cytostatika, eksponering for ioniserende stråling). En stigning i antallet af T-lymfocytter forekommer på baggrund af immunhyperaktivitet eller ved lymfoproliferative sygdomme. Ved inflammation stiger antallet af T-lymfocytter først og falder derefter. Fraværet af et fald i T-lymfocytter indikerer en kronisk inflammatorisk proces.
• Evaluering af lymfocyt-subpopulationer.
  • Bestemmelse af antallet af T-hjælpere (anti-CD4-antistoffer). Normalt 36-55% eller 400-1100 celler/mcl. En stigning i antallet af disse celler forekommer ved autoimmune sygdomme, Waldenströms sygdom, aktivering af antitransplantationsimmunitet; et fald i antallet af T-hjælpere forekommer ved kroniske bakterielle, virale og protozoiske infektioner, tuberkulose, erhvervet immundefektsyndrom, maligne tumorer, forbrændinger, skader, underernæring, aldring, behandling med cytostatika, eksponering for ioniserende stråling.
  • Bestemmelse af antallet af T-suppressorer (anti-CD4-antistoffer). Normalt 17-37% eller 300-700 celler/μl. En stigning i antallet af T-suppressorer forekommer under de samme forhold, hvor antallet af T-hjælpere falder, og deres fald forekommer under de samme forhold, hvor indholdet af T-hjælpere stiger.
  • Immunoregulatorisk indeks CD4/CD8, normalt 1,5-2,5. Hyperaktivitet med værdier over 2,5 (allergiske og autoimmune sygdomme); hypoaktivitet - mindre end 1,0 (prædisponering for kroniske infektioner). Ved begyndelsen af den inflammatoriske proces stiger det immunoregulatoriske indeks, og når det aftager, normaliseres det.

Afklaringsmetoder

• Bestemmelse af antallet af naturlige dræbere (NK-celler) - anti-CD16 og anti-CD56 antistoffer. Normen for CD 16 lymfocytter er 6-26%, CD56 - 9-19%. En stigning i antallet af NK-celler forekommer under transplantatafstødning, et fald - ved virusinfektioner, kræft, primære og sekundære immundefekter, forbrændinger, skader og stress, behandling med cytostatika og eksponering for ioniserende stråling.
• Bestemmelse af antallet af T-lymfocytter med en receptor til interleukin-2 (aktiveringsmarkør) - anti-CD25-antistoffer. Normen er 10-15%. En stigning i deres antal observeres ved allergiske sygdomme, transplantatafstødning, respons på thymusafhængige antigener i den akutte periode med primær infektion, et fald - ved de samme sygdomme, hvor der er et fald i antallet af NK-celler.
• Undersøgelse af ekspressionen af aktiveringsmarkøren - klasse II histokompatibilitetsmolekyle HLA-DR. Øget ekspression forekommer i inflammatoriske processer hos patienter med hepatitis C, cøliaki, syfilis og akutte luftvejssygdomme.
• Evaluering af lymfocyt-apoptose. En grov idé om lymfocytters parathed til apoptose kan bestemmes ved ekspressionen af Fas-receptoren (CD95) på deres overflade og bd-2 proto-onkogenet i mitokondrierne. Lymfocyt-apoptose vurderes ved at behandle dem med to fluorescerende farvestoffer: propidiumiodid, som binder til DNA-fragmenter, og annexin Y, som binder til phosphatidylserin, som optræder på cellemembranen ved apoptoseens begyndelse. Resultaterne evalueres ved hjælp af et flowcytofluorometer. Resultaterne beregnes ud fra forholdet mellem celler farvet med forskellige farvestoffer. Ufarvede celler er levedygtige, celler kun bundet til annexin Y er tidlige manifestationer af apoptose, hvor propidiumiodid og annexin Y er sene manifestationer af apoptose, indikerer farvning med kun propidiumiodid nekrose.
• Evaluering af T-lymfocytproliferation in vitro.
  • Ændringer i celleblastogenese - lymfocytblasttransformationsreaktion. Leukocytter inkuberes med ethvert mitogen af planteoprindelse (lektiner). Phytohemagglutinin anvendes oftest i 72 timer, derefter tages en smear, farves, og antallet af blaster tælles! Stimuleringsindekset er forholdet mellem procentdelen af transformerede celler i eksperimentet (kultur med phytohemagglutinin) og procentdelen af transformerede celler i kontrollen (kultur uden phytohemagglutinin). Lymfocytblasttransformationsreaktionen kan vurderes ved at inkludere et radioaktivt mærke (ZN-thymndinum) i de dyrkede celler, da DNA-syntesen øges under celledeling. Forstyrrelser i det proliferative respons forekommer i både primære og sekundære immundefekter forbundet med infektioner, kræft, nyresvigt og kirurgiske indgreb.
  • I disse studier vurderes ekspressionen af aktiveringsmarkører (CD25, transferrinreceptor - CD71) og molekylet af det store histokompatibilitetskompleks klasse II HLA-DR, som praktisk talt ikke findes på hvilende T-lymfocytter. T-lymfocytter stimuleres med fytohæmagglutinin, og efter 3 dage analyseres ekspressionen af aktiveringsmarkører ved hjælp af direkte eller indirekte immunofluorescensreaktion, flowcytofluorometri, ved anvendelse af monoklonale antistoffer mod de isolerede receptorer.
  • Måling af mængden af mediatorer syntetiseret af aktiverede T-lymfocytter [interleukin (IL) 2, IL-4, IL-5, IL-6, γ-interferon osv.] ved hjælp af radioimmunoassay eller ELISA. Af særlig betydning er vurderingen af koncentrationen af γ-interferon og IL-4 som markører for Th1 og Th2 i supernatanten af aktiverede kulturer og inde i cellen. Hvis det er muligt, er det nyttigt at bestemme genekspressionen for det tilsvarende cytokin ved hjælp af niveauet af matrixribonukleinsyre i producentcellen og intensiteten af ekspressionen af receptorer for de tilsvarende cytokiner.
    
