Neurale stamceller

Eksperimentelle beviser for muligheden for regenerering af CNS-celler blev opnået meget tidligere end opdagelsen af embryonale stamceller i studier, der viste tilstedeværelsen af celler i neocortex, hippocampus og olfaktoriske løger i hjernen hos voksne rotter, der indfanger 3H-thymidin, dvs. er i stand til proteinsyntese og -deling. Tilbage i 60'erne af det sidste århundrede blev det antaget, at disse celler er forløbere for neuroner og er direkte involveret i lærings- og hukommelsesprocesserne. Lidt senere blev tilstedeværelsen af synapser på neuroner dannet de novo afsløret, og de første arbejder med brugen af embryonale stamceller med det formål at inducere neurogenese in vitro dukkede op. I slutningen af det 20. århundrede førte eksperimenter med den målrettede differentiering af ESC'er til neurale progenitorceller, dopaminerge og serotonerge neuroner til en revision af de klassiske ideer om pattedyrs nervecellers evne til at regenerere. Resultaterne af talrige studier har overbevisende bevist både realiteten af omstruktureringen af neurale netværk og tilstedeværelsen af neurogenese gennem hele perioden af pattedyrsorganismens postnatale liv.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ]

Kilder til neurale stamceller

Humane neurale stamceller isoleres under operationer på den subventrikulære region af de laterale ventrikler og den dentate gyrus i hippocampus, hvis celler danner neurosfærer (neurale sfærer) i kultur, og efter dispersion og prædannelse af sidstnævnte - alle de vigtigste celletyper i centralnervesystemet eller, i et specielt medium, nye mikrosfærer. I suspensionskulturer af dissocieret væv isoleret fra de periventrikulære regioner i den embryonale hjerne opstår der også neurosfærer.

Markører for umodne hjerneceller omfatter nestin, beta-tubulin III (neuronal afstamningsmarkør), vimentin, GFAP og NCAM, som identificeres immunocytokemisk ved hjælp af monoklonale antistoffer. Nestin (intermediært neurofilamentprotein type IV) udtrykkes af multipotente neuroektodermale celler. Dette protein bruges til at identificere og isolere multipotente neuroepiteliale progenitorceller fra CNS ved hjælp af monoklonale antistoffer Rat-401, som kan detektere op til 95% af neurale rørceller i rotteembryoner på den ellevte drægtighedsdag. Nestin udtrykkes ikke på differentierede efterkommere af neurale stamceller, men er til stede i tidlige neurale progenitorceller, postmitotiske neuroner og tidlige neuroblaster. Denne markør er blevet brugt til at identificere neuroepiteliale progenitorceller og til at bevise eksistensen af stamceller i CNS. Vimentin (intermediært neurofilamentprotein type III) udtrykkes af neurale og gliale progenitorceller, såvel som neuroner, fibroblaster og glatte muskelceller. Derfor mangler begge immunocytokemiske markører den specificitet, der kræves til separat at identificere neurale stam- og progenitorceller. Beta-tubulin III fastlægger den neuronale retning af stamcelledifferentiering, hvorimod type I astrocytter identificeres ved GFAP-ekspression, og oligodendrocytter udtrykker specifikt galactocerebrosid (Ga!C).

FGF2 og EGF fungerer som mitogener for neurale progenitorceller, der understøtter proliferationen af udifferentierede progenitorceller i kultur med dannelsen af neurosfærer. Hastigheden af neurale stamcelledeling øges signifikant under påvirkning af FGF2, såvel som ved brug af en kombination af FGF2 + EGF. De proliferative virkninger af FGF2 medieres af FGF2-R1-receptorer. Heparin øger affiniteten af FGF2-receptorbinding og forbedrer dramatisk dens mitogene effekt på neuroepitelceller. I de tidlige stadier af embryogenesen udtrykkes FGF2-receptorer i rotte-telencephalon, mens deres lokalisering i senere stadier er begrænset til den ventrikulære zone. Toppen af FGF2-R1-ekspression af postmitotiske celler observeres ved afslutningen af den tidlige neurogeneseperiode. Den indledende periode med telencephalonudvikling er karakteriseret ved et lavt niveau af EGF-receptorekspression, hovedsageligt i cellerne i den ventrale region. I senere stadier af embryogenesen øges EGF-R-ekspressionen i dorsal retning. I gnaverhjernen har EGF en høj affinitet for den transformerende vækstfaktor beta-receptor (TGF-beta-R), som den fortrinsvis binder til. Indirekte bevis for EGF-R's funktionelle rolle leveres af data om kortikal dysgenese af forhjernen, der forekommer i den sene periode af embryogenesen og postnatal ontogenese, nedsat forhjernefunktion, kortikal celledød og hippocampal ektopi hos EGF-receptorgen-knockout-mus. Derudover er tilstedeværelsen af TGF-a i næringsmediet absolut nødvendig for dannelsen af neurosfærer. Efter fjernelse af vækstfaktorer fra det konditionerede medium stopper cellerne med at dele sig og undergår spontan differentiering med dannelsen af neuroner, astrocytter og oligodendroblaster.

Under hensyntagen til dette udføres reaggregering af dissocierede stamceller og dyrkning af neurosfærer i næringsmedier indeholdende EGF og basisk FGF eller FGF2, men uden tilsætning af serum. Det er blevet vist, at EGF inducerer proliferation af stamceller i den subependymale zone i de laterale ventrikler, og basisk FGF fremmer proliferation af stamceller i striatum, hippocampus, neocortex og synsnerven i den modne hjerne. Kombinationen af EGF og basisk FGF er absolut nødvendig for aktiv proliferation af stamceller isoleret fra ependyma i den tredje og fjerde ventrikel i forhjernen, såvel som fra spinalkanalen i den thorakale og lumbale rygmarv.

Efter dissociation dyrkes suspensionen af neurale stamceller i plastikskåle eller flerbrøndsplader uden et klæbende substrat for at øge størrelsen af de nye dannede neurosfærer, hvilket normalt tager omkring 3 uger. Metoden med multipel dispersion og reproduktion af neurosfærer muliggør opnåelse af et tilstrækkeligt antal lineære kloner af multipotente stamceller til intracerebral transplantation. Dette princip er også grundlaget for at skabe en bank af stamceller isoleret fra den menneskelige embryonale hjerne. Deres langsigtede (over flere år) kloning gør det muligt at opnå stabile linjer af neurale stamceller, hvorfra katekolaminerge neuroner dannes under induceret differentiering.

Hvis neurosfærer ikke dispergeres og dyrkes på klæbende substrater i medier uden vækstfaktorer, begynder prolifererende stamceller at differentiere spontant og danne neuronale og gliale precursorceller, der udtrykker markører for alle typer nerveceller: MAP2, Tau-1, NSE, NeuN, beta-tubulin III (neuroner), GFAP (astrocytter) og CalC, 04 (oligodendrocytter). I modsætning til muse- og rotteceller tegner neuroner sig for mere end 40% af alle differentierede celler i humane neurale stamcellekulturer (fra 1 til 5% hos gnavere), men der dannes betydeligt færre oligodendrocytter, hvilket er meget vigtigt set fra celleterapiens synspunkt af demyeliniserende sygdomme. Problemet løses ved at tilsætte B104-kulturmedium, som stimulerer dannelsen af myelinproducerende celler.

Når man dyrker neurale progenitorceller fra hjernen fra menneskelige embryoner i et medium indeholdende EGF, basisk FGF og LIF, øges antallet af neurale afstamningsforløberceller 10 million gange. Celler, der er opformeret in vitro, bevarer evnen til at migrere og differentiere til neurale og gliale elementer efter transplantation i hjernen hos modne rotter. Imidlertid er antallet af delinger af multipotente prækursorceller in vivo begrænset. Det er gentagne gange blevet bemærket, at Hayflick-grænsen for en "voksen" neural stamcelle (ca. 50 mitoser) stadig er uopnåelig, selv i et eksperiment - celler i form af neurosfærer bevarer deres egenskaber i kun 7 måneder og først efter 8 passager. Det menes, at dette skyldes de særlige forhold ved deres dispersionsmetoder under passage (trypsinisering eller mekanisk handling), hvilket kraftigt reducerer cellernes proliferative aktivitet på grund af afbrydelse af intercellulære kontakter. Hvis man i stedet for dispersion anvender metoden med at opdele neurosfærer i 4 dele, øges cellernes levedygtighed under passage betydeligt. Denne metode tillader dyrkning af humane neurale stamceller i 300 dage. Efter denne periode mister cellerne dog mitotisk aktivitet og undergår degeneration eller går ind i stadiet med spontan differentiering med dannelsen af neuroner og astrocytter. På dette grundlag mener forfatteren, at 30 mitoser er det maksimale antal delinger for dyrkede neurale stamceller.

Når humane neurale stamceller dyrkes in vitro, dannes der overvejende GABAerge neuroner. Uden særlige betingelser danner neurale progenitorceller kun dopaminerge neuroner (nødvendige til celleterapi af Parkinsons sygdom) i de første passager, hvorefter alle neuroner i kulturen udelukkende består af GABAerge celler. Hos gnavere forårsager IL-1 og IL-11, såvel som fragmenter af nervecellemembraner, LIF og GDNF, induktion af dopaminerge neuroner in vitro. Denne metodologiske tilgang har imidlertid vist sig at være mislykket hos mennesker. Ikke desto mindre, når GABAerge neuroner transplanteres intracerebralt in vivo, under påvirkning af mikromiljøfaktorer, opstår der nerveceller med forskellige mediatorfænotyper.

Søgning efter kombinationer af neurotrofiske faktorer viste, at FGF2 og IL-1 inducerer dannelsen af dopaminerge neuroblaster, som dog ikke er i stand til at producere dopaminerge neuroner. Differentiering af hippocampale stamceller til excitatoriske glutamaterge og inhibitoriske GABA-erge neuroner sker under påvirkning af neurotrofiner, og EGF og IGF1 inducerer dannelsen af glutamaterge og GABA-erge neuroner fra neurale progenitorceller fra humane embryoner. Sekventiel tilsætning af retinsyre og neurotrofin 3 (NT3) til kulturen øger signifikant differentieringen af modne hjerne-hippocampale stamceller til neuroner af forskellig mediatornatur, mens en kombination af hjerneafledt neurotrofisk faktor (BNDF), NT3 og GDNF kan producere pyramideformede neuroner i hippocampale og neokortikale kulturer.

Resultaterne af adskillige undersøgelser indikerer således, at stamceller fra forskellige hjernestrukturer under påvirkning af lokale specifikke vævsfaktorer for det første er i stand til at differentiere in vivo til neuronale fænotyper, der er iboende i disse strukturer. For det andet gør målrettet induceret differentiering af neurale stamceller in vitro ved hjælp af kloning af progenitorceller det muligt at opnå nerve- og gliaceller med specificerede fænotypiske egenskaber til intracerebral transplantation i forskellige former for hjernepatologi.

Der er ingen tvivl om, at pluripotente stamceller isoleret fra embryoner eller det voksne centralnervesystem kan betragtes som en kilde til nye neuroner og anvendes i klinikken til behandling af neurologisk patologi. Den største hindring for udviklingen af praktisk cellulær neurotransplantation er imidlertid, at de fleste neurale stamceller ikke differentierer til neuroner efter implantation i ikke-neurogene zoner i det modne centralnervesystem. For at omgå denne hindring foreslås en meget original innovativ metode, der muliggør in vitro-optagelse af en ren population af neuroner fra humane føtale neurale stamceller efter transplantation i centralnervesystemet hos en moden rotte. Forfatterne beviser, at differentieringen af celler implanteret ved denne metode ender med dannelsen af neuroner af den kolinerge fænotype, hvilket skyldes påvirkningen af faktorer i det omgivende mikromiljø. Den foreslåede teknologi er interessant med hensyn til at udvikle nye typer stamcellebaseret terapi og erstatte neuroner, der er beskadiget på grund af skade eller neurodegenerativ sygdom, da kolinerge neuroner spiller en ledende rolle i udviklingen af motoriske, hukommelses- og indlæringsfunktioner. Især kan kolinerge neuroner isoleret fra humane stamceller bruges til at erstatte motoriske neuroner, der er gået tabt ved amyotrofisk lateral sklerose eller rygmarvsskader. Der er i øjeblikket ingen information om metoder til at producere et betydeligt antal kolinerge neuroner fra en population af mitogen-prædannede stamceller. Forfatterne foreslår en forholdsvis simpel, men effektiv metode til at stimulere mitogen-prædannede primære humane embryonale neurale stamceller til at udvikle sig til stort set rene neuroner efter implantation i både ikke-neurogene og neurogene zoner i centralnervesystemet hos en moden rotte. Det vigtigste resultat af deres arbejde er omdannelsen af et tilstrækkeligt stort antal transplanterede celler til kolinerge neuroner, når de implanteres i den midterste membran og rygmarven.

Derudover foreslås det at anvende forskellige kombinationer af følgende trofiske faktorer og kemiske elementer til præformation af neurale stamceller fra den 8 uger gamle humane embryonale hjernebark til kolinerge neuroner in vitro: rekombinant basisk FGF, EGF, LIF, muse-aminoterminalt lydpeptid (Shh-N), trans-retinsyre, NGF, BDNF, NT3, NT4, naturlig laminin og museheparin. Den oprindelige linje af humane neurale stamceller (K048) blev opretholdt in vitro i to år og modstod 85 passager uden ændringer i proliferative og differentierende egenskaber, samtidig med at en normal diploid karyotype blev opretholdt. Udispergerede neurosfærer fra passagerne 19-55 (uge 38-52) blev udpladet på poly-d-lysin og laminin og derefter behandlet med de ovennævnte faktorer i forskellige koncentrationer, kombinationer og sekvenser. Kombinationen af basisk FGF, heparin og laminin (forkortet FHL) gav en unik effekt. Efter en dags dyrkning af embryonale neurale stamceller i FHL-medium med eller uden Shh-N (kombinationen af Shh-N + FHL i forkortelsen SFHL) observeredes en hurtig proliferation af store plane celler. Alle andre endagsprotokoller (såsom basisk FGF + laminin) førte derimod til en begrænset radial spredning af spindelformede celler, og disse celler forlod ikke kernen af neurosfærerne. Efter 6 dages aktivering og efterfølgende 10 dages differentiering i B27-holdigt medium blev store multipolære neuronlignende celler detekteret ved kanten af FHL-aktiverede sfærer. I andre protokolgrupper forblev de fleste neuronlignende celler små og bipolære eller unipolære. Immunocytokemisk analyse viste, at små (< 20 μm) bipolære eller unipolære celler enten var GABAerge eller glutamaterge, hvorimod de fleste store multipolære celler lokaliseret ved kanten af FHL-aktiverede neurosfærer var kolinerge og udtrykte markører, der er karakteristiske for kolinerge neuroner (Islet-1 og ChAT). Nogle af disse neuroner udtrykte samtidigt synapsin 1. Som et resultat af fem serier af uafhængige eksperimenter fandt forfatterne, at den samlede population af celler i enkeltlagszonerne differentierede til TuJ1+ neuroner med 45,5%, mens kolinerge (ChAT^) neuroner kun udgjorde 27,8% af cellerne i den samme population. Efter 10 dages yderligere differentiering in vitro blev der, udover kolinerge neuroner, fundet et betydeligt antal små neuroner i de FHL-aktiverede neurosfærer - glutamaterge (6,3%), GABA-erge (11,3%) samt astrocytter (35,2%) og nestin-positive celler (18,9%). Ved brug af andre kombinationer af vækstfaktorer var kolinerge neuroner fraværende, og neurosfærernes marginale celler dannede enten astrocytter eller små glutamaterge og GABA-erge neuroner. Overvågning af reserve- og aktive potentialer ved hjælp af helcelle-patch-clamp-teknikken viste, at efter syv dages FHL-aktivering havde de fleste store polypolære celler et hvilepotentiale på -29,0 ± 2,0 mV i fravær af aktionspotentiale. Efter 2 uger steg hvilepotentialet til -63.6 ± 3,0 mV, og aktionspotentialer blev observeret i det øjeblik, de depolariserende strømme blev induceret, og de blev blokeret af 1 M tetrodotoxin, hvilket indikerer den funktionelle aktivitet af kolinerge umodne neuroner.

Forfatterne fastslog endvidere, at FHL- eller SFHL-aktivering in vitro i sig selv ikke resulterer i dannelsen af modne neuroner, og forsøgte at fastslå, om FHL- eller SFHL-prædannede stamceller er i stand til at differentiere til kolinerge neuroner, når de transplanteres ind i CNS hos modne rotter. Til dette formål blev aktiverede celler injiceret i den neurogene zone (hippocampus) og i flere ikke-neurogene zoner, herunder den præfrontale cortex, midtermembranen og rygmarven hos voksne rotter. De implanterede celler blev sporet ved hjælp af CAO-^^p-vektoren. OCP er kendt for at mærke både cellulær ultrastruktur og cellulære processer (molekylært niveau) uden lækage og kan visualiseres direkte. Derudover opretholder OCP-mærkede neurale stamceller en profil af neuronal og glial differentiering, der er identisk med den for ikke-transformerede stamceller i den embryonale hjerne.

En til to uger efter implantation af 5 x 104 ^aktiverede og mærkede neurale stamceller blev de fundet i rygmarven eller hjernen hos rotter, med OCD+ celler primært placeret nær injektionsstedet. Migrations- og integrationsprocesser blev observeret så tidligt som en måned efter transplantation. Migrationsgrænserne varierede afhængigt af injektionsstedet: Ved injektion i den præfrontale cortex var OCD+ celler placeret 0,4-2 mm fra injektionsstedet, mens cellerne i tilfælde af implantation i den midterste membran, hippocampus eller rygmarven migrerede meget længere afstande - op til 1-2 cm. De transplanterede celler var lokaliseret i velorganiserede CNS-strukturer, herunder den frontale cortex, den midterste membran, hippocampus og rygmarven. OCD-mærkede neuronale elementer var synlige allerede i den første uge efter transplantation, og deres antal steg signifikant en måned efter operationen. Stereologisk analyse viste en højere overlevelsesrate for implanterede celler i forskellige strukturer i hjernen sammenlignet med rygmarven.

Det er kendt, at der i de fleste væv i den voksne pattedyrsorganisme bevares en population af regionale stamceller, hvis transformation til modne celler reguleres af specifikke vævsfaktorer. Proliferation af stamceller, differentiering af progenitorceller og dannelsen af neuronale fænotyper specifikke for en given hjernestruktur in vivo udtrykkes i langt højere grad i den embryonale hjerne, hvilket bestemmes af tilstedeværelsen af høje koncentrationer af morfogenetiske faktorer i det lokale mikromiljø - neurotrofinerne BDNF, NGF, NT3, NT4/5 og vækstfaktorerne FGF2, TGF-a, IGF1, GNDF, PDGF.

Hvor findes neurale stamceller?

Det er blevet fastslået, at neurale stamceller udtrykker glial surt fibrillært protein, som blandt modne celler i den neurale afstamning kun tilbageholdes på astrocytter. Derfor kan astrocytiske celler være stamcellereserven i det modne CNS. Faktisk blev neuroner, der stammer fra GFAP-positive precursorer, identificeret i lugtekolben og dentate gyrus, hvilket modsiger traditionelle ideer om progenitorrollen for radial glia, som ikke udtrykker GFAP i dentate gyrus i voksenalderen. Det er muligt, at der er to populationer af stamceller i CNS.

Spørgsmålet om lokaliseringen af stamceller i den subventrikulære zone forbliver også uklart. Ifølge nogle forfattere danner ependymceller sfæriske kloner i kultur, der ikke er ægte neurosfærer (som kloner af subependymceller), da de kun er i stand til at differentiere til astrocytter. På den anden side detekteres markøren efter fluorescens- eller viral mærkning af ependymceller i cellerne i det subependymale lag og olfaktoriske pærer. Sådanne mærkede celler danner in vitro neurosfærer og differentierer til neuroner, astrocytter og oligodendrocytter. Derudover er det blevet vist, at omkring 5% af cellerne i ependym udtrykker stammarkører - nestin, Notch-1 og Mussashi-1. Det antages, at mekanismen for asymmetrisk mitose er forbundet med den ujævne fordeling af membranreceptoren Notch-1, hvilket resulterer i, at sidstnævnte forbliver på membranen af dattercellen lokaliseret i den ependymale zone, mens modercellen, der migrerer til det subependymale lag, er berøvet denne receptor. Fra dette synspunkt kan den subependymale zone betragtes som en samler af progenitorforløbere for neuroner og glia dannet fra stamceller i det ependymale lag. Ifølge andre forfattere dannes kun gliaceller i de kaudale dele af den subventrikulære zone, og kilden til neurogenese er cellerne i den rostral-laterale del. I den tredje variant gives de forreste og bageste dele af den subventrikulære zone i de laterale ventrikler tilsvarende neurogent potentiale.

Den fjerde variant af organiseringen af stamreserven i centralnervesystemet synes at foretrække, ifølge hvilken der skelnes mellem tre hovedtyper af neurale progenitorceller i den subventrikulære zone - A, B og C. A-celler udtrykker tidlige neuronale markører (PSA-NCAM, TuJl) og er omgivet af B-celler, som identificeres som astrocytter ved ekspression af antigener. C-celler, der ikke har antigene karakteristika fra neuroner eller glia, har høj proliferativ aktivitet. Forfatteren har overbevisende bevist, at B-celler er forstadier til A-celler og de novo neuroner i olfaktoriske løger. Under migration er A-celler omgivet af strenge af neurale progenitorceller, hvilket adskiller sig væsentligt fra migrationsmekanismen for postmitotiske neuroblaster langs den radiale glia i den embryonale hjerne. Migrationen ender i olfaktoriske løger med mitotisk deling af både A- og B-celler, hvis derivater inkorporeres i de granulære cellelag og i det glomerulære lag af hjernens olfaktoriske zone.

Den udviklende embryonale hjerne mangler differentierede ependymale celler, og de ventrikelvægge indeholder prolifererende stamceller fra de ventrikulære germinale og subventrikulære zoner, hvor primære neuro- og glioblaster migrerer. Baseret på dette mener nogle forfattere, at den subependymale region af den modne hjerne indeholder reduceret embryonalt germinalt neuralt væv bestående af astrocytter, neuroblaster og uidentificerede celler. Ægte neurale stamceller udgør mindre end 1% af cellerne i den germinale zone af den laterale ventrikelvæg. Dels af denne grund, og også i forbindelse med dataene om, at astrocytter i den subependymale zone er forstadier til neurale stamceller, er muligheden for transdifferentiering af astrocytiske gliale elementer med erhvervelse af neuronale fænotypiske karakteristika ikke udelukket.

Den største hindring for en endelig løsning på problemet med lokalisering af neurale stamceller in vivo er manglen på specifikke markører for disse celler. Ikke desto mindre er rapporter om, at neurale stamceller blev isoleret fra CNS-regioner, der ikke indeholder subependymale zoner - den tredje og fjerde ventrikel i forhjernen, rygmarvskanalen i rygmarvens thorakale og lumbale områder - meget interessante fra et praktisk synspunkt. Af særlig betydning er det faktum, at rygmarvsskade øger proliferationen af ependymale stamceller i den centrale kanal med dannelsen af progenitorceller, der migrerer og differentierer til astrocytter i det gliomesodermale ar. Derudover blev der også fundet precursorceller af astro- og oligodendrocytter i den uskadede rygmarv hos voksne rotter.

Litteraturdataene demonstrerer således overbevisende tilstedeværelsen i CNS hos voksne pattedyr, inklusive mennesker, af en regional stamreserve, hvis regenerativ-plastiske kapacitet desværre kun er i stand til at sørge for processerne for fysiologisk regenerering med dannelsen af nye neuronale netværk, men ikke opfylder behovene for reparativ regenerering. Dette stiller opgaven med at søge efter muligheder for at øge CNS' stamressourcer ad eksogene veje, hvilket er uløseligt uden en klar forståelse af mekanismerne for CNS-dannelse i embryonalperioden.

I dag ved vi, at neuralrørsstamceller under embryonal udvikling er kilden til tre celletyper - neuroner, astrocytter og oligodendrocytter, dvs. neuroner og neuroglia stammer fra en enkelt precursorcelle. Differentiering af ektodermen til klynger af neurale progenitorceller begynder under påvirkning af produkterne fra de proneurale gener i bHLH-familien og blokeres af ekspressionen af receptor-transmembranproteinderivater af Notch-familiegener, hvilket begrænser bestemmelsen og den tidlige differentiering af neurale precursorceller. Til gengæld er Notch-receptorernes ligander transmembrane Delta-proteiner fra naboceller, på grund af hvis ekstracellulære domæne der udføres direkte intercellulære kontakter med induktiv interaktion mellem stamceller.

Den videre implementering af programmet for embryonal neurogenese er ikke mindre komplekst og bør tilsyneladende være artsspecifikt. Resultaterne af neuroxenotransplantationsstudier tyder dog på, at stamceller har en udtalt evolutionær konservatisme, hvilket betyder, at menneskelige neurale stamceller er i stand til at migrere og udvikle sig, når de transplanteres ind i rottehjernen.

Det er kendt, at pattedyrs centrale nervesystem har en ekstremt lav kapacitet til reparativ regenerering, hvilket er karakteriseret ved fraværet af tegn på fremkomsten af nye cellulære elementer i den modne hjerne til erstatning af neuroner, der er døde som følge af skade. I tilfælde af neuroblasttransplantation indpoder, prolifererer og differentierer sidstnævnte dog ikke kun, men er også i stand til at integrere sig i hjernestrukturer og funktionelt erstatte tabte neuroner. Ved transplantation af dedikerede neuronale progenitorceller var den terapeutiske effekt betydeligt svagere. Sådanne celler har vist sig at have en lav migrationskapacitet. Derudover reproducerer neuronale progenitorceller ikke arkitekturen af neurale netværk og er ikke funktionelt integreret i modtagerens hjerne. I denne henseende undersøges problemstillinger vedrørende reparativ-plastisk regenerering under transplantation af ikke-prædannede multipotente neurale stamceller aktivt.

I studiet af M. Aleksandrova et al. (2001) var modtagerne i den første version af forsøgene kønsmodne hunrotter, og donorerne var 15 dage gamle embryoner. En del af hjernens occipitale cortex blev fjernet fra modtagerne, og mekanisk suspenderet væv fra den formodede embryonale cortex indeholdende multipotente stamceller fra de ventrikulære og subventrikulære regioner blev transplanteret ind i hulrummet. I den anden version af forsøgene blev neurale stamceller fra et 9-ugers menneskeembryo transplanteret ind i hjernen hos kønsmodne rotter. Forfatterne isolerede vævsstykker fra den periventrikulære region af den embryonale hjerne, placerede dem i et F-12 næringsmedium og opnåede en cellesuspension ved gentagen pipettering, og dyrkede dem derefter i et specielt NPBM-medium med tilsætning af vækstfaktorer - FGF, EGF og NGF. Cellerne blev dyrket i en suspensionskultur, indtil der var dannet neurosfærer, som blev dispergeret og igen plantet i kulturen. Efter 4 passager med en samlet dyrkningsperiode på 12-16 dage blev cellerne anvendt til transplantation. Recipienterne var ti dage gamle rotteunger og kønsmodne to måneder gamle Wistar-rotter, hvortil 4 μl af den humane neurale stamcellesuspension blev injiceret i hjernens laterale ventrikel uden immundæmpning. Resultaterne af arbejdet viste, at dissocierede celler fra den ventrikulære og subventrikulære zone i den embryonale anlage af rottehjernebarken fortsatte deres udvikling under allotransplantation ind i den modne hjerne, dvs. faktorer fra mikromiljøet i den differentierede recipienthjerne ikke blokerede væksten og differentieringen af embryonets neurale stamceller. I de tidlige stadier efter transplantation fortsatte multipotente celler mitotisk deling og migrerede aktivt fra transplantationsområdet til recipientens hjernevæv. Transplanterede embryonale celler med et enormt migrationspotentiale blev fundet i næsten alle lag af recipientens hjernebark langs transplantationssporet og i den hvide substans. Længden af nervecellernes migrationskanal var altid signifikant kortere (op til 680 μm) end gliale elementers (op til 3 mm). Blodkar og fiberstrukturer i hjernen fungerede som strukturelle vektorer for astrocytmigration, hvilket også blev bemærket i andre undersøgelser.

Tidligere troede man, at akkumuleringen af mærkede astrocytter i det område, hvor modtagerens hjernebark var beskadiget, kunne være forbundet med dannelsen af en glialbarriere mellem transplantatets og modtagerens væv. En undersøgelse af strukturen af kompakt placerede celletransplantater viste imidlertid, at deres cytoarkitektur er karakteriseret ved kaos uden nogen lagdelt fordeling af transplanterede celler. Graden af orden i transplanterede neuroner nærmede sig den for normale hjernebarkceller kun i fravær af en glialbarriere mellem donorens og modtagerens væv. Ellers var strukturen af transplantatcellerne atypisk, og neuronerne selv var udsat for hypertrofi. Ved hjælp af neuroimmunokemisk typning af transplanterede celler blev der fundet hæmmende GABA-erge neuroner i transplantaterne, og ekspression af PARV-, CALB- og NPY-proteiner blev detekteret. Følgelig bevarer den modne hjerne mikromiljøfaktorer, der er i stand til at understøtte proliferation, migration og specifik differentiering af neurale multipotente celler.

I kulturen af humane stamceller isoleret fra den periventrikulære region af hjernen hos 9-ugers embryoner fandt M. Aleksandrova et al. (2001) et stort antal nestin-positive multipotente celler i den fjerde passage, hvoraf nogle allerede havde gennemgået in vitro-differentiering og udviklede sig i henhold til neuronal type, hvilket svarede til resultaterne af undersøgelser foretaget af andre forfattere. Efter transplantation i hjernen hos voksne rotter delte de dyrkede humane stamceller sig mitotisk og migrerede ind i vævet i den xenogene recipienthjerne. I celletransplantationerne observerede forfatterne to populationer af celler - små og større. Sidstnævnte migrerede både i parenkymet og langs fiberstrukturerne i recipienthjernen over ubetydelige afstande - inden for 300 μm. Den største udstrækning af migrationsvejen (op til 3 mm) var karakteristisk for små celler, hvoraf nogle differentierede til astrocytter, hvilket blev etableret ved hjælp af monoklonale antistoffer mod GFAP. Begge celletyper blev fundet i væggen af den laterale ventrikel, hvilket indikerer, at de transplanterede celler kom ind i den rostrale migrationskanal. Astrocytiske derivater af neurale stamceller fra både mennesker og rotter migrerede overvejende gennem blodkapillærerne og fiberstrukturerne i modtagerhjernen, hvilket stemmer overens med data fra andre forfattere.

Analyse af human stamcelledifferentiering in vivo ved hjælp af monoklonale antistoffer mod GFAP, CALB og VIM afslørede dannelsen af både astrocytter og neuroner. I modsætning til cellerne i rottetransplantationer var mange humane stamceller vimentin-positive. Følgelig gennemgik nogle af de humane multipotente celler ikke differentiering. De samme forfattere viste efterfølgende, at humane neurale stamceller transplanteret uden immundæmpning overlever i rottehjernen i 20 dage efter transplantation uden tegn på immunaggression fra gliale elementer i den modne hjerne.

Det er blevet fastslået, at selv neurale stamceller fra Drosophila indpodes og differentieres i hjernen hos en taxon, der er så fjern fra insekter som rotten. Rigtigheden af forfatternes eksperiment er uden tvivl: transgene Drosophila-linjer indeholdt gener for humane neurotrofiske faktorer NGF, GDNF, BDNF, indsat i CaSper-vektoren under Drosophila-varmechokpromotoren, således at pattedyrs kropstemperatur automatisk fremkaldte deres ekspression. Forfatterne identificerede Drosophila-celler ved produktet af det bakterielle galactosidase-gen ved hjælp af histokemisk X-Gal-farvning. Derudover viste det sig, at Drosophila-neurale stamceller specifikt reagerer på neurotrofiske faktorer kodet af humane gener: ved xenotransplantation af celler fra en transgen Drosophila-linje, der indeholder gdnf-genet, steg syntesen af tyrosinhydroxylase i dens differentierende neurale stamceller kraftigt, og celler med ngf-genet producerede aktivt acetylcholinesterase. Xenotransplantationen inducerede lignende genafhængige reaktioner i allotransplantationen af embryonalt nervevæv transplanteret sammen med den.

Betyder dette, at specifik differentiering af neurale stamceller induceres af arts-uspecifikke neurotrofiske faktorer? Ifølge forfatternes resultater havde de xenograftproducerende neurotrofiske faktorer en specifik effekt på allografternes skæbne, som i dette tilfælde udviklede sig mere intensivt og var 2-3 gange større i størrelse end allografter introduceret i hjernen uden tilsætning af xenografter. Følgelig har xenograftceller, der indeholder neurotrofingener, især genet, der koder for human glialcelle-afledt neurotrofisk faktor (GDNF), en arts-uspecifik effekt på allograftudvikling, der svarer til virkningen af den tilsvarende neurotrofin. GDNF er kendt for at øge overlevelsen af dopaminerge neuroner i rotteembryonale midterhjerne og forbedre dopaminmetabolismen i disse celler samt inducere differentiering af tyrosinhydroxylase-positive celler, hvilket forbedrer axonvæksten og øger størrelsen af den neuronale cellekrop. Lignende effekter observeres også i dyrkede dopaminerge neuroner i rotteembryonale midterhjerne.

Aktiv migration af humane neurale stamceller observeres efter xenotransplantation i hjernen hos modne rotter. Det er kendt, at processen med migration og differentiering af neurale stamceller styres af et sæt specielle gener. Det initierende migrationssignal til precursorcellen for at begynde differentieringen gives af proteinproduktet fra c-ret protoonkogenet sammen med GDNF. Det næste signal kommer fra mash-1-genet, som styrer valget af celleudviklingsvejen. Derudover afhænger den specifikke reaktion af differentierende celler også af α-receptoren for den ciliære neurotrofiske faktor. I betragtning af den fuldstændig forskellige genetiske sammensætning af xenogene humane neurale stamceller og modtagerrottehjerneceller er det derfor nødvendigt at anerkende ikke kun artsnonspecificiteten af neurotrofiske faktorer, men også den højeste evolutionære konservatisme hos de gener, der er ansvarlige for den specifikke differentiering af neurale stamelementer.

Fremtiden vil vise, om xenotransplantation af embryonalt neuromateriale vil være mulig i neurokirurgisk praksis til behandling af neurodegenerative patologiske processer forårsaget af forstyrrelse af myelinsyntesen af oligodendrocytter. I mellemtiden er de mest intensivt behandlede problemstillinger inden for neurotransplantation dem, der er relateret til udvinding af allogene neurale stamceller fra den embryonale eller modne hjerne i kultur med deres efterfølgende målrettede differentiering til neuroblaster eller specialiserede neuroner.

Transplantation af neurale stamceller

For at stimulere proliferation og differentiering af neurale stamceller i en voksen organisme kan embryonalt nervevæv transplanteres. Det er muligt, at stamcellerne fra det embryonale nervevæv, der er bragt ind med allograftet, selv kan gennemgå proliferation og differentiering. Det er kendt, at regenerering af nerveledere efter en rygmarvsskade sker gennem forlængelse af beskadigede axoner og kollateral spiring af axoner fra ubeskadigede processer i motorneuroner. De vigtigste faktorer, der forhindrer rygmarvsregenerering, er dannelsen af et bindevævsar i det skadede område, dystrofiske og degenerative forandringer i centrale neuroner, NGF-mangel og tilstedeværelsen af myelin-nedbrydningsprodukter i det skadede område. Det er blevet vist, at transplantation af forskellige celletyper ind i den beskadigede rygmarv - fragmenter af iskiasnerven hos voksne dyr, embryonal occipital cortex, hippocampus, rygmarv, Schwann-celler, astrocytter, mikroglia, makrofager, fibroblaster - fremmer regenerering af beskadigede axoner ved spiring og tillader nydannede axoner at vokse gennem rygmarvsskadezonen. Det er eksperimentelt bevist, at transplantation af embryonalt nervevæv ind i det skadede område på rygmarven, gennem virkningen af neurotrofiske faktorer, accelererer væksten af beskadigede axoner, forhindrer dannelsen af glialar og udviklingen af dystrofiske og degenerative processer i centrale neuroner, mens cellerne i det transplanterede embryonale nervevæv overlever i rygmarven, integrerer med tilstødende væv og fremmer axonvækst gennem det skadede område med dannelsen af dendritiske synapser på spinale neuroner.

Dette område inden for regenerativ-plastisk medicin har oplevet den største udvikling i Ukraine takket være arbejdet udført af det videnskabelige team ledet af V.I. Tsymbalyuk. Først og fremmest er der tale om eksperimentelle undersøgelser af effektiviteten af transplantation af embryonal nervevæv ved rygmarvsskader. Under autotransplantation af den perifere nerve observerede forfatterne de mest udtalte destruktive ændringer i den distale suturzone, hvor de på den 30. dag efter operationen blev kombineret med reparative processer. Under allotransplantation var den implanterede nerves morfofunktionelle tilstand på den 30. dag karakteriseret ved udtalt destruktion med fedtdegeneration og amyloidose på baggrund af fokal inflammatorisk lymfoidcelleinfiltration med overvejende atrofi af Schwann-celler. Transplantation af embryonalt nervevæv bidrog i højere grad til genoprettelsen af rygmarvens ledningsevne, især hos dyr, der blev opereret i løbet af de første 24 timer efter skaden: på baggrund af et fald i intensiteten af inflammatoriske og destruktive processer, hypertrofi og hyperplasi af proteinsyntetiserende og energiproducerende ultrastrukturelle elementer i spinale neuroner, blev hypertrofi og hyperplasi af oligodendrocytter observeret, amplituden af muskelaktionspotentialet blev genoprettet med 50% og impulsledningshastigheden med 90%. Ved vurdering af effektiviteten af transplantation af embryonalt nervevæv afhængigt af transplantationszonen blev det konstateret, at de bedste resultater blev observeret, når transplantatet blev introduceret direkte i rygmarvsskadezonen. Ved fuldstændig transektion af rygmarven var transplantation af embryonalt nervevæv ineffektiv. Dynamiske undersøgelser har vist, at det optimale tidspunkt for udførelse af transplantation af embryonalt nervevæv er de første 24 timer efter rygmarvsskade, mens udførelse af kirurgi i perioden med udtalte sekundære iskæmisk-inflammatoriske forandringer, der opstår på 2.-9. dag efter skaden, bør betragtes som upassende.

Det er kendt, at alvorlig traumatisk hjerneskade fremkalder en kraftig og langvarig aktivering af lipidperoxidation i de indledende og mellemliggende stadier af den posttraumatiske periode, både i det beskadigede hjernevæv og i kroppen som helhed, og forstyrrer også energimetabolismen i den skadede hjerne. Under disse forhold fremmer transplantation af embryonalt nervevæv til området med den traumatiske skade stabiliseringen af lipidperoxidationsprocesser og øger potentialet i hjernens og kroppens antioxidantsystem som helhed, hvilket forbedrer dets antiradikalbeskyttelse på den 35.-60. dag i den posttraumatiske periode. I samme periode efter transplantation af embryonalt nervevæv normaliseres energimetabolismen og de oxidative fosforyleringsprocesser i hjernen. Derudover er det blevet vist, at impedansen i vævet i den skadede hemisfære falder med 30-37% på den første dag efter eksperimentel traumatisk hjerneskade, og med 20% på den kontralaterale hemisfære, hvilket indikerer udvikling af generaliseret hjerneødem. Hos dyr, der havde fået transplanteret embryonalt nervevæv, forekom ødeminvolutionen betydeligt hurtigere - allerede på den syvende dag nåede den gennemsnitlige impedansværdi for vævet i den beskadigede hemisfære 97,8% af kontrolniveauet. Desuden blev fuldstændig genoprettelse af impedansværdierne på den 30. dag kun observeret hos dyr, der havde fået transplanteret embryonalt nervevæv.

Død af nogle neuroner i hjernen efter en alvorlig kraniocerebral skade er en af hovedårsagerne til posttraumatiske komplikationer. Neuroner i de integrerende dopaminerge og noradrenerge systemer i mellemhjernen og medulla oblongata er særligt følsomme over for skader. Et fald i dopaminniveauet i striopallidalkomplekset og hjernebarken øger risikoen for at udvikle motoriske forstyrrelser og psykiske lidelser, epileptiforme tilstande, og et fald i dopaminproduktionen i hypothalamus kan være årsagen til adskillige vegetative og somatiske lidelser observeret i den sene posttraumatiske periode. Resultaterne af undersøgelser udført i eksperimentel kraniocerebral skade indikerer, at transplantation af embryonalt nervevæv hjælper med at genoprette dopaminniveauer i den skadede hjernehalvdel, dopamin og noradrenalin i hypothalamus og øge noradrenalin- og dopaminniveauer i mellemhjernen og medulla oblongata. Derudover normaliseres procentdelen af fosfolipider, og indholdet af fedtsyrer stiger (C16:0, C17:0, C17:1, C18:0, C18:1 + C18:2, C20:3 + C20:4, C20:5), som følge af transplantation af embryonalt nervevæv i den beskadigede hjernehalvdel hos forsøgsdyr.

Disse data bekræfter stimuleringen af regenerativ-plastiske processer af transplanteret embryonalt nervevæv og indikerer transplantationens reparativ-trofiske effekt på modtagerens hjerne som helhed.

Den kliniske erfaring hos personalet på AP Romodanov Institut for Neurokirurgi ved Academy of Medical Sciences i Ukraine med transplantation af embryonalt nervevæv ved cerebral parese, en ekstremt kompleks patologi med alvorlig motorisk dysfunktion, fortjener særlig opmærksomhed. Kliniske former for cerebral parese afhænger af graden af skade på de integrerede strukturer, der er ansvarlige for reguleringen af muskeltonus og dannelsen af motoriske stereotyper. Der er i øjeblikket tilstrækkelig evidens til at understøtte, at patologiske ændringer i det striopallidale-thalamokortikale motoriske kontrolsystem spiller en vigtig rolle i motorisk funktion og muskeltonusforstyrrelser. Den striopallidale forbindelse i dette system udfører kontrolfunktionen gennem nigrostriatal dopaminproduktion. Den direkte vej til implementering af thalamokortikal kontrol begynder fra neuronerne i putamen, medieres af gamma-aminosmørsyre (GABA) og substans P og projiceres direkte ind i motorzonen i det indre segment af globus pallidus og substantia nigra. Den indirekte ledningsvej, hvis effekt realiseres ved deltagelse af GABA og enkephalin, stammer fra neuroner i putamen og påvirker kernerne i basalganglierne gennem en række forbindelser, herunder det eksterne segment af globus pallidus og nucleus subthalamus. Forstyrrelser i ledningsevnen i den direkte ledningsvej forårsager hypokinesi, mens et fald i ledningsevnen i strukturerne i den indirekte ledningsvej fører til hyperkinesi med tilsvarende ændringer i muskeltonus. Integriteten af GABAerge ledningsveje på forskellige niveauer i det motoriske kontrolsystem og integrationen af dopaminerge forbindelser på putamenniveau er afgørende for reguleringen af thalamokortikale interaktioner. Den mest almindelige manifestation af motorisk patologi i forskellige former for cerebral parese er en krænkelse af muskeltonus og en nært beslægtet ændring i refleksmuskelaktivitet.

Transplantation af embryonalt nervevæv ved cerebral parese kræver en grundig analyse af arten af skader på hjernestrukturer. Baseret på bestemmelse af dopamin- og GABA-niveauer i den subarachnoide cerebrospinalvæske, beskrev forfatterne niveauet af forstyrrelse af integrationen af funktionelle hjernestrukturer, hvilket gjorde det muligt at objektivisere resultaterne af kirurgisk indgreb og korrigere gentagne neurotransplantationer. Embryonalt nervevæv (abortmateriale fra et 9-ugers embryo) blev transplanteret ind i parenkymet af cortexen i de præcentrale konvolutioner i hjernehalvdelene afhængigt af sværhedsgraden af atrofiske forandringer. Der blev ikke observeret komplikationer eller forværring af patienternes tilstand i den postoperative periode. Positiv dynamik blev observeret hos 63% af patienterne med spastiske former, hos 82% af børnene med en atonisk-æstetisk form og kun hos 24% af patienterne med en blandet form af sygdommen. En negativ effekt af et højt niveau af neurosensibilisering med tilstedeværelsen af autoantistoffer mod neurospecifikke proteiner på operationens resultater blev fastslået. Transplantation af embryonalt nervevæv viste sig at være ineffektivt hos patienter i alderen 8-10 år og derover, såvel som i tilfælde af alvorligt hyperkinetisk syndrom og epilepsi. Klinisk set manifesteredes effektiviteten af transplantation af embryonalt nervevæv hos patienter med spastiske former for cerebral parese ved dannelsen af nye statomotoriske færdigheder og frivillige bevægelser med korrektion af den patologiske motoriske stereotype og et fald i graden af spasticitet, patologiske stillinger og attituder. Forfatterne mener, at den positive effekt af transplantation af embryonalt nervevæv er et resultat af den normaliserende effekt på den funktionelle aktivitet af de supraspinale strukturer, der er involveret i reguleringen af postural tonus og frivillige bevægelser. Samtidig ledsages de positive kliniske effekter af transplantation af embryonalt nervevæv af et fald i indholdet af neurotransmittere i den subarachnoide cerebrospinalvæske, hvilket indikerer genoprettelsen af integrerede interaktioner mellem de berørte hjernestrukturer.

Der er en anden alvorlig form for neurologisk patologi - apallisk syndrom, hvis behandlingsproblem desværre langt fra er løst. Apallisk syndrom er en polyetiologisk subakut eller kronisk tilstand, der opstår som følge af alvorlige organiske læsioner i centralnervesystemet (primært hjernebarken) og er karakteriseret ved udvikling af panapraksi og panagnosi med relativt bevaret funktion af segmental-stamsektionerne og formationer af hjernens limbisk-retikulære kompleks. Opfølgningsstudier (fra 1 år til 3 år) har vist, at apallisk syndrom ikke er en endelig diagnose af vedvarende skade på nervesystemet hos børn, men omdannes enten til organisk demens eller til en kronisk vegetativ tilstand. På afdelingen for restaurerende neurokirurgi ved AP Romodanov Institut for Neurokirurgi ved Ukraines Akademi for Medicinske Videnskaber gennemgik 21 patienter med konsekvenser af apallisk syndrom transplantation af embryonalt nervevæv. Under generel anæstesi blev der anvendt en kronebor til at lave et borehul over området med de mest udtalte atrofiske forandringer, der blev afsløret ved computertomografi eller magnetisk resonansbilleddannelse, og i tilfælde af diffus atrofi af den grå eller hvide substans blev transplantatet indført i hjernens præcentrale og centrale gyri. Efter åbning af dura mater blev vævsstykker fra den sensorimotoriske cortex fra 8-9 uger gamle embryoner implanteret intrakortikalt ved hjælp af en speciel anordning. Antallet af implanterede vævsprøver varierede fra 4 til 10, hvilket blev bestemt af borehullets størrelse og størrelsen af lokale forandringer i hjernens substans. I modsætning til andre typer patologi søgte forfatterne ved apallisk syndrom at implantere så meget embryonalt væv som muligt i de mest tilgængelige områder af hjernen. Dura mater blev syet, og der blev udført plastikkirurgi af kraniedefekten. Under operationen viste alle patienter signifikante ændringer i både cortex (atrofi, fravær af foldninger, ændring i farve og pulsering af hjernevæsenet) og meninges (fortykkelse af dura mater, signifikant fortykkelse af arachnoideamembranen med tilstedeværelsen af egne blodkar, fusion af membranerne med den underliggende hjernevæsen). Disse ændringer var mere udtalte hos patienter med en historie med inflammatoriske hjernelæsioner. Hos patienter, der havde gennemgået CNS-hypoksi, dominerede diffuse atrofiske ændringer i hjernevæsenet, især i cortex, med en forøgelse af subarachnoidearummet, uden signifikante ændringer i meninges. Halvdelen af patienterne havde øget blødning i blødt væv, knogler og hjernevæsen. Efter operationerne, inden for seks måneder til tre år, forbedredes tilstanden hos 16 patienter og forblev uændret hos fem patienter. Positiv dynamik blev observeret i både den motoriske og mentale sfære. Muskeltonus faldt hos ti patienter, hos 11 patienter steg den motoriske aktivitet (nedsat parese,(forbedrede koordinationen af bevægelser), steg de øvre lemmer betydeligt hos fem børn. Hos fire patienter faldt hyppigheden og sværhedsgraden af epileptiske anfald, og hos ét barn var der slet ingen anfald i hele observationsperioden efter operationen. Aggressionen faldt hos to børn, hos to patienter med alvorlige bulbære lidelser forbedredes synkeevnen, og to børn var i stand til at tygge selvstændigt allerede 2 uger efter operationen. Der blev observeret et fald i sværhedsgraden af psykiske lidelser, ni børn blev roligere efter operationen, søvn og opmærksomhed forbedredes hos syv patienter. Tre patienter med konsekvenserne af apallisk syndrom begyndte at genkende deres forældre, én - at følge instruktioner, to - at udtale ord, og hos tre faldt graden af dysartri. Forfatterne bemærker, at en mærkbar forbedring af patienternes tilstand begynder 2 måneder efter operationen, når et maksimum efter 5-6 måneder, hvorefter forbedringshastigheden aftager, og ved årets udgang stabiliserer processen sig hos 50% af patienterne. Den positive effekt af neurotransplantation dannede grundlag for en gentagen operation hos seks patienter med konsekvenserne af apallisk syndrom, men på den anden hjernehalvdel. Teknikken og metoderne ved den anden transplantation var identiske med dem ved den første operation, men den kliniske effekt af den anden operation var lavere, selvom der ikke opstod alvorlige komplikationer efter hverken det første eller det andet kirurgiske indgreb. Ifølge forfatterne er mekanismen bag den terapeutiske effekt af neurotransplantation forbundet med den neurotrofiske effekt af det transplanterede embryonale nervevæv, som indeholder et stort antal vækst-, hormon- og andre biologisk aktive stoffer, der stimulerer reparationen af beskadigede neuroner og plastisk reorganisering af modtagerens hjernevæv. En aktiverende effekt på aktiviteten af nerveceller, der tidligere var morfologisk bevaret, men som mistede deres funktionelle aktivitet på grund af sygdommen, er også mulig. Det er den hurtige neurotrofiske effekt, der kan forklare forbedringen af bulbærfunktioner hos nogle børn allerede ved udgangen af den første eller anden uge efter operationen. Det antages, at derudover etableres morfofunktionelle forbindelser mellem transplantatet og værtshjernen inden den tredje eller fjerde måned, hvorigennem neurotransplantatet erstatter funktionerne af døde hjerneceller, som er substratet for forbedring af både patienternes motoriske og mentale funktioner. To børn var i stand til at tygge selvstændigt allerede 2 uger efter operationen. Der blev observeret et fald i sværhedsgraden af psykiske lidelser, ni børn blev roligere efter operationen, søvn og opmærksomhed forbedredes hos syv patienter. Tre patienter med konsekvenser af apallisk syndrom begyndte at genkende deres forældre, én - at følge instruktioner, to - at udtale ord,Hos tre faldt graden af dysartri. Forfatterne bemærker, at en mærkbar forbedring af patienternes tilstand begynder 2 måneder efter operationen, når et maksimum efter 5-6 måneder, hvorefter forbedringshastigheden aftager, og ved årets udgang stabiliserer processen sig hos 50% af patienterne. Den positive effekt af neurotransplantation dannede grundlag for en gentagen operation hos seks patienter med konsekvenserne af apallisk syndrom, men på den anden hjernehalvdel. Teknikken og metoden ved den anden transplantation var identisk med den første operation, men den kliniske effekt af den anden operation var lavere, selvom der ikke var alvorlige komplikationer efter hverken det første eller det andet kirurgiske indgreb. Ifølge forfatterne er mekanismen bag den terapeutiske effekt af neurotransplantation forbundet med den neurotrofiske effekt af det transplanterede embryonale nervevæv, som indeholder et stort antal vækst-, hormon- og andre biologisk aktive stoffer, der stimulerer reparationen af beskadigede neuroner og plastisk reorganisering af modtagerens hjernevæv. En aktiverende effekt på aktiviteten af nerveceller, der tidligere var morfologisk bevarede, men som mistede deres funktionelle aktivitet på grund af sygdommen, er også mulig. Det er netop den hurtige neurotrofiske effekt, der kan forklare forbedringen af bulbære funktioner hos nogle børn allerede ved udgangen af den første eller anden uge efter operationen. Det antages, at der samtidig inden den tredje eller fjerde måned etableres morfofunktionelle forbindelser mellem transplantatet og værtshjernen, hvorigennem neurotransplantatet erstatter funktionerne af døde hjerneceller, som er substratet for forbedring af både patienternes motoriske og mentale funktioner. To børn var i stand til at tygge selvstændigt allerede 2 uger efter operationen. Der blev observeret et fald i sværhedsgraden af psykiske lidelser, ni børn blev roligere efter operationen, søvn og opmærksomhed forbedredes hos syv patienter. Tre patienter med konsekvenserne af apallisk syndrom begyndte at genkende deres forældre, én - at følge instruktioner, to - at udtale ord, hos tre faldt graden af dysartri. Forfatterne bemærker, at en mærkbar forbedring af patienternes tilstand begynder 2 måneder efter operationen, når et maksimum efter 5-6 måneder, hvorefter forbedringshastigheden aftager, og ved årets udgang stabiliserer processen sig hos 50% af patienterne. Den positive effekt af neurotransplantation dannede grundlag for en gentagen operation hos seks patienter med konsekvenserne af apallisk syndrom, men på den anden hjernehalvdel. Teknikken og metoden ved den anden transplantation var identisk med den første operation, men den kliniske effekt af den anden operation var lavere, selvom der ikke var alvorlige komplikationer efter hverken det første eller det andet kirurgiske indgreb. Ifølge forfatterne,Mekanismen bag den terapeutiske effekt af neurotransplantation er forbundet med den neurotrofiske effekt af det transplanterede embryonale nervevæv, som indeholder et stort antal vækst-, hormon- og andre biologisk aktive stoffer, der stimulerer reparationen af beskadigede neuroner og plastisk reorganisering af modtagerens hjernevæv. En aktiverende effekt på aktiviteten af nerveceller, der tidligere var morfologisk bevarede, men som mistede deres funktionelle aktivitet på grund af sygdommen, er også mulig. Det er netop den hurtige neurotrofiske effekt, der kan forklare forbedringen af bulbære funktioner hos nogle børn allerede ved udgangen af den første eller anden uge efter operationen. Det antages, at der samtidig med dette etableres morfofunktionelle forbindelser mellem transplantatet og værtshjernen inden den tredje eller fjerde måned, hvorigennem neurotransplantationen erstatter funktionerne af døde hjerneceller, som er substratet for forbedring af både motoriske og mentale funktioner hos patienter, selvom der ikke opstod alvorlige komplikationer efter hverken det første eller det andet kirurgiske indgreb. Ifølge forfatterne er mekanismen bag den terapeutiske effekt af neurotransplantation forbundet med den neurotrofiske effekt af det transplanterede embryonale nervevæv, som indeholder et stort antal vækst-, hormon- og andre biologisk aktive stoffer, der stimulerer reparationen af beskadigede neuroner og den plastiske reorganisering af modtagerens hjernevæv. En aktiverende effekt på aktiviteten af nerveceller, der tidligere var morfologisk bevarede, men som mistede deres funktionelle aktivitet på grund af sygdommen, er også mulig. Det er netop den hurtige neurotrofiske effekt, der kan forklare forbedringen af bulbære funktioner hos nogle børn allerede ved udgangen af den første eller anden uge efter operationen. Det antages, at der samtidig i den tredje eller fjerde måned etableres morfofunktionelle forbindelser mellem transplantatet og værtshjernen, hvorigennem neurotransplantationen erstatter funktionerne af døde hjerneceller, som er substratet for forbedring af både patienternes motoriske og mentale funktioner, selvom der ikke opstod alvorlige komplikationer efter hverken det første eller det andet kirurgiske indgreb. Ifølge forfatterne er mekanismen bag den terapeutiske effekt af neurotransplantation forbundet med den neurotrofiske effekt af det transplanterede embryonale nervevæv, som indeholder et stort antal vækst-, hormonelle og andre biologisk aktive stoffer, der stimulerer reparationen af beskadigede neuroner og den plastiske reorganisering af modtagerens hjernevæv. En aktiverende effekt på aktiviteten af nerveceller, der tidligere var morfologisk bevarede, men som mistede deres funktionelle aktivitet på grund af sygdommen, er også mulig.Det er netop den hurtige neurotrofiske effekt, der kan forklare forbedringen af bulbærfunktioner hos nogle børn allerede ved udgangen af den første eller anden uge efter operationen. Det antages, at der samtidig inden den tredje eller fjerde måned etableres morfofunktionelle forbindelser mellem transplantatet og værtshjernen, hvorigennem neurotransplantatet erstatter funktionerne af døde hjerneceller, som er substratet for forbedring af både patienternes motoriske og mentale funktioner.

Effekten af transplantation af embryonalt nervevæv på reorganiseringen af interneuronale forbindelser blev undersøgt eksperimentelt. Forfatterne studerede mønstrene for genoprettelse af intermodulære axonale forbindelser i området med mekanisk skade på hjernebarken hos hvide rotter med og uden transplantation af embryonalt nervevæv ved hjælp af den fluorescerende lipofile mærkning DIL (1,1-dioctadecyl-3,3,33'-tetramethylindocarbocyaninperchlorat) og konfokal laserscanning. Det blev konstateret, at introduktionen af embryonalt nervevæv i det beskadigede område sikrer væksten af axoner, som efter at have passeret gennem transplantatet forbinder sig med det tilstødende hjernevæv, hvorimod det beskadigede område uden transplantation af embryonalt nervevæv er en uoverstigelig hindring for voksende axoner. I dette arbejde blev transplantation af embryonal (15.-17. drægtighedsdag) neocortex udført. De resultater, som forfatterne opnåede, er yderligere bevis for den aktive indflydelse af transplantation af embryonalt nervevæv på den posttraumatiske reorganisering af interneuronale relationer mellem tilstødende strukturelle og funktionelle moduler i hjernebarken. Transplantation af embryonalt nervevæv giver delvis genoprettelse af forbindelser mellem beskadigede områder af hjernebarken ved at skabe gunstige betingelser for axonvækst i virkningszonen for transplantatets neurotrofiske faktorer. Eksistensen af en sådan effekt er blevet bevist eksperimentelt og diskuteres i litteraturen som bevis for høj plastisk kapacitet i den beskadigede hjerne hos kønsmodne dyr. I denne henseende betragtes celletransplantation i øjeblikket som en optimal terapeutisk strategi til genoprettelse af funktionen af det beskadigede menneskelige centralnervesystem.

De data, som forfatterne har indsamlet om effektiviteten af at bruge embryonalt nervevæv i hjernen som et eksogent transplantationsmedium til axonvækst, bekræfter udsigterne til målrettet oprettelse af kommunikationsforbindelser mellem intakte, tilstødende områder af hjernen. Arbejdet med at studere effekten af transplantation af nervevæv på dynamikken i centralnervesystemets funktionelle parametre synes relevant. Arbejdets opgave var at undersøge effekten af transplantation af det embryonale locus coeruleus (LC) på de morfofunktionelle indekser for LC-neuroner og recipienternes lokomotoriske aktivitet. Recipienterne var hun-Wistar-rotter, og donorerne var 18 dage gamle embryoner fra rotter af samme linje. Transplantation af embryonalt LC blev udført i hulrummet i hjernens tredje ventrikel. Histologisk blev der påvist engraftment af transplantatet hos 75% af recipientdyrene. I tilfælde af engraftment var transplantatet tilstødende ventrikelvæggen og fyldte 1/5-2/5 af dets lumen, og det var levedygtigt. 1 og 6 måneder efter operationen repræsenterede det transplanterede nervevæv, ifølge dets morfologiske karakteristika, strukturer, der ville være opstået under deres normale ontogenetiske udvikling, dvs. LC-strukturer. De data, som forfatterne har opnået, indikerer, at hos dyr, hvortil den embryonale LC-anlage blev transplanteret, ændres den dynamiske aktivitet, og matrixaktiviteten af kromatinet i LC-cellekernerne øges. Følgelig intensiveres aktiviteten af neuroner i deres egen LC, men det indpodede transplantat er også funktionelt aktivt. Det er kendt, at den såkaldte lokomotoriske region af mellemhjernen praktisk talt falder sammen med lokaliseringen af LC. Forfatterne mener, at grundlaget for ændringen i den motoriske aktivitet hos recipientrotter er aktiveringen af LC-celler, både deres egne og transplantatet, med frigivelsen af en stor mængde noradrenalin, inklusive i rygmarvssegmenterne. Det antages således, at stigningen i motorisk aktivitet under LC-transplantationsbetingelser ind i dyrs intakte hjerne skyldes tilstedeværelsen af et funktionelt aktivt transplantat integreret med recipientens hjerne og bidrager til aktiveringen af den lokomotoriske aktivitet hos rotter.

Derudover blev det vist, at transplanterede neuroepitelceller fra de embryonale rudimenter af neocortex og rygmarv overlever og differentierer til neuroblaster, unge og modne neuroner, inden for 1-2 måneder efter deres transplantation ind i den beskadigede iskiasnerve hos modne rotter. Ved undersøgelse af dynamikken i udviklingen af NADPH-positive neuroner i de embryonale rudimenter af neocortex og rygmarv hos rotter i heterotopiske allografter (15-dages rotteembryo) blev der påvist engraftment af 70 til 80% af neurotransplantaterne på langsgående snit gennem iskiasnerverne hos recipientrotter, hvilket afhang af observationsperioden. Uni- og bipolære neuroblaster med afrundede lyse kerner og en eller to nukleoler begyndte at dannes i transplantaterne en uge efter operationen, hvilket blev ledsaget af dannelsen af klynger. Forfatterne kunne ikke detektere celler indeholdende NADPH-diaforase (NADPH-d) blandt neuroblaster. Efter 7 dage var kun cellulære elementer i blodkarrene NADPH-positive - kapillære endotelceller i transplantatets tykkelse, såvel som endotel- og glatte muskelceller i recipientens iskiasnervekar. Da induktionen af NO-syntase (NOS) i vaskulære glatte muskelceller sker under påvirkning af IL-1, forbinder forfatterne forekomsten af NADPH-positive glatte muskelceller i iskiasnervens blodkar med tilstedeværelsen af IL-1 syntetiseret i beskadigede nervestammer. Det er kendt, at neurogenese under transplantationsbetingelser af embryonale hjernerudimenter sker synkront med udviklingen af neuroner in situ. Resultaterne af morfologiske undersøgelser indikerer, at differentieringen af nogle neurale elementer i transplantaterne syv dage efter transplantation svarer til differentieringen af celler i lignende dele af hjernen hos nyfødte rotter. Under heterotoptransplantation ind i den perifere nerve udviser de transplanterede embryonale nerveceller således evnen til at syntetisere NADPH-d. I dette tilfælde findes der flere neuroner indeholdende NADPH-d i rygmarvstransplantationer end i neocortex-transplantationer, men syntesen af nitrogenoxid begynder i de transplanterede neuroner senere end under in situ-udviklingen. I hvirveldyrs centrale nervesystem optræder NOS-positive celler allerede i prænatalperioden. Det antages, at NO fremmer dannelsen af synaptiske forbindelser i den udviklende hjerne, og tilstedeværelsen af NOS-positive nerveafferente fibre, der sørger for NO-syntese i cerebellare neuroblaster, stimulerer migrationen og differentieringen af neuroner, hvorved der dannes normal hjernecytoarkitektur. En vigtig rolle for NO i synapsogenese er blevet fastslået i tektum - kun de neuroner, der havde synaptiske forbindelser med nethindeceller, viste sig at være NOS-positive.

Det er kendt, at nitrogenoxid er en af regulatorerne af hjerneaktivitet, hvor det dannes fra arginin under påvirkning af NO-syntase, som har diaforaseaktivitet. I centralnervesystemet syntetiseres NO i endotelceller i blodkar, mikroglia, astrocytter og neuroner i forskellige dele af hjernen. Efter traumatisk hjerneskade, såvel som under hypoxi og iskæmi, observeres en stigning i antallet af neuroner, der indeholder NO, som er en af regulatorerne af cerebral blodgennemstrømning. I betragtning af NO's evne til at inducere synapsogenese er studiet af dannelsen af NO-holdige celler under neurotransplantationsforhold på baggrund af traumatisk skade på modtagerens nervevæv af særlig interesse.

Ikke mindre vigtigt er studiet af effekten af neurotransplantation på den betingede refleksstereotype af adfærd. I eksperimenter, der undersøger effekten af intracerebral og fjern (mellem CII og CIII) transplantation af embryonalt locus coeruleus-væv (17-19 dages drægtighed) på hukommelsesprocesser og katekolaminindhold hos rotter med ødelæggelse af den frontotemporale neocortex, blev det vist, at elektrolytisk skade på hjernens frontotemporale cortex forstyrrer stereotypen af den betingede refleksfølelsesmæssige undgåelsesreaktion (hukommelse), svækker fysiologisk aktivitet, reducerer indholdet af noradrenalin i zonen med koaguleret neocortex, men øger dets niveau i hypothalamus, hvor der observeres et fald i adrenalinkoncentrationen, selvom dens mængde i blodet og binyrerne stiger.

Som følge af intracerebral transplantation af embryonalt locus coeruleus-væv genoprettes stereotypen af den betingede refleks-følelsesmæssige undgåelsesreaktion, forstyrret af elektrolytisk skade på de frontotemporale områder af hjernebarken, hos 81,4% af dyrene, indholdet af adrenalin i den retikulære formation af mellemhjernen, hypothalamus og neocortex normaliseres, og dets niveau i hippocampus stiger endda, hvilket kombineres med et fald i koncentrationen af adrenalin i blodet.

Fjerntransplantation af embryonalt locus coeruleus-væv genopretter ikke blot den forstyrrede stereotype af den betingede refleks-følelsesmæssige undgåelsesreaktion hos rotter med elektrolytisk skade på den frontotemporale cortex, men øger også indholdet af noradrenalin og adrenalin, primært i hypothalamus, blod, binyrer og hjerte. Det antages, at dette skyldes vaskularisering af transplantatet, penetration af neurotransmittere i blodbanen, deres passage gennem blod-hjerne-barrieren og aktivering af mekanismerne til genoptagelse af adrenalin og noradrenalin ved optagelsestyperne 1, 2, 3. Forfatterne mener, at langsigtet stabilisering af noradrenalinniveauet under transplantatets indlejrings- og funktionsbetingelser kan betragtes som et fænomen med dets progressive frigivelse i minimale doser fra neuroner i locus coeruleus.

Positive kliniske effekter af transplantation af embryonal nervevæv kan også skyldes sidstnævntes evne til at påvirke processerne i vaskulær neoplasma, i hvis regulering vækstfaktorer og cytokiner er direkte involveret. Vaskulogenese aktiveres af angiogene vækstfaktorer - vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF), FGF, PDGF og TGF, som syntetiseres under iskæmi, hvilket fungerer som det initierende øjeblik for angiogenese. Det er blevet bevist, at udtømningen af det vaskulære vækstpotentiale sker under kroppens aldringsproces, hvilket spiller en betydelig rolle i patogenesen af sygdomme som koronar hjertesygdom og udslettende åreforkalkning i underekstremiteterne. Vævsiskæmi udvikler sig også i mange andre sygdomme. Indførelsen af angiogene faktorer i iskæmiske zoner (terapeutisk angiogenese) stimulerer væksten af blodkar i iskæmisk væv og forbedrer mikrocirkulationen på grund af udviklingen af kollateral cirkulation, hvilket igen øger den funktionelle aktivitet af det berørte organ.

VEGF og FGF betragtes som de mest lovende til klinisk brug. Resultaterne af de første randomiserede studier var opmuntrende, især hvis de optimale doseringer og administrationsmetoder af angiogene faktorer blev valgt korrekt. I denne henseende blev der udført en eksperimentel vurdering af den angiogene aktivitet af et ekstrakt isoleret fra humant embryonalt hjernevæv. Arbejdet anvendte aborteret materiale opnået i den tyvende graviditetsuge og behandlet i henhold til metoden fra I. Maciog et al. (1979) som modificeret af IC ANRF. Dette lægemiddel er en analog af "Endotelcellevæksttilskud" ("Sigma") og er en naturlig blanding af humane angiogene faktorer, som inkluderer VEGF og FGF. Forsøgene blev udført på rotter med modeller af iskæmi i bagben og myokardievæv. Baseret på undersøgelsen af alkalisk fosfataseaktivitet hos forsøgsdyr, der fik ekstrakt af embryonalt nervevæv, blev der fundet en stigning i antallet af kapillærer pr. arealenhed af myokardiet - både i længde- og tværsnit af hjertet. Præparatets angiogene aktivitet manifesterede sig ved direkte administration i den iskæmiske zone, såvel som i tilfælde af systemisk (intramuskulær) administration, hvilket førte til et fald i det gennemsnitlige areal af arret efter infarktet.

I enhver variant af transplantation af embryonalt nervevæv er det ekstremt vigtigt at vælge den korrekte gestationsalder for det transplanterede embryonale materiale. En sammenlignende analyse af effektiviteten af cellepræparater fra det embryonale ventrale mesencephalon fra 8-, 14- og 16-17-dages rotteembryoner tre måneder efter intrastriatal neurotransplantation til modne rotter med parkinsonisme i den automatiserede test af apomorfin-induceret motorisk asymmetri afslørede en signifikant højere effektivitet af CNS-cellepræparater fra 8-dages embryoner og den laveste effektivitet fra 16-17-dages embryonalt nervevæv. De opnåede data korrelerede med resultaterne af den histomorfologiske analyse, især med transplantaternes størrelse, sværhedsgraden af glialreaktionen og antallet af dopaminerge neuroner i dem.

Forskelle i den terapeutiske effekt af embryonale nervevævsceller kan være forbundet med både graden af umodenhed og engagement hos cellerne selv og deres forskellige reaktioner på vækstfaktorer frigivet i området med induceret skade på dopaminerge neuroner. Især effekten af EGF og FGF2 på udviklingen af telencefale neurale stamceller in vivo forekommer på forskellige stadier af embryogenesen. Neuroepitelceller fra 8,5 dage gamle musefostre prolifererer, når de dyrkes in vitro i et serumfrit medium, i nærvær af FGF2, men ikke EGF, som kun populationer af stamceller isoleret fra hjernen hos embryoner på senere udviklingsstadier reagerer på. Samtidig prolifererer neurale stamceller som reaktion på hvert af disse mitogener og forstærker additivt væksten i tilfælde af tilsætning af EGF og FGF2 til en kultur med en lav cellesåningstæthed. EGF-reaktive neurale stamceller fra germinalzonerne i 14,5 dage gamle museembryoner betragtes som lineære efterkommere af FGF-reaktive neurale stamceller, der først optræder efter 8,5 dages drægtighed. Den potentielle fænotype af neurale stam- og progenitorceller afhænger af den komplekse effekt af deres mikromiljø. Immunfænotypning af neurale celler fra de periventrikulære og hippocampale zoner i 8-12 og 17-20 uger gamle humane embryoner ved hjælp af flowcytofluorometri afslørede signifikant variation forbundet med både gestationsalder og individuelle konstitutionelle træk ved donorbiomaterialet. Når disse neurale progenitorceller dyrkes i et selektivt serumfrit medium med EGF, FGF2 og NGF, dannes neurosfærer med en hastighed, der signifikant afhænger af gestationsalder. Celler fra forskellige dele af hjernen fra 5-13 uger gamle humane embryoner opretholder, når de kortvarigt dyrkes med FGF2 i monolagskultur på et lamininsubstrat i nærvær af spormængder af vækstfaktorer, proliferation i 6 uger med en høj procentdel af nestin-positive celler på baggrund af spontan dannelse af celler med markører for alle tre linjer af neural differentiering. Celler isoleret fra mesencephalonen af et humant embryo i en drægtighedsperiode på over 13 uger prolifererer under påvirkning af EGF og danner også neurosfærer. En synergistisk effekt blev opnået ved at anvende en kombination af EGF og FGF2. Den mest intense proliferation af neurale stamceller med dannelse af neurosfærer observeres ved dyrkning af hjernebarkvævet fra 6-8 uger gamle humane embryoner i nærvær af EGF2, IGF1 og 5% hesteserum på et substrat med fibronektin.

Det skal bemærkes, at spørgsmålene vedrørende gestationsalder og den del af det embryonale centralnervesystem, hvis væv foretrækkes at anvendes til neurotransplantation, forbliver åbne. Svarene på disse bør søges i neurogenesen af den udviklende hjerne, som fortsætter gennem hele prænatalperioden - på et tidspunkt, hvor neuralrørets epitel danner en flerlagsstruktur. Det menes, at kilden til stamceller og nye neuroner er radial glia, der består af aflange celler med lange udløbere, der er radialt rettet i forhold til hjerneblærernes væg og i kontakt med den indre overflade af ventriklerne og den ydre pialoverflade af hjernevæggen. Tidligere var radial glia kun udstyret med funktionen af en neuronal kanal, langs hvilken neuroblaster migrerer fra den ventrale region til de overfladiske sektioner, og den blev også tildelt en skeletrolle i processen med at danne den korrekte laminære organisering af cortex. I dag er det blevet fastslået, at radial glia, efterhånden som udviklingen skrider frem, transdifferentierer til astrocytter. En betydelig del af det hos pattedyr reduceres umiddelbart efter fødslen, men hos de dyrearter, hvor radial glia bevares indtil voksenalderen, forekommer neurogenese aktivt i den postnatale periode.

I kultur dannede radiale gliaceller fra den embryonale neocortex hos gnavere neuroner og gliaceller, hvor neuroner overvejende blev dannet i den 14. til 16. gestationsalder af embryoudviklingen (perioden med maksimal intensitet af neurogenese i hjernebarken hos mus og rotter). På den 18. dag af embryogenesen skiftede differentieringen mod dannelsen af astrocytter med et signifikant fald i antallet af nydannede neuroner. In situ-mærkning af radiale gliaceller med GFP gjorde det muligt at detektere asymmetrisk deling af mærkede celler i hulrummet af hjernevesiklerne hos 15- til 16 dage gamle rotteembryoner med fremkomsten af datterceller med immunologiske og elektrofysiologiske karakteristika af neuroblaster. Det er bemærkelsesværdigt, at ifølge resultaterne af dynamiske observationer bruger de nye neuroblaster modercellen til radiale gliaceller til migration til den pialoverflade.

Den endogene markør for radial glia er det intermediære filamentprotein nestin. Ved hjælp af metoden med fluorescerende flowsortering af celler mærket med en retrovirus associeret med GFP og udtrykt under kontrol af nestin, blev det vist, at stamceller fra gyrus dentatus og hilus i den humane hippocampus (materialet blev opnået under operationer for epilepsi) udtrykker nestin. Derfor tilhører de den radiale glia, som hos mennesker, ligesom hos andre pattedyr, kun er bevaret i gyrus dentatus.

Samtidig bestemmes effektiviteten af celletransplantation ikke kun af donorcellernes høje levedygtighed, deres differentieringspotentiale og evne til at erstatte defekte celler, men først og fremmest af deres målrettede migration. Fuld funktionel integration af transplanterede celler afhænger af deres migrationsevne - uden at forstyrre cytoarkitekturen i recipientens hjerne. Da radial glia undergår næsten fuldstændig reduktion i den postnatale periode, var det nødvendigt at finde ud af, hvordan donorceller kan bevæge sig fra transplantationszonen til stedet for hjerneskade hos voksne recipienter. Der er to varianter af cellemigration til CNS, der ikke afhænger af radial glia: fænomenet tangentiel migration eller bevægelsen af neuroblaster under udviklingen af hjernebarken vinkelret på det radiale glia-netværk, samt migration "i en række" eller "langs en kæde". Især migrationen af neurale progenitorceller fra den rostrale subventrikulære zone til den olfaktoriske pære forekommer som en sekvens af tæt tilstødende celler omgivet af gliaceller. Det menes, at disse celler bruger partnerceller som migrationssubstrat, og den primære regulator af sådanne intercellulære interaktioner er PSA-NCAM (polysialyleret neuralt celleadhæsionsmolekyle). Derfor kræver neuronal migration ikke nødvendigvis deltagelse af radial glia eller præeksisterende axonale forbindelser. Den ekstraradiale form for cellebevægelse i en "streng" langs den rostrale migrationskanal opretholdes gennem hele livet, hvilket indikerer en reel mulighed for målrettet levering af transplanterede neurale progenitorceller til det modne nervesystem.

Der er en hypotese om tilstedeværelsen af en stamcellelinje i hjernens ontogenese, ifølge hvilken stamcellen i de tidlige stadier af hjernens udvikling er en neuroepitelcelle, som, når den modnes, transdifferentierer til radial glia. I voksenalderen udføres stamcellernes rolle af celler, der har astrocytters karakteristika. Trods en række kontroversielle punkter (modsætninger vedrørende hippocampus' stamceller, såvel som dybe dele af hjernen, der ikke har en lagdelt cortex og udvikler sig fra thalamusknolderne, hvor radial glia er fraværende), ser et klart og enkelt koncept om en konstant ændring i stamcellernes fænotype gennem hele ontogenesen meget attraktivt ud.

Indflydelsen af mikromiljøfaktorer på bestemmelsen og den efterfølgende differentiering af neurale differentierede celler er blevet tydeligt demonstreret ved transplantation af modne rotterygmarvsstamceller til forskellige regioner af det modne nervesystem. Når stamceller blev transplanteret ind i gyrus dentatus eller ind i regionen med neuronal migration i lugtekolben, blev der observeret aktiv migration af transplanterede celler med dannelsen af talrige neuroner. Transplantation af stamceller ind i rygmarven og Ammons horn-regionen resulterede i dannelsen af astrocytter og oligodendrocytter, hvorimod transplantation ind i gyrus dentatus resulterede i dannelsen af ikke kun gliaceller, men også neuroner.

Hos en voksen rotte kan antallet af delende celler i gyrus dentatus nå flere tusinde om dagen - mindre end 1% af det samlede antal granulaceller. Neuroner udgør 50-90% af cellerne, astocytter og andre gliaelementer - omkring 15%. De resterende celler har ikke antigene træk fra neuroner og glia, men indeholder endotelcelleantigener, hvilket indikerer en tæt sammenhæng mellem neurogenese og angiogenese i gyrus dentatus. Tilhængere af muligheden for differentiering af endotelceller til neuronale precursorceller henviser til endotelcellers evne til at syntetisere BDNF in vitro.

Hastigheden af selv-samling af neurale kredsløb er imponerende: Under differentiering migrerer granulacellernes forstadieceller til dentate gyrus og danner processer, der vokser mod SAZ-zonen i Ammons horn og danner synapser med pyramideformede glutamaterge og interkalære inhiberende neuroner. Nyoprettede granulaceller integreres i eksisterende neurale kredsløb inden for 2 uger, og de første synapser optræder så tidligt som 4-6 dage efter fremkomsten af nye celler. Ved hyppig administration af BrdU eller 3H-thymidin (en af metoderne til identifikation af voksne stamceller) til modne dyr blev et stort antal mærkede neuroner og astrocytter fundet i Ammons horn, hvilket indikerer muligheden for at danne nye neuroner ikke kun i dentate gyrus, men også i andre dele af hippocampus. Interessen for processerne for deling, differentiering og celledød i dentate gyrus i hippocampus i den modne hjerne skyldes også, at de neuroner, der dannes her, er lokaliseret i et af nøgleområderne i hippocampus, der er ansvarlig for lærings- og hukommelsesprocesser.

Det er således i dag blevet fastslået, at neurale progenitorceller stammer fra cellerne i den subependymale zone i den laterale ventrikel hos modne gnavere. De migrerer langs den rostrale migrationskanal, der dannes af longitudinelt orienterede astrogliale celler, til lugtekolben, hvor de er indlejret i granulacellelaget og differentierer til neuroner med denne struktur. Migration af neurale progenitorceller er blevet påvist i den rostrale migrationskanal hos voksne aber, hvilket indikerer muligheden for dannelse af nye neuroner i primaters lugtekolbe. Neurale stamceller er blevet isoleret fra lugtekolben hos et voksent menneske og overført til linjer, hvis klonede celler differentierer til neuroner, astrocytter og oligodendrocytter. Stamceller er blevet fundet i hippocampus i den modne hjerne hos rotter, mus, aber og mennesker. Neurale stamceller fra den subgranulære zone af dentate fascia er en kilde til progenitorceller, der migrerer til de mediale og laterale lemmer af hippocampus, hvor de differentierer til modne granulaceller og gliale elementer. Axoner fra de novo-dannede neuroner i dentate fascia kan spores tilbage til CA3-feltet, hvilket indikerer deltagelse af nydannede neuroner i implementeringen af hippocampale funktioner. I associationsområderne i neocortex hos voksne aber blev der fundet neuronale progenitorceller, der migrerede fra den subventrikulære zone. I lag VI af neocortex i musehjernen detekteres nye pyramideformede neuroner 2-28 uger efter induceret skade og død af native neuroner i dette lag på grund af migrationen af tidligere sovende progenitorceller i den subventrikulære zone. Endelig fremgår realiteten af postnatal neurogenese i den menneskelige hjerne af en dobbelt stigning i antallet af kortikale neuroner, hvilket fortsætter i de første 6 år efter fødslen.

Af ikke ringe betydning for praktisk celletransplantation er spørgsmålet om regulering af reproduktions- og differentieringsprocesserne for neurale stam- og progenitorceller. De vigtigste faktorer, der undertrykker proliferationen af neurale progenitorceller, er glukokortikoider, som kraftigt reducerer antallet af delinger, mens fjernelse af binyrerne derimod øger antallet af mitoser betydeligt (Gould, 1996). Det er bemærkelsesværdigt, at morfogenesen af dentate gyrus hos gnavere er mest intens i de første to uger af postnatal udvikling i perioden med fravær af reaktion på stress på baggrund af et kraftigt fald i produktionen og sekretionen af steroidhormoner i binyrebarken. Kortikosteroider hæmmer migrationen af granulaceller - nye neuroner er ikke indlejret i det granulære lag af dentate gyrus, men forbliver i hilus. Det antages, at processerne for dannelse af synaptiske forbindelser forstyrres samtidig. Beskyttelsen af celler mod en sådan "steroidaggression" udføres ved minimal ekspression af mineralokortikoid- og glukokortikoidreceptorer på prolifererende granulaceller, ikke kun under udviklingen af dentate gyrus, men også hos modne dyr. Af alle hjernens neuroner er det dog neuronerne i hippocampus, der er karakteriseret ved det højeste indhold af glukokortikoidreceptorer, hvilket forårsager stresseffekten på hippocampus. Psykoemotionel stress og stressfulde situationer hæmmer neurogenesen, og kronisk stress reducerer kraftigt dyrenes evne til at tilegne sig nye færdigheder og lære. En mere udtalt negativ effekt af kronisk stress på neurogenesen er ret forståelig, hvis vi tager højde for den overvejende sovende tilstand af neurale stamceller. Ved immobilisering af drægtige rotter (for gnavere - en ekstremt stærk stressfaktor) blev det konstateret, at prænatal stress også forårsager et fald i antallet af celler i dentate gyrus og hæmmer neurogenesen signifikant. Det er kendt, at glukokortikoider deltager i patogenesen af depressive tilstande, hvis morfologiske ækvivalent er hæmning af neurogenese, patologisk reorganisering af neuroner og interneuronale forbindelser samt død af nerveceller. På den anden side aktiverer antidepressive kemoterapimidler dannelsen af neuroner de novo, hvilket bekræfter forbindelsen mellem processerne for dannelse af nye neuroner i hippocampus og udviklingen af depression. Østrogener har en signifikant effekt på neurogenese, hvis virkninger er modsatrettede af glukokortikosteroiders virkning og består i at understøtte proliferationen og levedygtigheden af neurale stamceller. Det skal bemærkes, at østrogener øger dyrenes indlæringsevne betydeligt. Nogle forfattere forbinder cykliske ændringer i antallet af granulaceller og deres overskydende antal hos hunner med østrogeners indflydelse.

Det er kendt, at neurogenese styres af EGF, FGF og BDNF, men mekanismerne bag effekten af eksterne signaler på stamceller fra mitogener og vækstfaktorer er ikke blevet tilstrækkeligt undersøgt. Det er blevet fastslået, at PDGF in vitro opretholder den neuronale retning af differentiering af progenitorceller, og ciliær neurotrofisk faktor (CNTF), ligesom triiodothyronin, stimulerer dannelsen af overvejende gliale elementer - astrocytter og oligodendrocytter. Hypofyseadenylatcyklaseaktiverende protein (PACAP) og vasoaktivt intestinalt peptid (VIP) aktiverer proliferationen af neurale progenitorceller, men hæmmer samtidig differentieringsprocesserne af datterceller. Opioider, især i tilfælde af deres langvarige eksponering, hæmmer neurogenese signifikant. Opioidreceptorer er dog ikke blevet identificeret i stamceller og neurale progenitorceller i dentate gyrus (de er til stede i differentierende neuroner i den embryonale periode), hvilket ikke giver os mulighed for at vurdere de direkte virkninger af opioider.

Behovene inden for praktisk regenerativ-plastisk medicin har tvunget forskere til at være særligt opmærksomme på studiet af pluri- og multipotens af stamceller. Implementeringen af disse egenskaber på niveauet af regionale stamceller i en voksen organisme kan i fremtiden sikre produktionen af det nødvendige transplantationsmateriale. Det blev vist ovenfor, at epigenetisk stimulering af neurale stamceller muliggør opnåelse af prolifererende celler, der allerede er prædannet i henhold til neurale fænotyper, hvilket begrænser deres antal. I tilfælde af anvendelse af de totipotente egenskaber ved en embryonal stamcelle sker proliferation, indtil et tilstrækkeligt antal celler er opnået, tidligere end neural differentiering, og de multiplicerede celler omdannes let til en neural fænotype. For at opnå neurale stamceller isoleres ESC'er fra blastocystens indre cellemasse og dyrkes i den obligatoriske tilstedeværelse af LIF, hvilket bevarer deres totipotens og evnen til ubegrænset deling. Derefter induceres neural differentiering af ESC'er ved hjælp af retinsyre. Transplantation af de resulterende neurale stamceller ind i striatum beskadiget af quinolin og 6-hydroxydopamin ledsages af deres differentiering til dopaminerge og serotonerge neuroner. Efter injektion i ventriklerne i rotteembryonale hjerner migrerer de ESC-afledte neurale progenitorceller til forskellige områder af recipienthjernen, herunder cortex, striatum, septum, thalamus, hypothalamus og cerebellum. De celler, der forbliver i ventrikelhulrummet, danner epitelstrukturer, der ligner et neuralrør, samt individuelle øer af ikke-neuralt væv. I recipientembryonets hjerneparenkym producerer de transplanterede celler nervesystemets tre hovedcelletyper. Nogle af dem har aflange apikale dendritter, pyramideformede cellelegemer og basale axoner, der rager ind i corpus callosum. Astrocytter af donoroprindelse forlænger udløbere til nærliggende kapillærer, og oligodendrocytter er i tæt kontakt med myelinmuffer og deltager i dannelsen af myelin. Således er neurale progenitorceller opnået fra ESC'er in vitro i stand til rettet migration og regional differentiering, der er tilstrækkelig til mikro-miljømæssige signaler, hvilket forsyner mange områder af den udviklende hjerne med neuroner og glia.

Nogle forfattere overvejer muligheden for de- og transdifferentiering af regionale stamceller fra en voksen organisme. Indirekte bekræftelse af cellededifferentiering i kultur med udvidelse af deres potentialer gives af data om indpodning af neurale stamceller fra mus i den røde knoglemarv med efterfølgende udvikling af cellelinjer fra dem, hvilket giver funktionelt aktive celler fra det perifere blod. Derudover førte transplantation af genetisk mærkede (LacZ) neurosfæreceller opnået fra den modne eller embryonale hjerne ind i hjernen hos bestrålede mus med undertrykt hæmatopoiese ikke kun til dannelsen af neurale derivater fra stamceller, men forårsagede også generering af blodlegemer, hvilket indikerer pluripotensen af neurale stamceller, realiseret uden for hjernen. Således er en neural stamcelle i stand til at differentiere til blodlegemer under påvirkning af signaler fra knoglemarvsmikromiljøet med en indledende transformation til en hæmatopoietisk stamcelle. På den anden side blev deres differentiering under påvirkning af hjernevævets mikromiljø til glia- og neurale celler etableret ved transplantation af hæmatopoietiske stamceller fra knoglemarv ind i hjernen. Derfor er neurale og hæmatopoietiske stamcellers differentieringspotentiale ikke begrænset af vævsspecificitet. Med andre ord er faktorer i det lokale mikromiljø, der er forskellige fra dem, der er karakteristiske for hjerne- og knoglemarvsvæv, i stand til at ændre differentieringsretningen for disse celler. Det blev vist, at neurale stamceller introduceret i det venøse system hos bestrålede mus skaber populationer af myeloide, lymfoide og umodne hæmatopoietiske celler i milten og knoglemarven. In vitro blev effekten af knoglemarvsmorfogenetiske proteiner (BMP'er) på overlevelse og differentiering af neurale stamceller fastslået, hvilket, ligesom i de tidlige stadier af embryogenesen, bestemte deres udvikling i neurale eller gliale retninger. I neurale stamcellekulturer fra 16 dage gamle rotteembryoner inducerer BMP'er dannelsen af neuroner og astroglia, hvorimod der i stamcellekulturer afledt af perinatal hjerne kun dannes astrocytter. Derudover undertrykker BMP'er dannelsen af oligodendrocytter, som kun optræder in vitro med tilsætning af BMP-antagonisten noggin.

Transdifferentieringsprocesser er artsuspecifikke: humane hæmatopoietiske stamceller fra knoglemarv transplanteret ind i striatum hos modne rotter migrerer til den hvide substans i den ydre kapsel, ipsi- og kontralaterale neocortex, hvor de danner astrocytlignende cellulære elementer (Azizi et al., 1998). Når knoglemarvsstamceller allotransplanteres ind i den laterale ventrikel hos nyfødte mus, kan migrationen af hæmatopoietiske stamceller spores til strukturerne i forhjernen og lillehjernen. I striatum og det molekylære lag af hippocampus transformeres de migrerede celler til astrocytter, og i lugtekolben, det indre granulcellelag af lillehjernen og den retikulære dannelse af hjernestammen danner de neuronlignende celler med en positiv reaktion på neurofilamenter. Efter intravenøs administration af hæmatopoietiske celler til voksne mus blev GFP-mærkede mikro- og astrocytter detekteret i neocortex, thalamus, hjernestamme og lillehjernen.

Derudover kan mesenkymale stamceller fra knoglemarv, som giver anledning til alle typer bindevævsceller, også undergå neural transdifferentiering under visse betingelser (husk at den embryonale kilde til mesenkym er neurale kamceller). Det er blevet vist, at humane og museknoglemarvsstromale celler dyrket in vitro i nærvær af EGF eller BDNF udtrykker markøren for neurale progenitorceller nestin, og tilsætning af forskellige kombinationer af vækstfaktorer fører til dannelsen af celler med markører for glia (GFAP) og neuroner (nukleart protein, NeuN). Mærkede syngene mesenkymale stamceller transplanteret i den laterale ventrikel af hjernen hos nyfødte mus migrerer og lokaliserer sig i forhjernen og lillehjernen uden at forstyrre cytoarkitekturen i modtagerhjernen. Mesenkymale stamceller fra knoglemarv differentierer til modne astrocytter i striatum og det molekylære lag af hippocampus og befolker lugtekolben, granulære lag af lillehjernen og retikulær dannelse, hvor de transformeres til neuroner. Humane mesenkymale stamceller fra knoglemarv er i stand til at differentiere til makroglia in vitro og integreres i rottehjernestrukturer efter transplantation. Direkte transplantation af mesenkymale stamceller fra knoglemarv ind i hippocampus hos voksne rotter ledsages også af deres migration ind i hjerneparenkym og neuroglial differentiering.

Det antages, at transplantation af knoglemarvsstamceller kan udvide mulighederne for celleterapi af CNS-sygdomme, der er karakteriseret ved overdreven patologisk neurondød. Det skal dog bemærkes, at ikke alle forskere anerkender den gensidige transformation af neurale og hæmatopoietiske stamceller, især in vivo, hvilket igen skyldes manglen på en pålidelig markør til vurdering af deres transdifferentiering og videre udvikling.

Stamcelletransplantation åbner nye horisonter for cellulær genterapi af arvelig neurologisk patologi. Genetisk modifikation af neurale stamceller involverer indsættelse af genetiske regulatoriske konstruktioner, hvis produkter interagerer med cellecyklusproteiner i den automatiske reguleringstilstand. Transduktion af sådanne gener i embryonale progenitorceller bruges til at formere neurale stamceller. De fleste genetisk modificerede cellekloner opfører sig som stabile cellelinjer og viser ingen tegn på transformation in vivo eller in vitro, men har en udtalt evne til kontakthæmning af proliferation. Ved transplantation integreres de formerede transfekterede celler i modtagervævet uden at forstyrre cytoarkitekturen og uden at undergå tumortransformation. Donor neurale stamceller deformerer ikke integrationszonen og konkurrerer ligeligt om plads med værtens progenitorceller. På 2.-3. dag falder delingsintensiteten af transfektantceller dog kraftigt, hvilket svarer til kontakthæmning af deres proliferation in vitro. Embryoner-recipienter af neurale stamtransfektanter har ingen abnormiteter i udviklingen af centralnervesystemet, alle områder af hjernen i kontakt med transplantatet udvikler sig normalt. Efter transplantation migrerer kloner af neurale stamceller hurtigt fra injektionszonen og går ofte ud over de tilsvarende embryonale zoner langs den rostrale trakt, hvor de integreres tilstrækkeligt med andre områder af hjernen. Integrationen af genetisk modificerede kloner og transficerede cellelinjer af neurale stamceller i værtsorganismens hjerne er ikke kun karakteristisk for den embryonale periode: disse celler implanteres i adskillige områder af centralnervesystemet hos fosteret, nyfødte, voksne og endda aldrende recipientorganismer og demonstrerer evnen til tilstrækkelig integration og differentiering. Især efter transplantation i hjernens ventrikulære hulrum migrerer transficerede celler uden at beskadige blod-hjerne-barrieren og bliver integrerede funktionelle cellulære komponenter i hjernevævet. Donorneuroner danner passende synapser og udtrykker specifikke ionkanaler. Med blod-hjerne-barrierens integritet bevaret, udvider astroglia, et derivat af transfektante neurale stamceller, processer til cerebrale kar, og donor-afledte oligodendrocytter udtrykker myelinbasisk protein og myeliniserer neuronale processer.

Derudover transficeres neurale stamceller til brug som cellulære vektorer. Sådanne vektorgenetiske konstruktioner giver in vivo stabil ekspression af fremmede gener involveret i udviklingen af nervesystemet, eller bruges til at korrigere eksisterende genetiske defekter, da produkterne af disse gener er i stand til at kompensere for forskellige biokemiske abnormiteter i centralnervesystemet. Høj migrationsaktivitet af transficerede stamceller og tilstrækkelig implantation i germinalzonerne i forskellige områder af den udviklende hjerne giver os håb om fuldstændig genoprettelse af arvelig mangel på cellulære enzymer. Ved modellering af ataksi-telangiektasi-syndrom (mutante muselinjer pg og pcd) forsvinder Purkinje-celler fra lillehjernen hos forsøgsdyr i løbet af de første uger af postnatal udvikling. Det er blevet vist, at introduktionen af neurale stamceller i hjernen hos sådanne dyr ledsages af deres differentiering til Purkinje-celler og granulære neuroner. Hos pcd-mutanter korrigeres bevægelseskoordinationsforstyrrelser delvist, og tremorintensiteten reduceres. Lignende resultater blev opnået ved transplantation af klonede humane neurale stamceller til primater, hvor Purkinje-celledegeneration blev induceret ved hjælp af onconase. Efter transplantation blev donor-neurale stamceller fundet i de granulære, molekylære og Purkinje-cellelag i cerebellarparenkym. Derfor kan genetisk modifikation af neurale progenitorceller give en stabil, engageret modifikation af fænotypen, der er resistent over for ydre påvirkninger. Dette er især vigtigt i patologiske processer forbundet med udviklingen af faktorer hos recipienten, der forhindrer overlevelse og differentiering af donorceller (f.eks. under immunaggression).

Mukopolysakkaridose type VII hos mennesker er karakteriseret ved neurodegeneration og progressiv intellektuel funktionsnedsættelse, hvilket er modelleret hos mus ved en deletionsmutation i beta-glucuronidase-genet. Efter transplantation af transficerede neurale stamceller, der udskiller beta-glucuronidase, ind i hjerneventriklerne hos nyfødte, defekte recipientmus, findes donorcellerne først i den terminale zone og spredes derefter gennem hjerneparenkymet, hvilket stabilt korrigerer lysosomernes integritet i hjernen hos mutante mus. I en model af Tay-Sachs sygdom giver retrovirus-transducerede neurale stamceller, når de administreres in utero til musefostre og transplanteres til nyfødte mus, effektiv ekspression af beta-underenheden af beta-hexosaminidase hos recipienter med en mutation, der fører til patologisk akkumulering af beta2-gangliosid.

En anden retning inden for regenerativ medicin er stimulering af patientens egne neurale stamcellers proliferative og differentierende potentiale. Især udskiller neurale stamceller NT-3 under rygmarvshemisektion og hjerneasfyksi hos rotter, udtrykker NGF og BDNF i septum og basalganglier, tyrosinhydroxylaser i striatum, samt reelin i lillehjernen og myelinbasisk protein i hjernen.

Imidlertid får spørgsmålene om stimulering af neurogenese tydeligvis ikke tilstrækkelig opmærksomhed. Nogle få undersøgelser tyder på, at den funktionelle belastning af de nervecentre, der er ansvarlige for at skelne lugte, afspejles i dannelsen af nye neuroner. Hos transgene mus med et underskud af neuronale adhæsionsmolekyler blev et fald i intensiteten af neurogenese og et fald i antallet af neuroner, der migrerer til lugtekolben, kombineret med en forringelse af evnen til at skelne lugte, selvom tærsklen for lugtopfattelse og korttids-olfaktorisk hukommelse ikke var forringet. Den funktionelle tilstand af cellerne i gyrus dentatus spiller en vigtig rolle i reguleringen af neurogenese: en svækkelse af glutamats effekt på granulaceller efter ødelæggelsen af entorhinal cortex fremmer proliferation og differentiering af neuroner, og stimulering af fibrene i den perforante pathway (den primære afferente input til hippocampus) forårsager hæmning af neurogenese. NMDA-receptorantagonister aktiverer processerne for dannelse af nye neuroner, mens agonister derimod reducerer intensiteten af neurogenese, hvilket i realiteten ligner virkningen af glukokortikosteroider. Modstridende forskningsresultater findes i litteraturen: Information om den eksperimentelt beviste hæmmende effekt af den excitatoriske neurotransmitter glutamat på neurogenese er inkonsistent med data om stimulering af proliferation af progenitorceller og fremkomsten af nye neuroner med en stigning i anfaldsaktivitet i hippocampus hos dyr med eksperimentelle kain- og pilocarpinmodeller af epilepsi. Samtidig øges intensiteten af neurogenese i den traditionelle model af epilepsi forårsaget af multipel subtærskelstimulering af et bestemt område af hjernen (kindling) og karakteriseret ved mindre udtalt neurondød, kun i den sene fase af kindling, når der observeres skade og død af neuroner i hippocampus. Det er blevet vist, at anfaldsaktivitet ved epilepsi stimulerer neurogenese med unormal lokalisering af nye granulære neuroner, hvoraf mange ikke kun forekommer i dentate gyrus, men også i hilus. Sådanne neuroner er af stor betydning for udviklingen af mosfiberspiring, da deres axoner danner normalt fraværende omvendte kollateraler, der danner talrige synapser med tilstødende granulære celler.

Brugen af regionale neurale stamceller åbner nye muligheder for anvendelsen af celletransplantation i behandlingen af metaboliske og genetiske neurodegenerative sygdomme, demyeliniserende sygdomme og posttraumatiske lidelser i centralnervesystemet. Før udførelse af erstatningscelletransplantation i henhold til en af metoderne, udføres udvælgelse og ekspansion af den nødvendige type neurale progenitorceller ex vivo med det formål at introducere dem direkte i det beskadigede område af hjernen. Den terapeutiske effekt skyldes i dette tilfælde udskiftning af beskadigede celler eller lokal frigivelse af vækstfaktorer og cytokiner. Denne metode til regenerativ-plastisk terapi kræver transplantation af et tilstrækkeligt stort antal celler med forudbestemte funktionelle egenskaber.

Yderligere undersøgelser af de molekylære egenskaber og det regenerativ-plastiske potentiale hos modne hjernestamceller, samt evnen hos regionale stamceller af forskellig vævsoprindelse til at transdifferentiere, bør også anses for passende. I dag er screening af antigener fra hæmatopoietiske stamceller i knoglemarven allerede blevet udført med bestemmelse af en markørkombination af celler, der er i stand til at transdifferentiere til neurale stamprogenitorceller (CD 133+, 5E12+, CD34-, CD45-, CD24). Der er opnået celler, der danner neurosfærer in vitro og danner neuroner, når de transplanteres i hjernen hos nyfødte immundefekte mus. Af interesse for cellulær xenotransplantologi er resultaterne af undersøgelser af muligheden for krydstransplantation af stamceller hos individer af evolutionært fjerne taxa. Resultaterne af neural stamcelleimplantation i hjernetumorområdet forbliver uden korrekt fortolkning: transplanterede celler migrerer aktivt gennem tumorvolumenet uden at overskride dets grænser, og når celler introduceres i den intakte del af hjernen, observeres deres aktive migration mod tumoren. Spørgsmålet om den biologiske betydning af en sådan migration forbliver åbent.

Det skal bemærkes, at vellykket transplantation af neurale stamceller, såvel som andre neurale progenitorceller opnået fra ESC'er, kun er mulig ved anvendelse af højt oprensede neurale progenitorceller, da udifferentierede embryonale stamceller uundgåeligt transformeres til teratomer og teratocarcinomer, når de transplanteres til en voksen immunkompetent recipient. Selv en minimal mængde dårligt differentierede celler i donorcellesuspensionen øger transplantatets tumorigenicitet kraftigt og øger risikoen for tumorudvikling eller dannelse af ikke-neuralt væv uacceptabelt. Opnåelse af homogene populationer af neurale progenitorceller er mulig, når man bruger celler, der opstår på visse stadier af normal embryogenese, som en alternativ kilde til donorvæv. En anden tilgang involverer omhyggelig eliminering af uønskede cellepopulationer ved afstamningsspecifik selektion. Brugen af ESC'er til neurotransplantation efter deres utilstrækkelige eksponering in vitro for vækstfaktorer er også farlig. I dette tilfælde kan en fejl i det neurale differentieringsprogram med dannelsen af strukturer, der er iboende i neuralrøret, ikke udelukkes.

I dag er det ret tydeligt, at neurale stamceller udviser tropisme for patologisk ændrede områder af centralnervesystemet og har en udtalt regenerativ-plastisk effekt. Mikromiljøet på stedet for nervevævscelledød modellerer retningen af differentiering af transplanterede celler og genopfylder dermed manglen på specifikke neurale elementer inden for zonen med CNS-skade. I nogle neurodegenerative processer opstår neurogene signaler til rekapitulering af neurogenese, og neurale stamceller fra den modne hjerne er i stand til at reagere på denne lærerige information. Talrige eksperimentelle data tjener som en klar illustration af det terapeutiske potentiale af neurale stamceller. Intracisternal administration af en klon af neurale stamceller til dyr med ligering af den midterste hjernearterie (en model for iskæmisk slagtilfælde) hjælper med at reducere arealet og volumenet af det destruktivt ændrede område af hjernen, især i tilfælde af transplantation af neurale stamceller sammen med FGF2. Immuncytokemisk observeres migration af donorceller til den iskæmiske zone med deres efterfølgende integration med intakte modtagerhjerneceller. Transplantation af umodne celler fra den neuroepiteliale linje MHP36 hos mus ind i hjernen hos rotter med eksperimentelt slagtilfælde forbedrer sensorimotorisk funktion, og introduktionen af disse celler i hjerneventriklerne forbedrer den kognitive funktion. Transplantation af neuralt prædannede hæmatopoietiske celler fra human knoglemarv til rotter eliminerer dysfunktion i hjernebarken forårsaget af iskæmisk skade. I dette tilfælde migrerer xenogene neurale progenitorceller fra injektionsstedet til zonen med destruktive ændringer i hjernevævet. Intrakraniel transplantation af homologe knoglemarvsceller ved traumatisk skade på hjernebarken hos rotter fører til delvis genoprettelse af motorisk funktion. Donorceller indpodes, prolifererer, undergår neural differentiering til neuroner og astrocytter og migrerer mod læsionen. Når de injiceres i striatum hos voksne rotter med eksperimentelt slagtilfælde, erstatter klonede humane neurale stamceller beskadigede CNS-celler og genopretter delvist nedsat hjernefunktion.

Humane neurale stamceller isoleres hovedsageligt fra det embryonale telencephalon, som udvikler sig meget senere end mere kaudalt placerede dele af nervestammen. Muligheden for at isolere neurale stamceller fra rygmarven fra et 43-137 dage gammelt menneskeligt foster er blevet vist, da disse celler i nærvær af EGF og FGF2 danner neurosfærer og udviser multipotens ved tidlige passager, hvor de differentierer til neuroner og astrocytter. Langvarig dyrkning af neurale progenitorceller (over 1 år) fratager dem imidlertid multipotensen - sådanne celler er kun i stand til at differentiere til astrocytter, dvs. de bliver unipotente. Regionale neurale stamceller kan opnås som følge af partiel bulbektomi og, efter reproduktion i kultur i nærvær af LIF, transplanteres til den samme patient med neurodegenerative forandringer i andre dele af centralnervesystemet. I klinikken blev erstatningscelleterapi med neurale stamceller først udført for at behandle patienter med slagtilfælde ledsaget af skade på hjernens basalganglier. Som følge af transplantation af donorceller blev der observeret en forbedring af de fleste patienters kliniske tilstand.

Nogle forfattere mener, at neurale stamcellers evne til at indpode, migrere og integrere sig i forskellige områder af nervevævet i tilfælde af CNS-skade åbner ubegrænsede muligheder for celleterapi af ikke kun lokale, men også omfattende (slagtilfælde eller kvælning), multifokale (multipel sklerose) og endda globale (de fleste arvelige metaboliske lidelser eller neurodegenerative demens) patologiske processer. Når klonede muse- og humane neurale stamceller transplanteres til modtagerdyr (henholdsvis mus og primater) med degeneration af dopaminerge neuroner i det mesostriatale system induceret af introduktion af methylphenyltetrapyridin (model for Parkinsons sygdom) 8 måneder før transplantation, integreres donor-neurale stamceller i modtagerens CNS. En måned senere lokaliseres de transplanterede celler bilateralt langs midterhjernen. Nogle af de resulterende neuroner af donoroprindelse udtrykker tyrosinhydrolase i fravær af tegn på en immunreaktion på transplantatet. Hos rotter, der fik administreret 6-hydroxydopamin (en anden eksperimentel model for Parkinsons sygdom), blev tilpasningen af transplanterede celler til mikromiljøet i værtshjernen bestemt af betingelserne for dyrkning af neurale stamceller før deres transplantation. Neurale stamceller, der hurtigt prolifererede in vitro under påvirkning af EGF, kompenserede mere effektivt for manglen på dopaminerge neuroner i det beskadigede striatum end celler fra 28-dages kulturer. Forfatterne mener, at dette skyldes tabet af evnen til at opfatte de tilsvarende differentieringssignaler under celledelingsprocessen af neurale progenitorceller in vitro.

I nogle undersøgelser blev der gjort forsøg på at øge effektiviteten af virkningen på reinnervationsprocesserne i det beskadigede striatum ved at transplantere embryonale striatumceller ind i dette område som en kilde til neurotrofiske faktorer med samtidig transplantation af dopaminerge neuroner i det ventrale mesencephalon. Det viste sig, at effektiviteten af neurotransplantation i høj grad afhænger af metoden til indføring af embryonalt nervevæv. Som et resultat af undersøgelser af transplantation af embryonale nervevævspræparater ind i hjernens ventrikulære system (for at undgå skade på striatumparenkym) blev der opnået information om deres positive effekt på motoriske defekter ved Parkinsonisme.

Imidlertid har eksperimentelle observationer i andre undersøgelser vist, at transplantation af embryonale nervevævspræparater fra det ventrale mesencephalon indeholdende dopaminerge neuroner ind i hjerneventrikel, såvel som transplantation af GABA-erge embryonale neurale elementer ind i striatum hos rotter med hemiparkinsonisme, ikke fremmer genoprettelsen af de forringede funktioner i det dopaminerge system. Tværtimod bekræftede immunocytokemisk analyse dataene om den lave overlevelsesrate for dopaminerge neuroner fra det ventrale mesencephalon transplanteret ind i rotters striatum. Den terapeutiske effekt af intraventrikulær transplantation af embryonalt nervevæv fra det ventrale mesencephalon blev kun realiseret under samtidig implantation af et præparat af embryonale striatale celler i det denerverede striatum. Forfatterne mener, at mekanismen bag denne effekt er forbundet med den positive trofiske effekt af GABA-erge elementer fra det embryonale striatum på den specifikke dopaminerge aktivitet af intraventrikulære ventrale mesencephalon-transplantater. En udtalt glial reaktion i transplantationerne blev ledsaget af en let regression af apomorfin-testparametrene. Sidstnævnte korrelerede til gengæld med GFAP-indholdet i blodserumet, hvilket direkte indikerede en krænkelse af blod-hjerne-barrierens permeabilitet. Baseret på disse data konkluderede forfatterne, at GFAP-niveauet i blodserumet kan bruges som et tilstrækkeligt kriterium til vurdering af transplantatets funktionelle tilstand, og øget permeabilitet af blod-hjerne-barrieren for neurospecifikke antigener såsom GFAP er et patogenetisk led i udviklingen af transplantationssvigt på grund af autoimmun skade på modtagerens nervevæv.

Fra andre forskeres synspunkt er indpodningen og integrationen af neurale stamceller efter transplantation stabil og livslang, da donorceller findes i recipienter i mindst to år efter transplantation og uden et signifikant fald i deres antal. Forsøg på at forklare dette med, at neurale stamceller i en udifferentieret tilstand ikke udtrykker MHC klasse I og II-molekyler på et niveau, der er tilstrækkeligt til at inducere en immunafstødningsreaktion, kan kun betragtes som sande i forhold til lavt differentierede neurale forstadier. Imidlertid bevares ikke alle neurale stamceller i recipientens hjerne i en umoden, hvilende tilstand. De fleste af dem gennemgår differentiering, hvor MHC-molekyler udtrykkes fuldt ud.

Især den utilstrækkelige effektivitet af at anvende intrastriatal transplantation af embryonale ventrale mesencephalonpræparater indeholdende dopaminerge neuroner til behandling af eksperimentel parkinsonisme er forbundet med den lave overlevelsesrate for transplanterede dopaminerge neuroner (kun 5-20%), hvilket skyldes reaktiv gliose, der ledsager lokalt traume af hjerneparenkym under transplantation. Det er kendt, at lokalt traume af hjerneparenkym og samtidig gliose fører til forstyrrelse af blod-hjerne-barrierens integritet med frigivelse af antigener fra nervevæv, især OCAR og neuronspecifikt antigen, i det perifere blod. Tilstedeværelsen af disse antigener i blodet kan forårsage produktion af specifikke cytotoksiske antistoffer mod dem og udvikling af autoimmun aggression.

V. Tsymbalyuk og medforfattere (2001) rapporterer, at det traditionelle synspunkt stadig gælder, ifølge hvilket centralnervesystemet er en immunologisk privilegeret zone isoleret fra immunsystemet af blod-hjerne-barrieren. I deres litteraturgennemgang citerer forfatterne en række værker, der indikerer, at dette synspunkt ikke fuldt ud svarer til essensen af immunprocesser i pattedyrs hjerne. Det er blevet fastslået, at mærkede stoffer, der introduceres i hjerneparenkym, kan nå dybe cervikale lymfeknuder, og efter intracerebral injektion af antigener dannes specifikke antistoffer i kroppen. Celler i de cervikale lymfeknuder reagerer på sådanne antigener ved proliferation, der begynder på den 5. dag efter injektionen. Dannelsen af specifikke antistoffer er også blevet afsløret under hudtransplantation ind i hjerneparenkym. Forfatterne af gennemgangen giver flere hypotetiske veje for antigentransport fra hjernen til lymfesystemet. En af dem er overgangen af antigener fra de perivaskulære rum til det subarachnoide rum. Det antages, at de perivaskulære rum, der er lokaliseret langs hjernens store kar, svarer til lymfesystemet i hjernen. Den anden vej går langs de hvide fibre - gennem etmoideumknoglen ind i lymfekarrene i næseslimhinden. Derudover er der et omfattende netværk af lymfekar i dura mater. Blod-hjerne-barrierens uigennemtrængelighed for lymfocytter er også ret relativ. Det er blevet bevist, at aktiverede lymfocytter er i stand til at producere enzymer, der påvirker permeabiliteten af hjernens "immunfilter"-strukturer. På niveau med postkapillære venoler trænger aktiverede T-hjælpere ind i den intakte blod-hjerne-barriere. Tesen om fraværet af celler i hjernen, der repræsenterer antigener, holder ikke stik. I øjeblikket er muligheden for at repræsentere antigener i CNS af mindst tre typer celler blevet overbevisende bevist. For det første er disse dendritiske celler afledt af knoglemarv, der er lokaliseret i hjernen langs store blodkar og i den hvide substans. For det andet er antigener i stand til at præsentere endotelceller i hjernens blodkar, og i forbindelse med MHC-antigener, hvilket understøtter den klonale vækst af T-celler, der er specifikke for disse antigener. For det tredje fungerer mikro- og astrogliaceller som antigenpræsenterende stoffer. Astrocytter deltager i dannelsen af immunresponset i centralnervesystemet og erhverver egenskaberne hos en immuneffektorcelle og udtrykker en række antigener, cytokiner og immunmodulatorer. Når de inkuberes med y-interferon (y-INF), udtrykker astrogliaceller in vitro MHC klasse I og II antigener, og stimulerede astrocytter er i stand til antigenpræsentation og opretholdelse af klonal proliferation af lymfocytter.

Hjernevævstraume, postoperativ inflammation, ødem og fibrinaflejringer i forbindelse med embryonal nervevævstransplantation skaber betingelser for øget permeabilitet af blod-hjerne-barrieren med nedsat autotolerance, sensibilisering og aktivering af CD3+CD4+ lymfocytter. Præsentation af auto- og alloantigener udføres af astrocytter og mikrogliaceller, der reagerer på y-INF ved at udtrykke MHC-molekyler, ICAM-1, LFA-I, LFA-3, de kostimulerende molekyler B7-1 (CD80) og B7-2 (CD86), samt sekretion af IL-la, IL-ip og y-INF.

Følgelig kan den længere overlevelse af embryonalt nervevæv efter intracerebral transplantation end efter perifer administration næppe forbindes med fraværet af initiering af transplantationsimmunitet. Desuden spiller monocytter, aktiverede lymfocytter (cytotoksiske CD3+CD8+ og T-hjælperceller) og de cytokiner, de producerer, samt antistoffer mod antigener fra det perifere transplantat af embryonalt nervevæv, en vigtig rolle i processen med dets afstødning. Et lavt niveau af MHC-molekyler i embryonalt nervevæv er af en vis betydning for at skabe betingelser for længerevarende resistens hos neurotransplantater over for T-celle-immunprocesser. Derfor udvikler immuninflammation i eksperimentet sig langsommere efter transplantation af embryonalt nervevæv til hjernen end efter hudtransplantation. Ikke desto mindre observeres fuldstændig destruktion af individuelle transplantater af nervevæv efter 6 måneder. I dette tilfælde er T-lymfocytter, der er begrænset af MHC klasse II-antigener, overvejende lokaliseret i transplantationszonen (Nicholas et al., 1988). Det er eksperimentelt blevet fastslået, at reduktion af T-hjælpere (L3T4+), men ikke cytotoksiske T-lymfocytter (Lyt-2), under xenologisk neurotransplantation forlænger overlevelsen af rottenervevæv i hjernen hos recipientmus. Afstødning af neurotransplantatet ledsages af dets infiltration af værtsmakrofager og T-lymfocytter. Følgelig fungerer værtsmakrofager og aktiverede mikrogliaceller in situ som antigenpræsenterende immunstimulerende celler, og øget ekspression af donor MHC klasse I-antigener forstærker dræberaktiviteten hos recipientcytotoksiske T-lymfocytter.

Det er meningsløst at analysere de mange spekulative forsøg på at forklare afstødning af neurotransplantationer ved recipientens immunsystems reaktion på donorens endotelceller eller gliale elementer, da selv rene linjer af neurale progenitorceller er udsat for immunangreb. Det er bemærkelsesværdigt, at ekspressionen af Fas-ligander fra hjerneceller, der binder apoptosereceptorer (Fas-molekyler) på T-lymfocytter, der infiltrerer hjernen og inducerer deres apoptose, spiller en vigtig rolle i mekanismerne bag længere transplantationsoverlevelse i CNS, hvilket er en typisk beskyttelsesmekanisme for transbarriere-autoimmunogene væv.

Som V. Tsymbalyuk og medforfattere (2001) med rette bemærker, er transplantation af embryonalt nervevæv karakteriseret ved udvikling af inflammation med deltagelse af celler, der er sensibiliseret over for hjerneantigener, og aktiverede celler, antistoffer, samt som følge af lokal produktion af cytokiner. En vigtig rolle i dette spilles af den præeksisterende sensibilisering af kroppen over for hjerneantigener, som forekommer under udviklingen af CNS-sygdomme og kan rettes mod transplantationsantigener. Derfor opnås den virkelig langsigtede overlevelse af histoinkompatible neurotransplantationer kun ved at undertrykke immunsystemet med cyclosporin A eller ved at introducere monoklonale antistoffer til recipientens CD4+ lymfocytter.

Således forbliver mange problemer med neurotransplantation uløste, herunder dem, der er relateret til vævs immunologiske kompatibilitet, som kun kan løses efter målrettet grundforskning og klinisk forskning.