Diagnose af herpes

Diagnosen af herpes er baseret på klassisk virusisolering på følsomme cellekulturer, immunofluorescens- og serologiske metoder, kolposkopisk undersøgelse og brugen af moderne molekylærbiologiske metoder (PCR, punkthybridisering), som muliggør diagnosticering af hele gruppen af herpesvirus, inklusive typerne HHV-6 og HHV-7.

Laboratoriediagnostiske metoder til herpesinfektion

De vigtigste metoder til isolering af HSV eller påvisning af viruspartikler og/eller deres komponenter	Hjælpemetoder til at detektere antistoffer mod HSV i biologiske væsker i den menneskelige krop
Isolering af HSV i følsomme celle- og dyrekulturer Direkte og immun elektronmikroskopi Direkte og indirekte varianter af IPA'en IFA Molekylærbiologiske metoder Latexagglutinationsreaktion	Neutraliseringsreaktion RSC Bestemmelse af antistoffer mod ikke-strukturelle proteiner af HSV-1,2

Det blev vist, at hos 76% af patienterne er genital herpes (GH) forårsaget af HSV-2, og hos 24% af HSV-1. Desuden forekom GH som en monoinfektion kun hos 22% af patienterne, og i 78% af tilfældene blev der påvist mikrobielle associationer. Hos 46% af individerne blev der påvist parasitocenose forårsaget af to patogener, herunder klamydia, i 40% af tilfældene. Gardnerella, trichomonas og gonokokker blev mindre hyppigt påvist i smearprøver.

Hos 27% af patienterne var parasitocenosen repræsenteret af tre patogener, hos 5,2% - af fire patogener. Desuden blev en kombination af klamydia med gardnerella og Candida-svampe oftest observeret. Disse data underbygger behovet for en grundig bakteriologisk undersøgelse af patienter med væksthormon (GH) for at identificere kombinationer af patogene agenser, samt en dybdegående undersøgelse af patogenesen af blandede infektioner i urogenitalkanalen, hvilket vil muliggøre differentieret kompleks behandling af herpesinfektion.

Materialer undersøgt til isolering af HSV afhængigt af lokaliseringen af herpetiske læsioner

Lokalisering af læsioner	Vesikelindhold	Celleskrabning				CSF	Bronkial aspirat	Biopsi	Blod
		1	2	3	4
Læder	+								+
Øjne			+						+
Kønsorganer				+					+
Anus	+				+				+
Mund	+	+							+
CNS	+					+		+	+
Lunger		+					+		+
Lever								+	+
Medfødt herpes	+	+	+				+		+

Metoder til laboratoriediagnostik af cytomegalovirusinfektion

Metoder	Tid, der kræves for at opnå resultater	Noter
VIROLOGISK
Elektronmikroskopi	3 timer	Ikke særlig tilgængelig
Virusisolering i cellekultur (VCI)	4-20 dage	Standard, Langsom
Immunofluorescensfarvning af tidlig AG ved hjælp af monoklonale antistoffer	6 timer	Mindre specifik
CYTOLOGISK	2-3 timer	Mindre specifik
SEROLOGISK
RSC	2 dage	Standard
RGA	1 dag	Arbejdskrævende
REV	6 timer	Enkel, specifik
NRIF	6 timer	Vanskelig
RIMP	6 timer	Vanskelig
ELISA (IgM, DO)	6 timer	Hurtig, enkel
Immunoblot	6 timer	Dyr
MOLEKYLÆRBIOLOGISK
MG	5-7 dage	Dyrt, arbejdskrævende
PCR	3 timer	Dyr