• Reaktion på hæmning af lymfocytmigration. Sensibiliserede T-lymfocytter udskiller lymfokiner i reaktion med antigen, herunder faktorer, der hæmmer lymfocytmigration. Hæmningsfænomenet observeres, når mitogener introduceres i cellekulturen. Evaluering af hæmningsgraden giver os mulighed for at bedømme lymfocytters evne til at udskille cytokiner. Normalt er migrationsfrekvensen, afhængigt af det specifikke mitogen, 20-80%.
• Vurdering af NK-cellecytotoksicitet. Naturlige dræbercellers evne til at dræbe målceller i K-562 erythromyeloid-linjen bestemmes. Hvis antistofafhængig cytotoksicitet vurderes, anvendes målceller coatet med IgG-antistoffer. Målceller mærkes med 3H-uridin og inkuberes med effektorceller. Målcellernes død vurderes ved frigivelse af det radioaktive mærke i opløsningen. Et fald i cytotoksicitet forekommer i maligne neoplasmer. I nogle tilfælde, når det er nødvendigt at forudsige effektiviteten af behandling med interleukiner, vurderes NK-cellernes cytotoksicitet under inkubation med visse cytokiner.

Undersøgelse af fagocytfunktion

Screeningsmetoder

Undersøgelse af absorptionsintensiteten af mikrobielle celler af fagocytter (fagocytose af latexpartikler, testkultur af stafylokokker, E. coli eller mikroorganismer isoleret fra patienten). Ved centrifugering af hepariniseret blod isoleres en suspension af leukocytter, serum af IV-blodgruppen tilsættes til opsonisering (opsoniner er proteiner, der forstærker fagocytose). Den mikrobielle suspension fortyndes, blandes med leukocytter og inkuberes i 120 minutter, og prøver udtages til analyse 30.90.120 minutter efter inkubationens start. Udstrygninger foretages fra den indsamlede leukocytsuspension. Følgende fagocytoseindikatorer bestemmes:

• fagocytisk indeks - procentdelen af celler, der gik i fagocytose inden for 30 minutter og 120 minutter efter inkubation; standardværdien for fagocytisk indeks (30) er 94 %, fagocytisk indeks (120) er 92 %;
• fagocyttal - det gennemsnitlige antal bakterier placeret intracellulært; standardværdien for fagocyttallet (30) er 11%, fagocyttallet (120) er 9,8%;
• fagocyttalkoefficient - forholdet mellem fagocyttal (30) og fagocyttal (120); normalt 1,16;
• Neutrofil baktericid indeks - forholdet mellem antallet af mikrober, der dræbes inde i fagocytter, og det samlede antal absorberede mikrober; normalt 66 %.

Afklaringsmetoder

• Undersøgelse af fagocytters bakteriedræbende evne i testen med nitroblåt tetrazolium (NBT) - NBT-test. Gult nitroblåt tetrazoliumfarvestof tilsættes leukocytter. Når en neutrofil absorberer farvestoffet, sker der en reduktionsproces under påvirkning af frie iltradikaler, hvilket resulterer i blå farvning. Reaktionen udføres i en fladbundet plade med 96 brønde. Hanks' opløsning (spontan NBT) tilsættes de første tre brønde med en blanding af NBT og leukocytter, og latexpartikler tilsættes den anden; blandingen inkuberes ved 37 °C i 25 minutter. Resultaterne aflæses ved 540 nm på en læser og udtrykkes i vilkårlige enheder. Stimuleringskoefficienten (Kst ₎ beregnes, lig med forholdet mellem den optiske densitet i de stimulerede brønde og den gennemsnitlige optiske densitet i brøndene uden stimulering. Hos raske mennesker er NBT _spont = 90 ± 45 CU, NBT _stim = 140 ± 60 CU. Retmaske = 1,78 ± 0,36 _.
• Undersøgelse af adhæsionsmolekyler. Flowcytofluorometri bruges til at bestemme ekspressionen af overfladeantigener CD11a/CD18, CD11b/CD18, CD11c/CD18. Immundefekter med nedsat adhæsion manifesterer sig ved tilbagevendende infektioner, langsom sårheling og fravær af pus i infektionscentrene.

Undersøgelse af komplementsystemet

Screeningsmetoder

Bestemmelse af komplements hæmolytiske aktivitet er et studie af den klassiske komplementaktiveringsvej. Forskellige fortyndinger af serum fra en syg og en rask person tilsættes til erytrocytter belagt med antistoffer. Enheden for hæmolytisk aktivitet er den reciprokke serumfortynding, hvor 50% af erytrocytterne ødelægges. Hæmolysegraden estimeres fotometrisk ved frigivelse af hæmoglobin i opløsningen. Et fald i komplements hæmolytiske aktivitet observeres ved systemisk lupus erythematosus med nyreskade, akut glomerulonefritis, kombineret immundefekt, myasteni, viral hepatitis, lymfomer, en stigning - i obstruktiv gulsot, Hashimotos thyroiditis, gigt, leddegigt, nodulær periarteritis, dermatomyositis, myokardieinfarkt, ulcerøs colitis, Reiters syndrom, gigt.

Afklaringsmetoder

• Bestemmelse af komplementkomponenter. Kvantitativ bestemmelse udføres ved radial immunodiffusion og nefelometri.
  Undersøgelsen er ikke informativ, medmindre komplementkomponenternes antigene egenskaber ændres.
• Det er blevet fastslået, at Clq-komponenten i komplement forstærker fagocytose og medierer cellulær cytotoksicitet. Dens reduktion forekommer i immunkomplekssygdomme, systemisk lupus erythematosus, purulente infektioner og tumorer.
• C3-komponenten er involveret i aktiveringen af de klassiske og alternative komplementveje. Et fald i dens koncentration er forbundet med kroniske bakterielle og svampeinfektioner, tilstedeværelsen af cirkulerende eller vævsimmunkomplekser.
• C4-komponenten er involveret i aktiveringen af den klassiske signalvej. Et fald i dens koncentration er forbundet med forlænget aktivering af komplement af immunkomplekser og et fald i koncentrationen af C1-hæmmeren, som kontrollerer aktiveringen af den klassiske komplementvej. C4-mangel forekommer ved systemisk lupus erythematosus, en stigning i C4 forekommer ved nyresygdom, transplantatafstødning, akut inflammation og gastrointestinale sygdomme.
• C5a er et lille fragment af C5-molekylet, som fraspaltes fra det som følge af aktivering af komplementsystemet. Dets koncentration stiger under inflammation, sepsis, atopiske og allergiske sygdomme.
• Cl-hæmmeren er en multifunktionel faktor. Den kontrollerer aktiveringen af komplementkomponenten C1, hæmmer aktiviteten af kallikrein, plasmin og aktiveret Hageman-faktor, Cls og Or-proteaser. Mangel på C1-hæmmeren fører til angioødem.
• Funktionelle studier af komplement. Testserummet tilsættes et standardserum, der mangler komplementkomponenter, og komplementets hæmolytiske aktivitet bestemmes. Hvis den hæmolytiske aktivitet ikke genoprettes til normal, anses aktiviteten af denne komplementkomponent i testserummet for at være reduceret.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ]