Hæmatopoietiske stamceller fra navlestrengsblod

Navlestrengsblod er en god kilde til hæmatopoietiske stamceller med hensyn til proliferativt potentiale og repopulationskapacitet hos hæmatopoietiske celler. Det er gentagne gange blevet vist, at navlestrengsblod ved fødslen indeholder et tilstrækkeligt stort antal svagt engagerede hæmatopoietiske progenitorceller. Nogle forfattere mener, at fordelen ved transplantation af hæmatopoietiske stamceller med navlestrengsblod er, at det ikke er nødvendigt at søge efter en donor, der er kompatibel med HLA-antigener. Efter deres mening forårsager den nyfødtes umodenhed af immunsystemet reduceret funktionel aktivitet af immunkompetente celler og dermed en lavere forekomst af alvorlig graft-versus-host-sygdom end ved knoglemarvstransplantation. Samtidig er overlevelsesraten for en navlestrengsblodcelletransplantation ikke lavere end for knoglemarvsceller, selv ikke i tilfælde af at der anvendes et mindre antal HSC'er administreret pr. 1 kg af patientens kropsvægt. Efter vores mening kræver spørgsmålene om det optimale antal transplanterede navlestrengsblodceller, der kræves for effektiv transplantation i modtagerens krop, deres immunologiske kompatibilitet og en række andre aspekter af problemet med transplantation af hæmatopoietiske stamceller fra navlestrengsblod, dog en mere seriøs analyse.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ]

Udvinding af hæmatopoietiske stamceller fra navlestrengsblod

Proceduren for at udvinde hæmatopoietiske stamceller fra navlestrengsblod kræver, at de indsamles umiddelbart efter barnets fødsel og adskilles fra moderkagen, når moderkagen er in utero eller ex utero, samt under et kejsersnit, men også ex utero. Det har vist sig, at hvis tiden fra fødselsøjeblikket til den nyfødtes adskillelse fra moderkagen reduceres til 30 sekunder, øges mængden af navlestrengsblod med gennemsnitligt 25-40 ml. Hvis denne procedure udføres senere, går den samme mængde blod tabt. Det er blevet fastslået, at tidlig adskillelse af barnet fra moderkagen ikke medfører nogen negative konsekvenser for den nyfødte.

Det Russiske Forskningsinstitut for Hæmatologi og Transfusiologi har udviklet effektive og billige teknologier til at udvinde navlestrengsblod både under normal fødsel ((70,2+25,8) ml) og kejsersnit ((73,4+25,1) ml). En metode til at separere navlestrengsblod med et tilstrækkeligt højt udbytte af kerneholdige og mononukleære celler er blevet foreslået - henholdsvis (83,1+9,6) og (83,4+14,1)%. En metode til kryopræservering af navlestrengsblod er blevet forbedret, hvilket sikrer en høj præservering af mononukleære celler og CFU-GM - henholdsvis (96,8+5,7) og (89,6+22,6)%. Effektiviteten af drænagemetoden til opsamling af navlestrengsblod ved hjælp af Kompoplast-300-beholderen (Rusland) er blevet bestemt. Forfatterne indsamlede navlestrengsblod umiddelbart efter barnets fødsel og dets adskillelse fra moderkagen, under forhold med moderkagens placering in utero eller ex utero. Før punkteringen af navlestrengsvenen blev navlestrengen behandlet én gang med 5% jodtinktur og derefter to gange med 70% ethylalkohol. Blodet flød spontant gennem forbindelsesrørene ned i beholderen. Indsamlingsproceduren tog ikke mere end 10 minutter. Det gennemsnitlige volumen af 66 navlestrengsblodprøver indsamlet ved drænage var (72+28) ml, og antallet af leukocytter i det gennemsnitlige samlede prøvevolumen var (1,1+0,6) x 107. Ved analyse af navlestrengsblod for sterilitet (bakteriel kontaminering, HIV-1, hepatitis B- og C-virus, syfilis og cytomegalovirusinfektion) blev der kun påvist IgG-antistoffer mod hepatitis C-virus i én prøve. I et andet studie blev moderkagen placeret med fosteroverfladen nedad på en speciel ramme umiddelbart efter fødslen, og navlestrengen blev behandlet med 5% jodopløsning og 75% ethylalkohol. Navlestrengsvenen blev drænet ved hjælp af en nål fra et transfusionssystem (G16). Blodet flød spontant ned i beholderen. Det gennemsnitlige volumen af blod indsamlet på denne måde var (55+25) ml. I G. Kogler et al.s arbejde (1996) blev navlestrengsblod indsamlet ved hjælp af en lukket metode, og store mængder blod blev udtaget - i gennemsnit (79+26) ml. Forfatterne bemærker, at blandt 574 navlestrengsblodprøver indeholdt omkring 7% mindre end 40 ml blod, hvilket ikke tillader dem at blive brugt til transplantation. K. Isoyama et al. (1996) opnåede ved aktiv eksfusion ved hjælp af sprøjter et gennemsnit på 69,1 ml blod (volumenet af navlestrengsblod varierede fra 15 til 135 ml). Endelig lykkedes det A. Abdel-Mageed PI et al. (1997) at udtage et gennemsnit på 94 ml navlestrengsblod (fra 56 til 143 ml) gennem kateterisering af navlestrengsvenen.

For at reducere risikoen for iatrogen infektion og kontaminering med moderens sekreter er der udviklet et lukket blodopsamlingssystem baseret på det udbredte transfusionssystem fra Baxter Healthcare Corp., Deerfield, IL (USA), der indeholder 62,5 ml CPDA (citrat-fosfat-dextrose med adenin) som antikoagulant. Teknologien til at udvinde materialet er af primær betydning for at fremstille en prøve af høj kvalitet med hensyn til volumen, indhold og renhed af cellesuspensionen. Af de eksisterende metoder til opsamling af navlestrengsblod, som traditionelt klassificeres i lukkede, halvåbne og åbne systemer, bør den første foretrækkes, da det lukkede system reducerer risikoen for mikrobiel kontaminering af materialet samt kontaminering af cellesuspensionen med moderens celler betydeligt.

A. Nagler et al. (1998) udførte en sammenlignende analyse af effektiviteten af alle tre systemer til opsamling af navlestrengsblod. I den første variant blev proceduren udført i et lukket system ved at eksfoliere blod direkte ned i en beholder. I den anden variant blev navlestrengsblod udtaget ved aktiv eksfusion af blod med en MP1-sprøjte efterfulgt af skylning af placenta-venerne og samtidig dræning af blodet ned i en beholder (åben metode). I den tredje variant blev blodet opsamlet i et halvåbent system ved aktivt at ekstrahere det med sprøjter og skylle det gennem navlestrengsarterien med samtidig eksfusion ned i en beholder. I den første variant opnåede forfatterne navlestrengsblod i et volumen på (76,4+32,1) ml med et leukocytindhold på (10,5+3,6) x 106 ⁱ 1 ml blod. I den anden variant var de tilsvarende indikatorer (174,4+42,8) ml og (8,8+3,4) x 106 ^/ ml; i den tredje - (173,7+41,3) ml og (9,3+3,8) x 10 ⁶ /ml. Den hyppigste infektion i navlestrengsblodprøver blev observeret ved brug af et åbent system. Der blev etableret en direkte korrelation mellem placentas masse og det udtagne blodvolumen - med en stigning i placentas masse øges mængden af opsamlet blod.

Efter opsamling af navlestrengsblod følger separationsfasen - isolering af mononukleære celler og oprensning af cellesuspensionen fra erytrocytter. Under eksperimentelle forhold isoleres nukleerede celler ved sedimentation med methylcellulose under lysis af erytrocytter med ammoniumchlorid. Methylcellulose bør dog ikke anvendes til kliniske formål, da tabet af hæmatopoietiske stamceller på den når 50-90%. Lysis af erytrocytter udføres næsten aldrig i klinikken på grund af de store volumener af arbejdsopløsningen, selvom procentdelen af isolering af nukleerede celler med CD34+ fænotypen, såvel som progenitorceller med CFU-GM- og CFU-GEMM-funktionerne på denne måde, er betydeligt højere. Fremkomsten af et nyt middel til isolering af mononukleære celler i en densitetsgradient, buyant density solution (BDS72), er rapporteret. Dette stof har følgende fysiologiske parametre: pH - 7,4, osmolalitet - 280 mOsm/kg, densitet - 1,0720 g/ml. Ifølge forfatterne kan det bruges til at isolere op til 100% af CD34-positive celler og fjerne 98% af erytrocytterne. BDS72 anvendes dog endnu ikke i klinikken.

I de godkendte metoder til isolering af kerneholdige celler fra navlestrengsblod anvendes normalt en 10% hydroxyethylstivelsesopløsning eller en 3% gelatineopløsning. Effektiviteten af sedimentering af erytrocytter og isolering af kerneholdige celler er i begge tilfælde omtrent den samme. Når gelatine anvendes som sedimenteringsmiddel, er det dog muligt at opnå en lidt større mængde CFU-GM end ved anvendelse af hydroxyethylstivelse. Det antages, at forskellene i effektiviteten af CFU-GM-isolering skyldes forskellige sedimenteringshastigheder for individuelle fraktioner af kerneholdige celler eller hydroxyethylstivelsesmolekylers evne til at blive absorberet på overfladen af hæmatopoietiske cellereceptorer og derved blokere deres følsomhed over for kolonistimulerende faktorer, der anvendes til dyrkning af CFU-GM in vitro. Ikke desto mindre kan begge sedimentatorer være velegnede til isolering af kerneholdige celler ved oprettelse af store navlestrengsblodbanker.

Metoder til separation og kryopræservering af navlestrengsblod adskiller sig grundlæggende ikke fra dem, der anvendes i arbejde med hæmatopoietiske stamceller fra perifert blod og knoglemarv fra voksne donorer. Men når man forbereder et stort antal navlestrengsblodprøver til deres banker, skal separationsmetoderne først og fremmest være billige. Derfor anvendes der desværre i øjeblikket, til kliniske behov, allerede afprøvede rutinemetoder til isolering og kryopræservering af navlestrengsblodceller, og mere effektive, men dyre metoder er fortsat eksperimentatorernes lod.

Generelt er der godkendt kriterier for vurdering af antallet af hæmatopoietiske celler og krav til undersøgelse af navlestrengsblodprøver for at identificere infektiøse agenser. For at sikre sikkerheden ved transplantation af hæmatopoietiske celler fra navlestrengsblod skal alle blodprøver primært undersøges for hæmatogent overførte infektioner og genetiske sygdomme. En række forfattere anbefaler yderligere særlige metoder til undersøgelse af navlestrengsblod for at diagnosticere genetiske sygdomme såsom α-thalassæmi, seglcelleanæmi, adenosindeaminasemangel, Brutons agammaglobulinæmi, Hurlers og Ponters sygdomme.

Ifølge anbefalingerne fra L. Ticheli og medforfattere (1998) skal hver navlestrengsblodprøve testes for kerneholdige celler, CD34-positive celler og CFU-GM, HLA-typning skal udføres, og blodgruppen skal bestemmes i henhold til ABO og dens Rh-faktor. Derudover skal der udføres bakteriologisk dyrkning, serologisk testning for HIV- og cytomegalovirusinfektion, HBsAg, viral hepatitis C, HTLY-I og HTLV-II (human T-celleleukæmi), syfilis og toxoplasmose. Polymerasekædereaktion (PCR) for cytomegalovirus- og HIV-infektion er obligatorisk.

Proceduren for udtagning af navlestrengsblod skal udføres i nøje overensstemmelse med principperne for medicinsk bioetik. Før blodprøvetagning er det nødvendigt at indhente den gravide kvindes samtykke til at udføre den. En indledende samtale med den gravide kvinde for at indhente informeret samtykke til alle manipulationer, fra blodudtagning til udfyldning af dokumentation, må kun udføres af sundhedspersonale. Det er under ingen omstændigheder tilladt, at nogen af disse procedurer udføres af personale med biologisk, kemisk, farmaceutisk eller anden ikke-medicinsk uddannelse på grund af overtrædelse af etablerede normer for bioetik og menneskerettigheder. I tilfælde af positive tests for HBsAg-bærer, tilstedeværelsen af antistoffer mod patogenerne hepatitis C, HIV-infektion og syfilis, indsamles navlestrengsblod ikke, og prøver af allerede indsamlet blod afvises og destrueres. Det skal bemærkes, at bærerskab af latente infektioner hos nyfødte er meget mindre almindeligt end hos voksne, derfor er sandsynligheden for hæmatogen overførsel og udvikling af infektiøse komplikationer under infusioner af hæmatopoietiske celler fra navlestrengsblod betydeligt lavere end i tilfælde af brug af voksen donorknoglemarv til transplantation.

Et vigtigt aspekt af klinisk anvendelse af navlestrengsblod er transplantationsevaluering, som er baseret på bestemmelse af mængden af hæmatopoietiske stamceller i en navlestrengsblodprøve og de doser af celler, der kræves til transplantation. Der er i øjeblikket ikke udviklet standarder for den optimale mængde navlestrengsblodceller, der kræves til transplantation. Der findes ikke et generelt accepteret synspunkt, selv ikke på rutineparametre som antallet af CD34-positive celler og CFU-GM. Nogle forfattere evaluerer potentialet af hæmatopoietiske celler ved at analysere langtidskulturer med bestemmelse af indholdet af kolonidannende enheder, der er fælles for granulocytter, erytrocytter, monocytter og megakaryocytter - CFU-GEMM.

I en klinisk sammenhæng involverer standardvurdering af en navlestrengsblodtransplantation imidlertid typisk kun bestemmelse af antallet af nukleerede eller mononukleære celler.

Opbevaring af hæmatopoietiske stamceller fra navlestrengsblod

Der er også nogle problemer i teknologien til opbevaring af hæmatopoietiske celler fra navlestrengsblod. Ved kryopræservering af hæmatopoietiske stamceller er det nødvendigt at reducere mængden af navlestrengsblod så meget som muligt for at opnå den optimale frysetilstand, samt at fjerne erytrocytter på forhånd for at undgå hæmolyse og risikoen for at udvikle en inkompatibilitetsreaktion for erytrocytantigener (ABO, Rh). Forskellige metoder til isolering af kerneholdige celler er egnede til disse formål. I begyndelsen af 90'erne af det forrige århundrede var den mest anvendte metode isolering af kerneholdige celler i en densitetsgradient baseret på Ficoll med en densitet på 1,077 g/ml eller Percoll med en densitet på 1,080 g/ml. Separation af navlestrengsblod i en densitetsgradient muliggør isolering af overvejende mononukleære celler, men fører til betydelige tab af hæmatopoietiske progenitorceller - op til 30-50%.

Sedimenteringseffektiviteten af hydroxyethylstivelse i processen med at isolere hæmatopoietiske celler fra navlestrengsblod vurderes forskelligt. Nogle forfattere peger på den lave kvalitet af separationen ved hjælp af denne metode, mens andre forskere derimod blandt alle mulige metoder foretrækker at isolere HSC fra navlestrengsblod ved hjælp af en 6% hydroxyethylstivelsesopløsning. Samtidig fremhæves den høje effektivitet af sedimentering af hæmatopoietiske celler, som ifølge nogle data når fra 84% til 90%.

Fortalere for et andet synspunkt mener, at stort set alle fraktioneringsmetoder er forbundet med store tab af kerneholdige celler og foreslår at udføre separation ved centrifugering, hvor navlestrengsblodet opdeles i 3 fraktioner: erytrocytter, leukocytring og plasma. Ved at isolere cellerne på denne måde fandt forfatterne, at indholdet af mononukleære celler, tidlige hæmatopoietiske progenitorceller og celler med CD34+ immunofænotypen i sidste ende udgjorde henholdsvis 90, 88 og 100% af det oprindelige niveau. Lignende værdier for stigningen i navlestrengsblodceller oprenset ved denne metode blev også opnået af andre forskere: efter sedimentation blev 92% af de kerneholdige celler, 98% af de mononukleære celler, 96% af CD34-positive celler og 106% af de kolonidannende enheder isoleret.

I slutningen af 1990'erne blev gelatine i vid udstrækning anvendt som sedimenteringsmiddel. I klinisk praksis er gelatine blevet brugt til at isolere hæmatopoietiske stamceller fra navlestrengsblod siden 1994. Ved anvendelse af en 3% gelatineopløsning når effektiviteten af isolering af kerneholdige celler 88-94%. Den omfattende anvendelse af gelatine til oprettelse af en navlestrengsblodbank har bekræftet dens fordele i forhold til andre sedimenteringsmidler. En sammenlignende analyse af effektiviteten af alle ovenstående metoder til isolering af kerneholdige celler under betingelserne for deres sekventielle anvendelse på hver af de testede navlestrengsblodprøver har vist, at en 3% gelatineopløsning er det optimale sedimenteringsmiddel med hensyn til udbyttet af mononukleære celler med CD34+/CD45+ fænotypen, såvel som med hensyn til antallet af CFU-GM og CFU-GEMM. Metoder, der anvendte en Ficoll-densitetsgradient, såvel som brugen af hydroxyethylstivelse og methylcellulose, var signifikant mindre effektive, med tab af hæmatopoietiske celler på op til 60%.

Udvidelsen af transplantationsvolumener fra navlestrengsblodstamceller er ikke kun forbundet med udviklingen af metoder til deres erhvervelse, men også med opbevaring. Der er mange problemer, der er direkte relateret til forberedelsen af navlestrengsblod til langtidsopbevaring og valget af den optimale teknologi til kryopræservering af prøverne. Blandt disse er spørgsmålene om muligheden for at udføre separationsprocedurer, bruge forskellige kryopræserveringsmedier og anvende metoder til at forberede optøede celler til transplantation. Transport af native navlestrengsblodprøver udføres ofte fra områder fjernt fra hæmatologiske centre. I denne henseende opstår problemet med acceptable opbevaringsperioder for navlestrengsblod fra dets erhvervelsestidspunkt til begyndelsen af kryopræserveringen, hvilket er af særlig betydning ved oprettelse af navlestrengsblodbanker.

En undersøgelse af den funktionelle aktivitet af hæmatopoietiske celler i navlestrengsblod efter langtidsopbevaring (op til 12 år) i flydende nitrogen har vist, at omkring 95% af de hæmatopoietiske celler ikke mister deres høje proliferative kapacitet i denne periode. I S. Yurasov og medforfatteres arbejde (1997) blev det bevist, at opbevaring af navlestrengsblod ved stuetemperatur (22°C) eller ved 4°C i 24 og 48 timer ikke signifikant reducerer levedygtigheden af hæmatopoietiske celler, som er henholdsvis 92 og 88% af det oprindelige niveau. Men hvis opbevaringsperioden forlænges til tre dage, falder antallet af levedygtige kerneholdige celler i navlestrengsblodet betydeligt. Samtidig har andre undersøgelser vist, at når det opbevares i 2-3 dage ved 22 eller 4°C, er det først og fremmest levedygtigheden af modne granulocytter, snarere end hæmatopoietiske celler, der lider.

Levedygtigheden af hæmatopoietiske stamceller fra navlestrengsblod kan blive negativt påvirket af komponenter i navlestrengsblodindsamlingssystemer. En analyse af effekten af forskellige antikoagulantia, hvis virkningsmekanisme skyldes calciumionbinding (ACD, EDTA, XAPD-1), på hæmatopoietiske stamceller under opbevaring af navlestrengsblod i 24 til 72 timer, afslørede deres negative effekt på levedygtigheden af kerneholdige celler. I denne henseende anbefaler forfatterne at bruge PBS (fosfatbufferopløsning) med tilsætning af nativt heparin uden konserveringsmiddel i en koncentration på 20 U/ml, hvilket efter deres mening gør det muligt at øge opbevaringsperioden for ufraktioneret navlestrengsblod til 72 timer og bevare den funktionelle aktivitet af kolonidannende enheder. En undersøgelse af sikkerheden ved CFU-GM og CFU-G viste imidlertid, at opbevaringstiden for navlestrengsblod før kryopræservering ikke bør overstige ni timer. Princippet, der bør gælde i dette tilfælde, er naturligvis, at i tilfælde af modstridende data bør den anbefalede minimumsopbevaringsperiode for navlestrengsblod anvendes, og programmeret nedfrysning af de isolerede celler bør iværksættes hurtigst muligt.

Ved frysning af hæmatopoietiske stamceller fra navlestrengsblod anvendes normalt en 10% DMSO-opløsning som kryobeskyttelsesmiddel. Ud over den udtalte kryobeskyttelseseffekt har dimethylsulfoxid i en sådan koncentration dog også en direkte cytotoksisk effekt, selv med minimal eksponering for hæmatopoietiske celler fra navlestrengsblod. For at reducere den cytotoksiske effekt af DMSO anvendes en nul eksponeringstemperatur, hastigheden af alle manipulationer øges, og der udføres flere vaskninger efter optøning af navlestrengsblodprøver.

Siden 1995 har Institut for Hæmatologi og Transfusiologi ved Det Ukraines Akademi for Medicinske Videnskaber udviklet en videnskabelig retning, der sigter mod en omfattende undersøgelse af navlestrengsblod som en alternativ kilde til hæmatopoietiske stamceller. Især er der blevet udviklet nye teknologier til lavtemperaturkryopræservering af hæmatopoietiske celler fra ufraktioneret og fraktioneret navlestrengsblod. Lavmolekylær medicinsk polyvinylpyrrolidon anvendes som kryobeskyttelsesmiddel. Metoden til kryopræservering af ufraktioneret navlestrengsblod er baseret på en original teknologi til præpræparering af celler til frysning og en metode til speciel behandling af cellesuspension umiddelbart før transplantation.

En af de vigtigste faktorer, der påvirker niveauet af funktionel aktivitet af kryopræserverede hæmatopoietiske stamceller, er cellesuspensionens afkølingshastighed, især under krystallisationsfasen. En softwaretilgang til at løse problemet med frysehastighed og -tid giver store muligheder for at skabe enkle og yderst effektive kryopræserveringsmetoder uden at vaske cellesuspensionen fra kryoprotektorer før transplantation.

De farligste stadier for cellernes levedygtighed under deres fremstilling er stadierne med direkte frysning og optøning. Ved frysning af hæmatopoietiske celler kan en betydelig del af dem ødelægges i det øjeblik, hvor det intercellulære medium går fra flydende til fast fase - krystallisation. For at reducere procentdelen af celledød anvendes kryoprotektorer, hvis virkningsmekanismer og kryobeskyttende effektivitet er tilstrækkeligt beskrevet i den videnskabelige litteratur.

En lovende retning for optimering af kryopræserveringsmetoder for knoglemarvs- og navlestrengsblodceller er kombinationen af lave koncentrationer af flere kryoprotektorer med forskellige virkningsmekanismer i én opløsning, for eksempel DMSO, der virker på intracellulært niveau, og hydroxyethylstivelse eller albumin, som har en ekstracellulær beskyttende effekt.

Til kryopræservering af navlestrengsblodceller anvendes traditionelt en 20% DMSO-opløsning, som langsomt hældes i cellesuspensionen under konstant mekanisk omrøring i et isbad, indtil et ligeligt (1:1) forhold mellem kryobeskyttelsesmiddel og cellesuspensionsvolumener er opnået. Den endelige koncentration af dimethylsulfoxid er 10%. Cellesuspensionen afkøles derefter i en programmeret kryogen enhed med en hastighed på GS/min til -40°C, hvorefter afkølingshastigheden øges til 10°C/min. Efter at have nået -100°C placeres beholderen med cellesuspensionen i flydende nitrogen (-196°C). Med denne kryopræserveringsteknik når præserveringen af funktionelt aktive mononukleære celler efter optøning 85% af det oprindelige niveau.

Modifikationer af kryopræserveringsmetoder har til formål at reducere koncentrationen af DMSO ved at tilsætte hydroxyethylstivelse (slutkoncentrationerne af dimethylsulfoxid og hydroxyethylstivelse er henholdsvis 5 og 6 %). Høj effektivitet af en sådan kombination af kryoprotektorer observeres ved frysning af en suspension af myeloide celler, og med ikke mindre cytoprotektion end ved kun at bruge en 10 % opløsning af dimethylsulfoxid. Antallet af levedygtige kerneholdige celler nåede 96,7 % af det oprindelige niveau, og deres funktionelle aktivitet, estimeret ud fra antallet af CFU-GM, var 81,8 %.

Når man bruger en dimethylsulfoxidopløsning i koncentrationer fra 5 til 10% i kombination med 4% hydroxyethylstivelse (slutkoncentration), blev det konstateret, at sikkerheden for CD34-positive celler i sådanne områder af dimethylsulfoxid forbliver stort set uændret. Samtidig, når koncentrationen af dimethylsulfoxid falder fra 5 til 2,5%, observeres massiv død af navlestrengsblodceller - antallet af levedygtige celleenheder falder fra 85,4 til 12,2%. Andre forfattere kom også til den konklusion, at det er 5- og 10% dimethylsulfoxidopløsninger (i forfatterens version - i kombination med autologt serum), der giver cytobeskyttelse med maksimal effektivitet under kryopræservering af HSC'er fra navlestrengsblod. Derudover bemærkes høj konservering af successivt frosne og optøede celler i tilfælde af en kombination af 5 eller 10% dimethylsulfoxid med en 4% hydroxyethylstivelsesopløsning, især ved en kontrolleret kølehastighed på GS/min. I et andet studie blev der anvendt en kryobeskyttende opløsning bestående af tre ingredienser - DMSO, renset humant albumin og RPMI-medium i forholdet 1:4:5 - som blev tilsat cellesuspensionen i et lige volumenforhold (slutkoncentrationen af dimethylsulfoxid var 5%). Efter optøning i et vandbad ved en temperatur på +4 GS oversteg konserveringsgraden af CFU-GM 94%.

Nogle forfattere foreslår at bruge ufraktioneret navlestrengsblod til kryopræservering, da betydelige mængder hæmatopoietiske celler går tabt under processen med at fjerne røde blodlegemer. I denne variant anvendes en 10% opløsning af dimethylsulfoxid til at beskytte mononukleære celler mod de skadelige virkninger af kryokrystallisation. Frysning udføres ved en konstant kølehastighed på GS/min til -80°C, hvorefter navlestrengsblodcellesuspensionen nedsænkes i flydende nitrogen. Denne frysemetode resulterer i delvis lysis af røde blodlegemer, så blodprøver ikke kræver fraktionering. Efter optøning vaskes cellesuspensionen fra frit hæmoglobin og dimethylsulfoxid i en opløsning af humant albumin eller i patientens autologe blodserum og anvendes til transplantation.

Bevarelsen af hæmatopoietiske progenitorceller efter optøning af ufraktioneret navlestrengsblod er ganske vist højere end for fraktioneret navlestrengsblod. På grund af nogle erytrocytters kryostabilitet kan der dog opstå alvorlige problemer efter transfusion på grund af transfusion af ABO-inkompatible erytrocytter. Derudover øges mængden af opbevaret ufraktioneret blod betydeligt. Fra et klinisk synspunkt er kryopræservering af tidligere isolerede og oprensede hæmatopoietiske celler fra navlestrengsblod stadig at foretrække.

Især er der udviklet en metode til kryopræservering af fraktionerede navlestrengsblodceller, der muliggør fjernelse af erytrocytter i forberedelsesfasen til frysning, hvor en 6% opløsning af hydroxyethylstivelse anvendes som en del af plasmasubstitutionsopløsningen "Stabizol". Efter optøning er den på denne måde opnåede cellesuspension klar til klinisk brug uden yderligere manipulationer.

Der findes således i øjeblikket mange ret effektive metoder til kryopræservering af navlestrengsblod. Deres grundlæggende forskel er, at blodprøver fryses ufraktioneret eller opdeles i cellefraktioner i præparationsfasen, og der fremstilles kerneholdige celler uden tilsætning af erytrocytter.

Transplantation af hæmatopoietisk stamcelle i navlestrengsblod

I slutningen af 1980'erne og begyndelsen af 1990'erne blev det fastslået, at navlestrengsblod, som giver fosteret livsstøtte under graviditeten, har et højt indhold af hæmatopoietiske stamceller. Den relative enkelhed ved at udvinde navlestrengsblodceller og fraværet af åbenlyse etiske problemer bidrog til brugen af navlestrengsblodstamceller i praktisk medicin. Den første succesfulde navlestrengsblodtransplantation til et barn med Fanconi-anæmi tjente som udgangspunkt for at udvide mængden af navlestrengsblodstamcelletransplantationer og skabe et system til opsamling af disse. I det globale system af navlestrengsblodbanker er den største New York Placental Blood Center, som er registreret på US National Institute of Healths balance. Antallet af oplagrede navlestrengsblodprøver i denne bank nærmer sig 20.000. Antallet af modtagere (primært børn), der har gennemgået en vellykket transplantation, vokser også. Ifølge det amerikanske sundhedsministerium overstiger den tilbagefaldsfri periode efter transplantation for modtagere af navlestrengsblodtransplantationer allerede 10 år.

Dette er ikke overraskende, da adskillige undersøgelser af navlestrengsblodets hæmatopoietiske potentiale har vist, at det med hensyn til mængden og kvaliteten af de tidligste stamceller ikke blot ikke er ringere end en voksens knoglemarv, men også overgår den på nogle måder. Det højere proliferative potentiale for navlestrengsblodstamceller skyldes de ontogenetiske træk ved cellulær signalering, tilstedeværelsen af receptorer for specifikke vækstfaktorer på HSC, navlestrengsblodcellernes evne til autokrin produktion af vækstfaktorer samt telomerernes store størrelse og længde.

Således forudbestemmer de genomiske og fænotypiske egenskaber ved hæmatopoietiske stamceller fra navlestrengsblod en højkvalitetsindpodning af transplantatet med et højt potentiale for genoprettelse af donorhæmatopoiese i modtagerens krop.

Fordele ved hæmatopoietiske stamceller fra navlestrengsblod

Blandt de reelle fordele ved at bruge hæmatopoietiske stamceller fra navlestrengsblod til transplantation i forhold til andre kilder til hæmatopoietiske celler er det værd at bemærke den praktisk talt nul risiko for donorens helbred (hvis vi ikke betragter placenta som sådan) og fraværet af behovet for generel anæstesi. Brugen af navlestrengsblod udvider mulighederne for celletransplantation på grund af delvist HLA-kompatible transplantater (uforenelighed fra et til tre antigener). Der er udviklet en metode til langtidsopbevaring af hæmatopoietiske celler fra navlestrengsblod i frossen tilstand, hvilket øger sandsynligheden for at opnå sjældne HLA-typer og reducerer den tid, det tager at søge efter et HLA-kompatibelt transplantat til allogen transplantation. Samtidig reduceres risikoen for at udvikle visse latente infektioner, der overføres via smitsomme kanaler, betydeligt. Derudover opstår en billig form for biologisk livsforsikring på grund af muligheden for at bruge navlestrengsblodceller til autolog transplantation.

På grund af de små mængder blod, der kan opsamles fra moderkagen (i gennemsnit ikke mere end 100 ml), træder problemet med at opnå den maksimalt mulige mængde blod fra navlestrengsvenen i forgrunden, samtidig med at man nøje overholder betingelsen om minimal risiko for bakteriel kontaminering af de opnåede navlestrengsblodprøver.

Primitive hæmatopoietiske celler fra navlestrengsblod identificeres normalt ved tilstedeværelsen af CD34-glycophosphoproteinet på deres overflade, samt baseret på deres funktionelle egenskaber ved at studere klonogenicitet eller kolonidannelse in vitro. Sammenlignende analyse viste, at det maksimale indhold af CD34-positive celler i den mononukleære fraktion i navlestrengsblod og knoglemarv er henholdsvis 1,6 og 5,0%, det maksimale niveau af kolonidannende enheder i CD34+ cellesubpopulationen er 80 og 25%, den samlede kloningseffektivitet af CD34+ celler er 88 og 58%, det maksimale indhold af kolonidannende celler med højt proliferationspotentiale (HPP-CFC i CD34+ populationen) er 50 og 6,5%. Det skal tilføjes, at effektiviteten af kloning af CD34+CD38 celler og evnen til at reagere på cytokinstimulering også er højere i hæmatopoietiske stamceller fra navlestrengsblod.

Kombinationen af fænotypiske antigenerne Thy-1, CD34 og CD45RA bekræfter det høje proliferative potentiale hos hæmatopoietiske celler fra navlestrengsblod, og ekspressionen af disse tre antigener på overfladen af navlestrengsblodceller indikerer deres tilhørsforhold til stamceller. Derudover blev det fundet, at navlestrengsblod indeholder celler med CD34+ fænotypen, som ikke har markører for lineær differentiering. Niveauet af cellulære subpopulationer med den fænotypiske profil CD34+/Lin i navlestrengsblod er omkring 1% af det samlede antal CD34-positive celler. Hæmatopoietiske progenitorceller fra navlestrengsblod giver anledning til både den lymfoide cellelinje og den pluripotente myeloide serie af lineær celledifferentiering, hvilket også indikerer deres tilhørsforhold til stamceller.

Som allerede nævnt ligger betydelige forskelle mellem knoglemarv og navlestrengsblod i mængden af hæmatopoietiske celler, der anvendes til transplantation, og som opnås under én indsamlingsprocedure. Hvis tabet af cellemasse under separation, kryopræservering, optøning og testning under knoglemarvstransplantation er acceptabelt inden for 40-50%, er sådanne celletab for navlestrengsblod meget betydelige, da transplantationen kan vise sig ineffektiv, hvis der anvendes en utilstrækkelig mængde HSC. Ifølge G. Kogler et al. (1998) kan alle navlestrengsblodprøver ved celletransplantation med en recipients kropsvægt på 10 kg være potentielle transplantater (det samlede antal indsamlede navlestrengsblodprøver er 2098), med en kropsvægt på 35 kg - 67%, og kun 25% af prøverne kan give effektiv transplantation hos patienter med en kropsvægt på 50-70 kg. Denne kliniske situation indikerer behovet for at optimere og forbedre effektiviteten af eksisterende metoder til indsamling, reproduktion og opbevaring af navlestrengsblodceller. Derfor diskuteres der i litteraturen i øjeblikket bredt spørgsmålene om standardisering af metoder til indsamling, testning, separation og kryopræservering af navlestrengsblod med henblik på at oprette blodbanker, dets anvendelse i klinikken og fastsætter også betingelserne og vilkårene for opbevaring af hæmatopoietiske stamceller fra navlestrengsblod.

[ 7 ], [ 8 ], [ 9 ]

Brug af hæmatopoietiske stamceller fra navlestrengsblod i medicin

^{Normalt er det muligt at isolere op til 10⁶} hæmatopoietiske stamceller fra navlestrengsblod, sjældent mere. I denne henseende er spørgsmålet om, hvorvidt en sådan mængde hæmatopoietiske celler fra navlestrengsblod er tilstrækkelig til at genoprette hæmatopoiesen hos en voksen patient, stadig åbent. Meningerne om dette spørgsmål er delte. Nogle forskere mener, at en sådan mængde er fuldt ud tilstrækkelig til transplantation til børn, men for lidt til transplantation til en voksen, for hvem den optimale mængde er introduktion af (7-10) x 10⁶ ^CD34 -positive celler pr. 1 kg kropsvægt - et gennemsnit på 7 x 10⁶ ^pr. transplantation. Ud fra disse beregninger følger det, at én prøve navlestrengsblod indeholder 700 gange færre hæmatopoietiske stamceller, end der kræves til én transplantation til en voksen patient. En sådan kvantitativ vurdering foretages imidlertid analogt med antallet af transfunderede knoglemarvsceller og tager slet ikke højde for de ontogenetiske træk ved hæmatopoiesen.

Især ignoreres det faktum, at hæmatopoietiske stamceller fra navlestrengsblod har et højere proliferationspotentiale sammenlignet med hæmatopoietiske progenitorceller fra knoglemarv. Resultaterne af in vitro-studier af kolonidannende potentiale tyder på, at én dosis navlestrengsblod er i stand til at genoprette hæmatopoiese hos voksne recipienter. På den anden side bør det ikke glemmes, at antallet af stamceller fra navlestrengsblod falder selv under embryonisk udvikling: indholdet af CD34-positive celler i navlestrengsblod falder lineært med 5 gange i perioden fra 20 uger (blod til undersøgelsen blev taget under for tidlig graviditetsafbrydelse) til 40 ugers gestationsalder (perioden med fysiologisk fødsel), hvilket ledsages af en parallel, permanent stigende ekspression af lineære cytodifferentieringsmarkører.

På grund af manglen på en standardiseret tilgang til kvantitativ bestemmelse af progenitorceller i navlestrengsblodprøver fortsætter debatten om den optimale dosis af hæmatopoietiske stamceller fra navlestrengsblod. Nogle forskere mener, at antallet af kerneholdige celler og mononukleære celler, der er genberegnet i forhold til modtagerens kropsvægt, dvs. deres dosis, kan bruges som kriterium for udvælgelse af navlestrengsblodprøver. Nogle forfattere mener, at den minimale kvantitative tærskelværdi for CD34+ celler, selv for autotransplantation af HSC'er, er 2 x 10 ⁶ /kg. Samtidig sikrer en stigning i dosis af hæmatopoietiske celler til 5 x 10 ⁶ celler/kg (kun 2,5 gange) allerede et mere gunstigt forløb af den tidlige periode efter transplantation, reducerer forekomsten af infektiøse komplikationer og forkorter varigheden af forebyggende antibiotikabehandling.

Ifølge E. Gluckman et al. (1998) er betingelsen for vellykket navlestrengsblodcelletransplantation inden for onkohæmatologi introduktionen af mindst 3,7 x 107 ^kerneholdige celler pr. 1 kg recipientens kropsvægt. Når dosis af hæmatopoietiske stamceller reduceres til 1 x 107 ^eller færre kerneholdige celler pr. 1 kg patientens kropsvægt, stiger risikoen for transplantationssvigt og tilbagefald af blodkræft kraftigt. Det skal erkendes, at det minimale antal progenitorceller, der er nødvendigt for hurtig genoprettelse af hæmatopoiesen efter allotransplantation af HSC'er, stadig er ukendt. Teoretisk set kan dette opnås ved hjælp af én celle, men i klinisk praksis for knoglemarvstransplantation garanteres hurtig og stabil engraftment ved transfusion af mindst (1-3) x 108 ^kerneholdige celler pr. 1 kg patientens kropsvægt.

En nylig detaljeret undersøgelse for at bestemme det optimale antal HSC'er i onkohæmatologi omfattede observation af patienter i tre grupper, fordelt afhængigt af indholdet af CD34-positive celler i det transplanterede materiale. Patienter i den første gruppe fik administreret (3-5) x 10⁶ ^celler /kg. HSC-dosis hos patienter i den anden gruppe var (5-10) x 10⁶ ^celler /kg, og patienter i den tredje gruppe fik transplanteret mere end 10 x 10⁶ ^CD34 + celler/kg. De bedste resultater blev observeret i gruppen af modtagere, der modtog en transplantation med et antal CD34-positive celler lig med (3-5) x 10⁶ ^/ kg. Ved en stigning i dosis af transplanterede celler over 5 x 10⁶ ^/ kg blev der ikke påvist statistisk signifikante fordele. I dette tilfælde er et meget højt indhold af HSC'er i transplantatet (> 10 x 10⁶ ^/ kg) forbundet med reinfusion af et betydeligt antal resterende tumorceller, hvilket fører til tilbagefald af sygdommen. En direkte sammenhæng mellem antallet af transplanterede allogene progenitorceller og udviklingen af graft-versus-host-reaktionen er ikke blevet fastslået.

Den akkumulerede verdenserfaring med navlestrengsblodtransplantationer bekræfter deres høje potentiale for repopulation. Indpodningshastigheden for navlestrengsblodtransplantationer korrelerer med antallet af introducerede kerneholdige celler. De bedste resultater observeres ved transplantation på 3 x 107 ^/ kg, mens denne dosis for knoglemarv er 2 x 108 ^/ kg. Ifølge data fra koordinerende centre blev der ved udgangen af 2000 udført 1200 navlestrengsblodcelletransplantationer på verdensplan, hovedsageligt fra beslægtede donorer (83%). Det er indlysende, at navlestrengsblod bør overvejes som et alternativ til knoglemarv til transplantation til patienter med hæmoblastoser.

Samtidig inspirerer den neonatale karakter af navlestrengskilden til hæmatopoietisk væv optimisme på grund af tilstedeværelsen af funktionelle træk ved dens HSC. Samtidig kan kun klinisk erfaring besvare spørgsmålet om, hvorvidt én navlestrengsblodprøve er tilstrækkelig til at genoprette hæmatopoiesen hos en voksen modtager med hæmatopoietisk aplasi. Transplantation af navlestrengsblodceller anvendes i behandlingsprogrammer for mange tumor- og ikke-tumorsygdomme: leukæmi og myelodysplastiske syndromer, non-Hodgkins lymfom og neuroblastom, aplastisk anæmi, medfødte Fanconi- og Diamond-Blackfan-anæmier, leukocytadhæsionsdefekt, Barr syndrom, Gunthers sygdom, Hurlers syndrom, thalassæmi.

Immunologiske aspekter af transplantation af hæmatopoietiske celler fra navlestrengsblod fortjener nøje opmærksomhed og en separat undersøgelse. Det har vist sig, at i tilfælde af transplantation af navlestrengsblodstamceller fra donorer med ufuldstændig HLA-kompatibilitet er transplantationsresultaterne ret tilfredsstillende, hvilket ifølge forfatterne indikerer en lavere immunreaktivitet af navlestrengsblodceller end knoglemarv.

En detaljeret undersøgelse af den cellulære sammensætning af navlestrengsblod afslørede træk ved både det fænotypiske spektrum af immunsystemets effektorceller og deres funktionelle aktivitet, hvilket gjorde det muligt at betragte navlestrengsblod som en kilde til HSC'er med en relativt lav risiko for at udvikle en 'graft versus host'-reaktion. Blandt tegnene på funktionel umodenhed af immunkompetente celler i navlestrengsblod er det nødvendigt at bemærke ubalancen i produktionen af cytokiner og et fald i følsomheden over for cytokinregulering af immunresponset. Den resulterende hæmning af aktiviteten af cytotoksiske lymfocytter betragtes som en faktor, der bidrager til dannelsen af immunologisk tolerance over for det transplanterede hæmatopoietiske væv. I populationen af lymfocytter fra navlestrengsblod dominerer inaktive, umodne lymfocytter og suppressorceller i modsætning til det perifere blod og knoglemarv hos voksne donorer. Dette indikerer en reduceret parathed hos T-lymfocytter fra navlestrengsblod til et immunrespons. Et vigtigt træk ved den monocytiske population af navlestrengsblodceller er det lave indhold af funktionelt fuldgyldige og aktive antigenpræsenterende celler.

På den ene side udvider den lave modenhed af immunsystemets effektorceller i navlestrengsblod indikationerne for dets anvendelse i klinikken, da disse egenskaber giver et fald i intensiteten af immunkonflikten mellem donor- og recipientceller. Men på den anden side er det kendt om eksistensen af en korrelation mellem graden af udvikling af "graft versus host"-reaktionen og antitumoreffekten af transplantation, dvs. udviklingen af "graft versus leukæmi"-effekten. I denne forbindelse blev der udført en undersøgelse af antitumorcytotoksiciteten af navlestrengsblodceller. De opnåede resultater indikerer, at på trods af den virkelig svækkede respons hos immunkompetente navlestrengsblodceller på antigenstimulering, er de lymfocytter, der primært aktiveres, naturlige dræbere og dræberlignende celler, der tager en aktiv rolle i mekanismerne for implementering af antitumorcytotoksicitet. Derudover blev der fundet subpopulationer af lymfocytter med CD16+CD56+ og CD16"TCRa/p+ fænotyper i navlestrengsblod. Det antages, at disse celler i deres aktiverede form implementerer "graft versus leukæmi"-reaktionen.

På Institut for Onkologi ved Det Ukraines Akademi for Medicinske Videnskaber blev kryopræserverede hæmatopoietiske celler fra navlestrengsblod administreret til kræftpatienter med vedvarende hæmatopoietisk hypoplasi på grund af kemo- og strålebehandling. Hos sådanne patienter genoprettede transplantation af hæmatopoietiske stamceller fra navlestrengsblod ret effektivt den nedsatte hæmatopoiese, hvilket fremgår af en vedvarende stigning i indholdet af modne dannede elementer i det perifere blod, samt en stigning i de indikatorer, der karakteriserer tilstanden af cellulær og humoral immunitet. Stabiliteten af repopulationseffekten efter transplantation af hæmatopoietiske celler fra navlestrengsblod muliggør fortsat strålebehandling og kemoterapi uden at afbryde behandlingsforløbet. Der er information om en højere effektivitet af allotransplantation af stamceller fra navlestrengsblod til onkohæmatologiske patienter: den årlige risiko for tilbagefald af en tumorsygdom ved deres anvendelse var 25% versus 40% hos patienter med transplanteret allogen knoglemarv.

Virkningsmekanismen for kryopræserverede stamceller fra navlestrengsblod bør betragtes som et resultat af humoral stimulering af recipientens hæmatopoiese forårsaget af neonatale cellers unikke evne til autokrin produktion af hæmatopoietiske vækstfaktorer, samt en konsekvens af midlertidig indpodning af donorceller (som det fremgår af en pålidelig stigning i indholdet af føtalt hæmoglobin i recipienternes perifere blod på 7.-15. dag efter transfusion sammenlignet med de oprindelige data). Fraværet af posttransfusionsreaktioner hos recipienter af navlestrengsblod er et resultat af den relative tolerance over for dets immunkompetente celler, samt et konfidenskriterium for den biologiske tilstrækkelighed af det kryopræserverede materiale.

T-lymfocyt-dræberprogenitorceller fra navlestrengsblod er i stand til at aktiveres under påvirkning af eksogen cytokinstimulering, hvilket bruges til at udvikle nye ex vivo- og in vivo-metoder til at inducere antitumorcytotoksicitet af transplanterede lymfoide elementer til efterfølgende immunterapi. Derudover tillader "umodenheden" af genomet af immunkompetente celler fra navlestrengsblod, at de kan bruges til at forstærke antitumoraktivitet ved hjælp af molekylære modelleringsmetoder.

I dag har navlestrengsblod fundet bred anvendelse, primært inden for pædiatrisk hæmatologi. Hos børn med akut leukæmi reducerer allotransplantation af hæmatopoietiske stamceller fra navlestrengsblod, sammenlignet med allotransplantation af knoglemarv, signifikant forekomsten af graft-versus-host-sygdom. Dette ledsages dog af en længere periode med neutro- og trombocytopeni og desværre en højere dødelighed 100 dage efter transplantation. En længere periode med genopretning af granulocyt- og blodpladeniveauer i det perifere blod kan skyldes utilstrækkelig differentiering af individuelle subpopulationer af CD34-positive navlestrengsblodceller, hvilket fremgår af det lave niveau af absorption af radioaktivt rhodamin og lav ekspression af CD38-antigener på deres overflade.

Samtidig viste transplantation af hæmatopoietiske stamceller fra navlestrengsblod til voksne patienter, udført på grund af fraværet af både en kompatibel, ubeslægtet knoglemarvsdonor og muligheden for at mobilisere autologe HSC'er, en høj etårig tilbagefaldsfri overlevelse i gruppen af patienter under 30 år (73%). En udvidelse af aldersgruppen for modtagere (18-46 år) førte til et fald i overlevelsen til 53%.

Kvantitativ analyse af celler med CD34+ fænotypen i knoglemarv og navlestrengsblod afslørede deres højere (3,5 gange) indhold i knoglemarv, men en signifikant overvægt af celler med den fænotypiske profil CD34+HLA-DR blev observeret i navlestrengsblod. Det er kendt, at blodceller med de immunologiske markører CD34+HLA-DR prolifererer mere aktivt end celler med immunfænotypen CD34+HLA-DR+, hvilket blev bekræftet i eksperimentelle undersøgelser af væksten af langvarig hæmatopoietisk cellekultur in vitro. Primitive celleforløbere med CD34+CD38 fænotypen findes både i navlestrengsblod og knoglemarv, men navlestrengsblodceller med markørsættet CD34+CD38 har en højere klonogen aktivitet end hæmatopoietiske celler af samme fænotype isoleret fra knoglemarv fra voksne donorer. Derudover prolifererer navlestrengsblodceller med CD34+CD38-immunofænotypen hurtigere som reaktion på cytokinstimulering (IL-3, IL-6, G-CSF) og producerer 7 gange flere kolonier i langtidskulturer end knoglemarvsceller.

Navlestrengsblodstamcellebanker

For at kunne udvikle et nyt område inden for praktisk medicin - navlestrengsblodstamcelletransplantation - samt for at kunne implementere hæmatopoietiske stamcelletransplantationer fra knoglemarv er det nødvendigt at have et omfattende netværk af blodbanker, som allerede er oprettet i USA og Europa. De nationale netværk af navlestrengsblodbanker er forenet af Netcord Bank Association. Hensigtsmæssigheden af at oprette en international sammenslutning af navlestrengsblodbanker skyldes, at der er behov for et stort antal typede navlestrengsblodprøver for at udføre uafhængige transplantationer, hvilket muliggør udvælgelse af en HLA-identisk donor. Kun etableringen af et system af banker med opbevaring af blodprøver af forskellige HLA-typer kan virkelig løse problemet med at finde den nødvendige donor. Organiseringen af et sådant navlestrengsblodbanksystem kræver en forudgående udvikling af etiske og juridiske normer, som i øjeblikket diskuteres på internationalt plan.

For at oprette navlestrengsblodbanker i Ukraine skal en hel række regler og dokumenter udarbejdes.

Først og fremmest drejer det sig om standardisering af metoder til indsamling, fraktionering og frysning af navlesnorsblod. Det er nødvendigt at regulere reglerne for indsamling af navlesnorsblod på fødeklinikker i overensstemmelse med kravene i medicinsk etik for at bestemme den minimumsmængde navlesnorsblod, der sikrer en vellykket transplantation. Det er nødvendigt at sammenligne og standardisere forskellige kriterier for vurdering af kvaliteten og mængden af hæmatopoietiske stamceller, samt HLA-typningsmetoder og diagnostiske metoder til genetiske og infektionssygdomme, der kan overføres under infusion af navlesnorsblodceller, for at etablere fælles kriterier for udvælgelse af raske donorer. Det er også værd at diskutere spørgsmålene om at oprette separate opbevaringsfaciliteter for serum, celler og DNA opnået fra navlesnorsblod.

Det er absolut nødvendigt at organisere et computernetværk af navlestrengsbloddata, der skal forbindes med knoglemarvsdonorregistre. For yderligere udvikling af celletransplantation er det nødvendigt at udvikle særlige protokoller til sammenligning af resultaterne af navlestrengsblod- og knoglemarvstransplantation fra HLA-identiske slægtninge og ubeslægtede donorer. Standardisering af dokumentation, herunder informeret samtykke fra forældre, samt underretning af moderen eller slægtninge om genetiske og/eller infektionssygdomme, der opdages hos barnet, kan bidrage til at løse de etiske og juridiske problemer ved klinisk brug af navlestrengsblodceller.

Den afgørende betingelse for udviklingen af celletransplantation i Ukraine vil være vedtagelsen af det nationale stamcelledonationsprogram og udviklingen af internationalt samarbejde med andre lande gennem World Marrow Donor Association (WMDA), det amerikanske nationale marrowdonorprogram (NMDP) og andre registre.

I en opsummering af den stadig korte historie om udviklingen af hæmatopoietisk stamcelletransplantation fra navlestrengsblod bemærker vi, at de første antagelser om muligheden for at bruge navlestrengsblod i en klinik, udtrykt tilbage i begyndelsen af 70'erne, blev bekræftet i 80'erne af resultaterne af eksperimentelle dyrestudier, og i 1988 blev verdens første transplantation af hæmatopoietiske celler fra navlestrengsblod til et menneske udført, hvorefter et globalt netværk af navlestrengsblodbanker begyndte at blive oprettet. På 10 år nærmede antallet af patienter med transplanterede hæmatopoietiske celler fra navlestrengsblod sig 800. Blandt dem var patienter med forskellige sygdomme af tumor- (leukæmi, lymfom, solide tumorer) og ikke-tumor- (medfødte immundefekter, anæmi, sygdomme forbundet med stofskifteforstyrrelser) natur.

Indholdet af tidlige og engagerede celleforløbere i navlestrengsblod er højere end i det perifere blod hos en voksen. Med hensyn til antallet af granulocyt-makrofag-kolonidannende enheder og deres proliferative potentiale overstiger navlestrengsblod betydeligt det perifere blod hos voksne, selv efter introduktion af vækstfaktorer. I langvarige cellekulturer in vitro er der observeret større proliferativ aktivitet og levedygtighed af navlestrengsblodceller end knoglemarvsceller. Kritiske øjeblikke i transplantation af navlestrengsblodstamceller er antallet og det hæmatopoietiske potentiale af kerneholdige celler, tilstedeværelsen af cytomegalovirusinfektion, HLA-kompatibilitet hos donor og recipient, patientens kropsvægt og alder.

Transplantation af navlestrengsblodstamceller bør dog overvejes som et alternativ til knoglemarvstransplantation til behandling af alvorlige blodsygdomme, primært hos børn. Kliniske problemer ved transplantation af navlestrengsblodceller bliver gradvist løst - der findes allerede ret effektive metoder til indsamling, separation og kryopræservering af navlestrengsblodceller, der skabes betingelser for dannelse af navlestrengsblodbanker, og metoder til test af kerneholdige celler forbedres. 3% gelatineopløsning og 6% hydroxyethylstivelsesopløsning bør betragtes som optimale til separation under storstilet indkøb af hæmatopoietiske stamceller fra navlestrengsblod ved oprettelse af banker.

P. Perekhrestenko og medforfattere (2001) bemærker med rette, at transplantation af navlestrengsblodstamceller bør indtage sin retmæssige plads i komplekset af terapeutiske foranstaltninger til at overvinde hæmatopoietiske depressioner af forskellig oprindelse, da navlestrengsblodstamceller har en række betydelige fordele, hvoraf de vigtigste er den relative enkelhed i deres anskaffelse, fraværet af risiko for donoren, lav kontaminering af neonatale celler med vira og de forholdsvis lave transplantationsomkostninger. Nogle forfattere påpeger, at transplantation af navlestrengsblodcelle sjældnere ledsages af komplikationer forbundet med graft-versus-host-reaktionen end knoglemarvscelletransplantation, hvilket efter deres mening skyldes den svage ekspression af HLA-DR-antigener på navlestrengsblodceller og deres umodenhed. Hovedpopulationen af kerneholdige celler i navlestrengsblod er dog T-lymfocytter (CD3-positive celler), hvis indhold er omkring 50%, hvilket er 20% mindre end i det perifere blod hos en voksen, men de fænotypiske forskelle i T-cellesubpopulationer fra disse kilder er ubetydelige.

Blandt de faktorer, der direkte påvirker overlevelsesraten ved transplantation af navlestrengsblodstamceller, er det værd at bemærke patienternes alder (de bedste resultater observeres hos modtagere i alderen et til fem år), tidlig diagnose af sygdommen og leukæmiens form (effektiviteten er betydeligt højere ved akut leukæmi). Af stor betydning er dosis af nukleerede navlestrengsblodceller samt deres HLA-kompatibilitet med modtageren. Det er ikke tilfældigt, at analysen af den kliniske effektivitet af transplantation af navlestrengsblodstamceller i onkohæmatologi viser de bedste behandlingsresultater ved anvendelse af relaterede transplantationer: den etårige tilbagefaldsfri overlevelse når i dette tilfælde 63%, mens den ved ikke-relateret transplantation kun er 29%.

Tilstedeværelsen af et stort antal stamceller i navlestrengsblod og den høje repopulationskapacitet af neonatale hæmatopoietiske stamceller gør det således muligt at anvende dem til allogen transplantation hos onkohæmatologiske patienter. Det skal dog bemærkes, at rekapituleringen af hæmatopoiese efter transplantation af hæmatopoietiske celler fra navlestrengsblod "strækkes ud i tid": genoprettelse af neutrofilindholdet i det perifere blod observeres normalt ved udgangen af den 6. uge, og trombocytopeni forsvinder normalt efter 6 måneder. Derudover udelukker umodenheden af hæmatopoietiske celler fra navlestrengsblod ikke immunologiske konflikter: alvorlig akut og kronisk graft-versus-host-sygdom observeres hos henholdsvis 23 og 25% af modtagerne. Tilbagefald af akut leukæmi ved udgangen af det første år efter transplantation af navlestrengsblod observeres i 26% af tilfældene.

[ 10 ], [ 11 ]