Metoder til diagnosticering af herpes zoster-virus

Diagnostiske metoder	Laboratorieteknikker
INDIREKTE
Udvælgelse	Vævskultur, kyllingeembryoner, forsøgsdyr, samkultur med permissive celler eller hjælpervirusser
Identifikation af isolater	Neutraliseringsreaktion, RSC, IF, PIEF, reaktion af isolater, udfældning, agglutination, IF
DIREKTE
Cytologi	Udstrygning: farveimmunofluorescens
Histologi	Cellens patomorfologi
Struktur	Embryonisk mikroskopi, immunoelektronmikroskopi
Bestemmelse af antigener	HVIS, PIEF, RIM, IFA
Bestemmelse af lokal antistofproduktion	IgM, IgG, IgA: ELISA, RIA
Molekylærbiologiske tilgange	Molekylær hybridisering, PCR

Laboratoriediagnostik af infektion forårsaget af herpes zoster-virus

Diagnostiske problemer	Metoder	Forventede resultater
Akut primær infektion	1	Detektion på 2 timer
	2	Antistofniveauer stiger langsomt
	3	Til stede 3 dage efter infektion
Akut reaktiveret infektion	1	Påvisning af UUU efter 2 timer
	2	Antistofniveauer stiger langsomt
	4	Til stede 4 dage efter udslættet viser sig

1. bestemmelse af vesikler af VEGF i væske;
2. serologi: CSC, ELISA, med henblik på detektion
3. serologi: ELISA med det formål at detektere IgM;
4. serologi: ELISA med det formål at detektere IgA, IgM.

Metoder til indikation af immunresponset på herpes zoster-virusinfektion

Nærme sig	Metode
Påvisning af en stigning i antistoftiter i det andet serum	RSK, RTGA, RPGA, IF-neutraliseringsreaktion, RIM, ELISA
Påvisning af Ig G- og Ig A-klassespecifikke antistoffer i den første serumprøve	ELISA, IF, RIM, latexagglutination

Fortolkning af resultaterne af serologisk undersøgelse af patienters sera for herpesvirusinfektioner (ELISA)

Navn på infektion/markør	Gennemsnitlige tærskelværdier for infektioner
	Resultaterne af analysen	Fortolkning
Cytomegali Anti-CMV IgG (1-20 U/ml) Anti-CMV IgM (100-300%)	Positiv 1-6 Positiv 6-10 Positiv >10 Negativ Positiv 100-300 Negativ <90 Tvivlsom 90-100	Remission Forværring af sygdommen Akut fase af sygdommen Ingen infektion (sygdom) Akut fase af sygdommen Gentag analysen om 2-3 uger
Herpes simplex 1,2 serotyper Anti-HSV 1/2 i alt (100-900%)	Positiv 100-400 Positiv 400-800 Positiv >800 Negativ <100	Remission Forværring af sygdommen Akut fase af sygdommen Ingen infektion (sygdom)

Tabellen præsenterer de vigtigste metoder til laboratoriediagnostik af herpesvirusinfektioner, samt anbefalede biologiske materialer, der undersøges ved isolering af HSV, under hensyntagen til lokaliseringen af herpetiske læsioner.

Pålidelig isolering af herpes simplex- og CMV-vira ved infektion af følsomme cellekulturer. Under virologisk undersøgelse af 26 patienter i tilbagefaldsperioden blev HSV således isoleret på en følsom Vero-cellekultur i 23 tilfælde (88,4%). Inficerede kulturer viste et billede af cytopatisk virkning typisk for HSV - dannelsen af multinukleerede kæmpeceller eller en ophobning af afrundede og forstørrede celler i form af klynger. I 52,1% af tilfældene kunne foci af cytopatisk virkning af virusset detekteres allerede 16-24 timer efter infektion. Ved 48-72 timers inkubation af inficerede kulturer steg procentdelen af materialer, der forårsagede specifik celledestruktion, til 87%. Og kun i 13% af tilfældene blev positive resultater detekteret 96 timer efter infektion eller mere eller under gentagen passage.

Metoder til laboratoriediagnostik af generaliseret herpesinfektion

De vigtigste metoder til at detektere (isolere) herpesvirusser, deres partikler og deres komponenter	Hjælpemetoder rettet mod at detektere antistoffer mod herpesvirus i biologiske væsker, detektere enzymatiske ændringer i blodserum
Isolering af herpesvirus på følsomme celle- og dyrekulturer Direkte og immun elektronmikroskopi Direkte og indirekte varianter af immunoperoxidasemetoden Direkte og indirekte varianter af fluorescerende antistofmetode Varianter af fastfase-enzymimmunoassay Varianter af den molekylære (DNA-DNA) hybridiseringsmetode Polymerasekædereaktion Latexagglutinationsreaktion	Neutraliseringstest Komplementfikseringstest Latexagglutinationstest Indirekte version af fluorescerende antistofmetoden Indirekte version af immunoperoxidasemetoden Varianter af fastfase-enzymimmunoassay Immunblottingmetode Radial komplementfikseringsmetode Bestemmelse af alanin- og aspartataminotransferaseniveauer

Serologiske metoder anvendes til at diagnosticere infektiøs mononukleose (en infektion forårsaget af EBV). Paul-Bunnell-reaktionen med vædderrøde blodlegemer, en diagnostisk titer på 1:28 eller højere i en enkelt blodserumtest eller en 4-dobbelt stigning i antistoffer ved undersøgelse af parrede sera. Hoff-Bauer-reaktionen med en 4% suspension af formaliserede hesterøde blodlegemer anvendes. Resultatet tages i betragtning efter 2 minutter; ved infektiøs mononukleose er reaktionen meget specifik.

I øjeblikket udvikles en enzymimmunoassay (EIA)-metode til diagnosticering af infektiøs mononukleose. I dette tilfælde bestemmes IgG- og IgM-antistoffer i patientens serum ved at inkubere det med lymfoblaster inficeret med EBV, efterfulgt af behandling med fluorescerende antistoffer. I den akutte periode af sygdommen bestemmes antistoffer mod det virale kapsid-antigen i en titer på 1:160 og højere.

Når man bruger en række importerede kommercielle testsystemer, kan ELISA detektere: antistoffer mod EBV-kappeantistoffer, antistoffer mod EBV tidligt antigen, totale antistoffer mod EBV tidligt antigen, bestemt i sygdommens akutte fase både i kernen og i cellecytoplasmaet, og begrænsede antistoffer mod tidlig EBV, bestemt i sygdommens akutte fase både i kernen og i cellecytoplasmaet, begrænsede antistoffer mod EBV tidligt antigen, bestemt på sygdommens højdepunkt kun i cellecytoplasmaet, og antistoffer mod EBV nukleart antigen. Brugen af disse testsystemer muliggør differentialdiagnostik af en række sygdomme forbundet med EBV.

Efter en positiv ELISA-test, der afslører antistoffer mod EBV, udføres en bekræftende immunoblotting-reaktion, som bestemmer tilstedeværelsen af antistoffer mod individuelle EBV-markørproteiner (p-proteiner): p23, p54, p72 (tilstedeværelsen af dette protein indikerer muligheden for EBV-reproduktion), p 138. Ovenstående laboratoriemetoder anvendes også til at overvåge behandlingens effektivitet.

Virologiske metoders følsomhed er 85-100 %, specificiteten er 100 %, og studietiden er 2-5 dage. Den direkte immunofluorescensmetode (DIF) med polyklonale eller monoklonale antistoffer mod HSV-1 og HSV-2 anvendes ofte i praksis. DIF-metoden er ret let reproducerbar i et almindeligt klinisk laboratorium, er ikke dyr, følsomheden er over 80 %, og specificiteten er 90-95 %. Immunofluorescensmikroskopi afslørede tilstedeværelsen af cytoplasmatiske inklusioner, morfologiske træk og procentdelen af inficerede celler i udstrygninger fra urinrøret, livmoderhalskanalen, livmoderhalsen og endetarmen.

PIF-metoden giver en idé om cellernes morfologiske egenskaber og ændringer i lokaliseringen af HSV-antigener. Ud over direkte tegn på celleskade forårsaget af herpesvirus (påvisning af specifik luminescens) er der indirekte tegn på herpesinfektion ifølge PIF-data:

• aggregering af nukleart stof, frigørelse af karyolemmaet;
• tilstedeværelsen af såkaldte "hul"-kerner, når kun ét karyolemma er tilbage fra cellekernen;
• tilstedeværelsen af intranukleære indeslutninger - Cowdry-legemer.

Når lægen udfører PIF, modtager vedkommende ikke kun en kvalitativ, men også en kvantitativ vurdering af de inficerede cellers tilstand, som vi brugte til at vurdere effektiviteten af den antivirale behandling med acyclovir (AC). Således blev 80 patienter med simpel genital herpes (GH) undersøgt ved hjælp af PIF-metoden i dynamik. Det blev vist, at hvis 88% af patienterne før behandling med acyclovir havde en høj procentdel af inficerede celler (50-75% og højere) i smears, så blev der efter én kur med acyclovir påvist raske celler i smears hos 44% af patienterne, i 31% af tilfældene blev der observeret enkeltstående inficerede celler, og hos 25% af patienterne var der op til 10% inficerede celler.

Indhold af inficerede celler i smears (PIF-reaktion) hos patienter med genital herpes behandlet med acyclovir

Sygdomsperioder	Procentdel af indhold i udstrygninger
	Inficerede celler					Normale celler
	Mere end 75%	50-75%	40-50%	10%	Enkeltceller i synsfeltet
Tilbagefald (før behandling)	25%	63%	12%
	(20)	(50)	(10)
Remission (efter behandling)				25%	31%	44%
				(20)	(25)	(35)

Ved at bruge PIF og dot-hybridiseringsmetoden i mange år er det blevet bemærket, at resultaterne af undersøgelsen stemmer overens i næsten 100% af tilfældene. Det skal bemærkes, at for at øge pålideligheden af diagnosen herpes, især i tilfælde af subkliniske og lavmanifestationer af herpes, anbefales det at anvende 2-3 metoder til laboratoriediagnostik i arbejdet, især ved undersøgelse af gravide kvinder, kvinder med en ugunstig obstetrisk historie og personer med en uspecificeret gynækologisk diagnose.

Ved PCR-diagnostik af virale og bakterielle infektioner i urogenitalkanalen er det derfor nødvendigt at evaluere de opnåede positive resultater under hensyntagen til anamnesen og tilstedeværelsen (eller fraværet) af specifikke kliniske symptomer på sygdommen. Hvis klamydia påvises ved hjælp af PCR, er der i dette tilfælde en høj sandsynlighed for infektion, og behandlingsproblemerne kan løses i overensstemmelse hermed. Ved påvisning af mykoplasmer (ureaplasmer), som er opportunistiske mikroorganismer, kræves yderligere kulturundersøgelser for at bekræfte diagnosen, dvs. såning af materiale fra patienten på følsomme cellekulturer. Kun hvis der opnås positive resultater i kulturanalysen, kan vi tale om laboratoriebekræftelse af diagnosen mykoplasmose. Den samme metode vil om nødvendigt give mulighed for at bestemme følsomheden af de isolerede mykoplasmer over for ofte anvendte doseringsformer (antibiotika, fluorquinoloner osv.).

Samtidig infektion med flere vira af Herpesviridae-familien er mulig. Vi har ofte påvist infektion hos én patient med HSV-1-, HSV-2- og CMV-vira. Patienter med kliniske og laboratoriemæssige manifestationer af sekundær IDS (onkohæmatologiske, onkologiske, HIV-inficerede patienter) var signifikant oftere inficeret med flere herpesvira. Det er således blevet vist, at kliniske og immunologiske lidelser, der progredierer i HIV-infektion, ledsages af en stigning i antallet af herpesvira, der detekteres ved hjælp af den molekylære hybridiseringsmetode. I dette tilfælde kan den mest prognostisk signifikante betragtes som den komplekse samtidige detektion af HSV-1-, CMV- og HHV-6-type DNA.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ]