Mesenkymale stamceller

Blandt regionale stamceller indtager mesenkymale stamceller (MSC'er) en særlig plads, hvis derivater udgør den stromale matrix i alle organer og væv i menneskekroppen. Prioritet i MSC-forskning tilhører repræsentanter for russisk biologisk videnskab.

I midten af det sidste århundrede blev en homogen kultur af multipotente stromale stamceller fra knoglemarv for første gang isoleret i A. Friedensteins laboratorium. Mesenkymale stamceller bundet til substratet opretholdt høj proliferationsintensitet i lang tid, og i kulturer med lav såtæthed efter fiksering på substratet dannede de kloner af fibroblastlignende celler, der ikke havde fagocytisk aktivitet. Ophøret af MSC-proliferation sluttede med deres spontane differentiering in vitro til celler af knogle, fedt, brusk, muskel eller bindevæv. Yderligere undersøgelser gjorde det muligt at fastslå det osteogene potentiale af fibroblastlignende celler i knoglemarvsstroma fra forskellige pattedyrarter, såvel som deres kolonidannende aktivitet. In vivo-eksperimenter har vist, at både hetero- og ortotopisk transplantation af kolonidannende fibroblastlignende celler resulterer i dannelsen af knogle-, brusk-, fibrøst og fedtvæv. Da stromale stamceller fra knoglemarv er karakteriseret ved en høj kapacitet til selvfornyelse og multifacetteret differentiering inden for en enkelt cellelinje, kaldes de multipotente mesenkymale progenitorceller.

Det skal bemærkes, at over 45 års grundlæggende forskning i mesenkymale stamceller er skabt reelle betingelser for anvendelsen af deres derivater i klinisk praksis.

I dag er der ingen tvivl om, at alt væv i menneskekroppen er dannet af stamceller fra forskellige cellelinjer som følge af processerne proliferation, migration, differentiering og modning. Indtil for nylig troede man dog, at stamceller i en voksen organisme er vævsspecifikke, dvs. i stand til kun at producere linjer af specialiserede celler fra de væv, hvori de befinder sig. Denne konceptuelle position blev afkræftet af fakta om transformation af hæmatopoietiske stamceller ikke kun til cellulære elementer i perifert blod, men også til ovale celler i leveren. Derudover viste neurale stamceller sig at være i stand til at give anledning til både neuroner og gliale elementer, såvel som tidlige dedikerede linjer af hæmatopoietiske progenitorceller. Til gengæld er mesenkymale stamceller, som normalt producerer cellulære elementer af knogle, brusk og fedtvæv, i stand til at transformere til neurale stamceller. Det antages, at der i vækstprocessen, fysiologisk og reparativ vævsregenerering, genereres udedikerede progenitorceller fra vævs-uspecifikke stamreserver. For eksempel kan reparation af muskelvæv realiseres på grund af mesenkymale stamceller, der migrerer fra knoglemarv til skeletmuskler.

Selvom en sådan krydsudskiftelighed af stamceller ikke anerkendes af alle forskere, er muligheden for klinisk anvendelse af mesenkymale stamceller som kilde til celletransplantation og en cellulær vektor for genetisk information ikke længere bestridt af nogen, ligesom multipotensen af knoglemarvsstromale stamceller, som relativt let kan isoleres og udvides in vitro-kultur. Samtidig fortsætter rapporter om den potentielle pluripotens af knoglemarvsstromale stamceller med at dukke op i den videnskabelige litteratur. Som bevis citeres forskningsprotokoller, hvor MSC'er under påvirkning af specifikke transdifferentieringsinduktorer transformeres til nerveceller, kardiomyocytter og hepatocytter. Nogle forskere har dog alvorlig tvivl om muligheden for gentagen aktivering og ekspression af gener fra perioden med tidlig embryogenese. Samtidig forstår alle, at hvis der findes betingelser for at udvide multipotensen af mesenkymale stamceller til ESC'ers pluripotens, vil mange etiske, moralske, religiøse og juridiske problemer inden for regenerativ plastisk medicin automatisk blive løst. Da kilden til regenerativt stamcellepotentiale i dette tilfælde desuden bliver patientens autologe stromale celler, er problemet med immunafstødning af celletransplantationen også løst. Den nærmeste fremtid vil vise, hvor realistiske disse udsigter er.

[ 1 ], [ 2 ]

Brug af mesenkymale stamceller i medicin

I klinikken er brugen af mesenkymale stamcellederivater primært forbundet med restaurering af vævsdefekter, der opstår ved omfattende og dybe termiske hudlæsioner. I den prækliniske fase blev der udført en eksperimentel vurdering af muligheden for at anvende allogene fibroblastlignende mesenkymale stamceller til behandling af dybe forbrændinger. Det blev vist, at knoglemarvsfibroblastlignende mesenkymale stamceller danner et monolag i kultur, hvilket gør det muligt at transplantere dem for at optimere regenereringsprocesserne i dybe forbrændingssår. Forfatterne bemærker, at embryonale fibroblaster har en lignende egenskab, men deres kliniske anvendelse er begrænset af eksisterende etiske og juridiske problemer. En dyb termisk forbrænding med skade på alle hudlag blev modelleret på Wistar-rotter. Forbrændingsområdet var 18-20% af den samlede hudoverflade. Den første forsøgsgruppe omfattede rotter med en dyb termisk forbrænding og transplantation af allogene fibroblastlignende mesenkymale stamceller. Den anden gruppe bestod af dyr med en dyb termisk forbrænding og transplantation af allogene embryonale fibroblaster. Den tredje gruppe bestod af kontrolrotter med en dyb termisk forbrænding, der ikke havde gennemgået celleterapi. En suspension af fibroblastlignende mesenkymale stamceller og embryonale fibroblaster blev påført overfladen af forbrændingssåret ved hjælp af en pipette i en mængde på 2 x 104 ^.celler på 2. dagen efter modellering af brandsår og fjernelse af den resulterende nekrotiske skorpe. Efter celletransplantation blev brandsårsoverfladen dækket med en gazebind fugtet med isotonisk natriumchloridopløsning med gentamicin. Knoglemarvsceller blev indsamlet for at opnå MSC'er med efterfølgende induktion i en linje af fibroblastlignende mesenkymale stamceller fra voksne Wistar-rotter fra lårben. Embryonale fibroblaster blev udtaget fra lungerne af 14-17 dage gamle embryoner. Embryonale fibroblaster og knoglemarvsceller til opnåelse af MSC'er blev præliminært dyrket i petriskåle ved en temperatur på 37°C i en CO2-inkubator i en atmosfære med 5% CO2 ved 95% luftfugtighed. Embryonale fibroblaster blev dyrket i 4-6 dage, mens dannelsen af et monolag af MSC'er krævede 14 til 17 dage. Efterfølgende blev MSC'er kryopræserveret som kildemateriale til fibroblastlignende mesenkymale stamceller, som blev opnået ved optøning og dyrkning af MSC'er i 4 dage. Antallet af dannede fibroblastlignende mesenkymale stamceller var mere end 3 gange højere end antallet af embryonale fibroblaster dannet i samme dyrkningsperiode. For at identificere de transplanterede celler i brandsår i dyrkningsfasen blev deres genom mærket ved hjælp af en viral shuttle-vektor baseret på rekombinant adenovirus type V, der bærer 1ac-2-genet, der koder for E. coli ß-galactosidase. Levende celler på forskellige tidspunkter efter transplantation blev detekteret immunhistokemisk i kryosnit med tilsætning af X-Gal-substrat, hvilket giver en karakteristisk blågrøn farvning. Som et resultat af dynamisk visuel, planimetrisk og histologisk vurdering af brandsårets tilstand blev det fastslået, at allerede på den 3. dag efter celletransplantation viste der sig signifikante forskelle i sårprocessens forløb i de udvalgte grupper. Denne forskel blev især tydelig på den 7. dag efter celletransplantation. Hos dyrene i den første gruppe, hvortil fibroblastlignende mesenkymale stamceller blev transplanteret, fik såret en ensartet intens lyserød farve, granulationsvæv voksede over hele sit område til epidermisniveau, og brandsårsoverfladen mindskedes betydeligt i størrelse. Kollagenfilmen dannet på såroverfladen blev noget tyndere, men den fortsatte med at dække hele brandsårsområdet. Hos dyrene i den anden gruppe, hvortil embryonale fibroblaster blev transplanteret, steg granulationsvævet til epidermisniveauet ved sårkanterne, men kun steder, mens plasmorré fra såret var mere intens end i den første gruppe, og den oprindeligt dannede kollagenfilm forsvandt praktisk talt. Hos dyr, der ikke modtog celleterapi, var brandsåret på den 7. dag blegt, hullet, nekrotisk væv dækket af fibrin. Plasmorea blev observeret over hele brandsårsoverfladen. Histologisk viste dyrene i den første og anden gruppe et fald i cellulær infiltration og udvikling af det vaskulære netværk.og disse tegn på den begyndende regenerative proces var mere udtalte hos rotterne i den 1. gruppe. I kontrolgruppen blev der observeret tegn på cellulær infiltration af såret, det histologiske mønster af nydannede kar var fraværende. På observationsdagen 15.-30. var arealet af brandsårsoverfladen hos dyrene i den 1. gruppe signifikant mindre end hos rotterne i de andre grupper, og den granulerende overflade var mere udviklet. Hos dyrene i den 2. gruppe faldt arealet af brandsårsoverfladen også sammenlignet med størrelsen af brandsår hos rotterne i kontrolgruppen, hvilket opstod på grund af marginal epitelisering. I kontrolgruppen forblev brandsårsoverfladen bleg steder med sjældne granuleringer, vaskulære stjerner dukkede op på den, der var øer af fibrinøs plak, moderat plasmorré fortsatte over hele brandsårsoverfladen, og en skorpe, der var vanskelig at adskille, forblev nogle steder. Generelt faldt sårets størrelse også hos dyrene i den 3. gruppe, men sårets kanter forblev underminerede.

Under en sammenlignende undersøgelse af sårhelingshastigheden ved brug af fibroblastlignende mesenkymale stamceller og embryonale fibroblaster, såvel som uden brug af celleterapi, blev der således observeret en acceleration af helingshastigheden af brandsårsoverfladen som følge af transplantation af fibroblastlignende mesenkymale stamceller og embryonale fibroblaster. I tilfælde af brug af allogene fibroblastlignende mesenkymale stamceller var sårhelingshastigheden imidlertid højere end ved transplantation af embryonale fibroblaster. Dette kom til udtryk i en acceleration af faseskiftet i den regenerative proces - betingelserne for cellulær infiltration blev reduceret, hastigheden for vaskulær netværksvækst steg, såvel som dannelsen af granulationsvæv.

Resultaterne af dynamisk planimetri indikerer, at hastigheden for spontan heling af brandsåret (uden brug af celleterapi) var den laveste. På den 15. og 30. dag efter transplantation af allogene fibroblastlignende mesenkymale stamceller var hastigheden for sårheling højere end ved transplantation af embryonale fibroblaster. Histokemisk metode til detektering af beta-galactosidase viste, at efter transplantation af fibroblastlignende mesenkymale stamceller og embryonale fibroblaster forbliver de transplanterede celler levedygtige på overfladen og i dybden af de regenererende sår gennem hele observationsperioden. Forfatterne mener, at den højere hastighed for regenerering af brandsår ved brug af fibroblastlignende mesenkymale stamceller skyldes frigivelsen af biologisk aktive vækststimulerende faktorer fra disse celler under modningsprocessen.

Transplantation af auto- eller allogene keratinocytter og allogene fibroblaster til behandling af brandsår er også blevet anvendt i klinisk praksis. Det skal bemærkes, at kirurgisk behandling af børn med omfattende dybe forbrændinger er en kompleks opgave på grund af den høje traumatiske karakter og multiple kirurgiske indgreb, betydeligt blodtab og forskellige reaktioner på de anvendte infusionsmedier. De største vanskeligheder ved at udføre hudplastikkirurgi for omfattende dybe forbrændinger, med et areal på over 40% af kropsoverfladen, skyldes sværhedsgraden af ofrenes tilstand og manglen på donorhudressourcer. Brugen af nettransplantater med en høj perforationskoefficient løser ikke problemet, da cellerne dannet efter perforering epiteliserer meget langsomt, og selve hudflapperne ofte lyserer eller tørrer ud. Sådanne belægninger af brandsår som xenoskin, kadaverallografter, syntetiske filmbelægninger er ikke altid effektive nok, derfor udvikles nye metoder til at dække brandsårsoverflader med lag af dyrkede keratinocytter og fibroblaster. Især er der foreslået en metode til at dække brandsårsoverflader ved hjælp af dyrkede allofibroblaster, som, når de transplanteres, har en udtalt stimulerende effekt på proliferationen af epidermocytter, der er bevaret i såret ved borderline-forbrændinger, samt keratinocytter i septa af mesh-transplantater. L. Budkevich og medforfattere (2000) præsenterer resultaterne af brugen af denne metode til behandling af forbrændinger hos børn. Undersøgelsen omfattede 31 børn med termisk traume i alderen 1 år til 14 år. Hos tre børn var det samlede areal af brandsår af grad IIIA-B - IV 40%, hos 25 - 50-70%, hos yderligere tre - 71-85% af kropsoverfladen. Tidlig kirurgisk nekrektomi blev kombineret med transplantation af dyrkede allofibroblaster og autodermoplastik. Den første behandlingsfase involverede excision af nekrotisk væv, den anden fase involverede transplantation af dyrkede allofibroblaster på bærerfilm, og den tredje fase (48 timer efter transplantation af dyrkede allofibroblaster) involverede fjernelse af matrixen og autodermoplastik med hudlapper med et perforationsforhold på 1:4. Tre patienter indlagt på klinikken med svær forbrændingssygdom fik dyrkede allofibroblaster transplanteret på granulerende sår. Transplantation af dyrkede allofibroblaster blev udført én gang hos 18 børn, to gange hos 11 børn og tre gange hos to patienter. Arealet af såroverfladen dækket af cellekultur varierede fra 30 til 3500 cm2. Effektiviteten af dyrkede allofibroblaster blev vurderet ud fra den samlede procentdel af hudtransplantatindlejring, forbrændingshelingstider og antallet af dødsfald som følge af alvorligt termisk traume. Transplantatindlejring var fuldstændig hos 86% af patienterne. Delvis manglende indlejring af hudtransplantater blev observeret i 14% af tilfældene. På trods af behandlingen døde seks (19,3%) børn. Det samlede areal af hudskader i dem varierede fra 40 til 70% af kroppens overflade.Transplantation af dyrkede allofibroblaster var ikke forbundet med dødelighed ved brandsår hos nogen patienter.

Forfatterne bemærker ved analyse af behandlingsresultaterne, at tidligere dybe termiske hudskader, der dækkede 35-40% af kropsoverfladen, blev anset for at være uforenelige med livet (for yngre børn - op til 3 år - er dybe forbrændinger, der dækker 30% af kropsoverfladen, kritiske, for ældre børn - over 40% af kropsoverfladen). Ved kirurgisk nekrektomi med transplantation af dyrkede allofibroblaster og efterfølgende autodermoplastik med hudlapper med en høj perforationskoefficient, forbliver forbrændinger af IIIB-IV grad kritiske, men i øjeblikket er der udsigt til at redde selv sådanne ofres liv i mange tilfælde. Kirurgisk nekrektomi i kombination med transplantation af dyrkede allofibroblaster og autodermoplastik hos børn med dybe forbrændinger har vist sig at være særligt effektiv hos patienter med udbredte hudlæsioner med mangel på donorsteder. Aktiv kirurgisk taktik og transplantation af dyrkede allofibroblaster bidrager til hurtig stabilisering af den generelle tilstand hos sådanne patienter, et fald i antallet af infektiøse komplikationer ved brandsår, skabelse af gunstige betingelser for transplantation, en reduktion i tiden for genoprettelse af mistet hud og varigheden af indlæggelse, et fald i hyppigheden af dødelige udfald hos ofre med omfattende forbrændinger. Transplantation af dyrkede allofibroblaster med efterfølgende autodermoplastik med hudlapper muliggør således helbredelse hos børn med alvorlige forbrændinger, som tidligere blev betragtet som dødsdømte.

Det er generelt accepteret, at det primære mål med behandling af brandsår er den mest komplette og hurtige genopretning af beskadiget hud for at forhindre toksiske virkninger, infektiøse komplikationer og dehydrering. Resultaterne af brugen af dyrkede celler afhænger i høj grad af, hvor parat selve brandsåret er til transplantation. I tilfælde af transplantation af dyrkede keratinocytter på såroverfladen efter kirurgisk nekrectomi, indpodes i gennemsnit 55% (efter areal) af de transplanterede celler, hvorimod indpodningsraten ved granulerende sår falder til 15%. Derfor kræver vellykket behandling af omfattende dybe hudforbrændinger først og fremmest aktive kirurgiske taktikker. Ved brandsår af grad IIIB-IV frigøres brandsåroverfladen øjeblikkeligt for nekrotisk væv for at reducere forgiftning og antallet af komplikationer ved brandsår. Brugen af sådanne taktikker er nøglen til at reducere tiden fra det øjeblik, man får en forbrænding, til sårene lukker, og længden af indlæggelse for patienter med omfattende forbrændinger, og reducerer også antallet af dødelige udfald betydeligt.

De første rapporter om vellykket brug af dyrkede keratinocytter til at dække brandsårsoverflader dukkede op i begyndelsen af 1980'erne. Efterfølgende blev denne manipulation udført ved hjælp af lag af dyrkede keratinocytter, oftest opnået fra autoceller, langt sjældnere fra allokeratinocytter. Teknologien bag autokeratinocytoplastik tillader dog ikke oprettelse af en cellebank, mens den tid, der kræves for at producere en keratinocyttransplantation af tilstrækkeligt areal, er lang og udgør 3-4 uger. I denne periode stiger risikoen for at udvikle infektiøse og andre komplikationer ved brandsårssygdomme kraftigt, hvilket forlænger patienternes samlede opholdstid betydeligt. Derudover slår autokeratinocytter praktisk talt ikke rod, når de transplanteres på granulerende brandsår, og de høje omkostninger ved specielle vækstmedier og biologisk aktive stimulatorer af keratinocytvækst begrænser deres kliniske anvendelse betydeligt. Andre bioteknologiske metoder, såsom kollagenplastik, transplantation af kryopræserveret xenoskin og brugen af forskellige biopolymerbelægninger øger effektiviteten af behandling af omfattende overfladiske, men ikke dybe forbrændinger. Metoden til at dække såroverfladen med dyrkede fibroblaster er fundamentalt anderledes, idet fibroblaster snarere end keratinocytter anvendes som hovedkomponent i det dyrkede cellelag.

Forudsætningen for udviklingen af metoden var data om, at pericytter omkring små kar er progenitor-mesenkymale celler, der er i stand til at transformere sig til fibroblaster, der producerer mange vækstfaktorer og sikrer sårheling på grund af en stærk stimulerende effekt på proliferation og adhæsion af keratinocytter. Brugen af dyrkede fibroblaster til at lukke såroverflader afslørede straks en række betydelige fordele ved denne metode sammenlignet med brugen af dyrkede keratinocytter. Især kræver fremstilling af fibroblaster i kultur ikke brug af specielle næringsmedier og vækststimulerende midler, hvilket reducerer omkostningerne ved transplantation med mere end 10 gange sammenlignet med omkostningerne ved fremstilling af keratinocytter. Fibroblaster passiveres let, hvorunder de delvist mister overfladehistokompatibilitetsantigener, hvilket igen åbner muligheden for at bruge allogene celler til fremstilling af transplantater og oprettelse af deres banker. Den tid, der kræves for at fremstille transplantater klar til brug i en klinik, reduceres fra 3 uger (for keratinocytter) til 1-2 dage (for fibroblaster). En primær fibroblastkultur kan opnås ved at dyrke celler fra hudfragmenter taget under autodermoplastik, og cellesåningstætheden for at opnå humane fibroblast-subkulturer er kun 20 x 103 ^pr. 1 ^cm2.

For at undersøge effekten af fibroblaster og deres regulatoriske proteiner på proliferation og differentiering af keratinocytter blev der udført en sammenlignende analyse af morfologien og proliferationen af keratinocytter på substrater af kollagen type I og III, samt fibronektin i en fælles kultur med humane fibroblaster. Humane keratinocytter blev isoleret fra hudfragmenter fra patienter med forbrændinger, taget under autodermoplastik. Keratinocyt-sådensiteten var 50 x 103 celler pr. 1 cm2. Den kliniske effekt af dyrket fibroblasttransplantation blev vurderet hos 517 patienter. Alle patienter blev opdelt i to grupper: Gruppe 1 - voksne ofre med forbrændinger af IIA, B-IV grad; Gruppe 2 - børn med dybe forbrændinger af IIIB-IV grad. Evaluering af dynamikken i den strukturelle og funktionelle organisering af monolagskulturfibroblaster under hensyntagen til glycosaminoglycaners, fibronektins og kollagens rolle i regenereringsprocesserne tillod forfatterne at bestemme den 3. dag som den mest gunstige periode for brug af fibroblastkulturer til at udføre transplantationer. En undersøgelse af fibroblasters effekt på proliferation og differentiering af keratinocytter viste, at in vitro fibroblaster har en udtalt stimulerende effekt, primært på keratinocytadhæsionsprocesserne, hvilket øger antallet af hæftede celler og deres fikseringshastighed med mere end det dobbelte. Stimulering af adhæsionsprocesser ledsages af en stigning i intensiteten af DNA-syntese og niveauet af keratinocytproliferation. Derudover viste det sig, at tilstedeværelsen af fibroblaster og den ekstracellulære matrix, de danner, er en nødvendig betingelse for dannelsen af keratinocytternes tonofibrillære apparat, intercellulære forbindelser og i sidste ende for differentiering af keratinocytter og dannelsen af basalmembranen. Ved behandling af børn med dybe forbrændinger er der etableret høj klinisk effektivitet af transplantation af allofibroblastkultur, især i gruppen af patienter med omfattende hudlæsioner i tilfælde af donorstedsdefekt. En omfattende morfofunktionel undersøgelse har vist, at transplanterede fibroblaster er karakteriseret ved aktiv syntese af DNA, såvel som kollagen, fibronektin og glycosaminoglycaner, som er en del af den ekstracellulære matrix, der dannes af celler. Forfatterne peger på en høj procentdel af engraftment af transplanterede fibroblaster (op til 96%), en kraftig reduktion i tiden for deres modtagelse (inden for 24-48 timer i stedet for 2-3 uger i tilfælde af brug af keratinocytter), en betydelig acceleration af epitelisering af brandsårsoverfladen, samt en betydelig reduktion i omkostningerne (med 10 gange) teknologien til at dyrke et transplantat fra fibroblaster sammenlignet med keratinocyttransplantation. Brugen af transplantation af dyrkede allofibroblaster gør det muligt at redde livet for børn med kritiske forbrændinger - termisk skade på mere end 50% af kropsoverfladen.hvilket tidligere blev betragtet som uforeneligt med livet. Det skal bemærkes, at transplantation af allogene embryonale fibroblaster ikke blot har vist sig at kunne føre til hurtigere sårregenerering og rekonvalescens hos patienter med varierende grader og områder af forbrændinger, men også at der er sket en betydelig reduktion i deres dødelighed.

Autologe fibroblaster anvendes også inden for et så komplekst område af plastikkirurgi som rekonstruktiv korrektion af stemmebåndsskader. Til dette formål anvendes normalt bovint kollagen, hvis virkningsvarighed er begrænset af dets immunogenicitet. Da bovint kollagen er et fremmed protein, er det følsomt over for recipientens kollagenase og kan forårsage immunreaktioner. For at reducere risikoen for dette er der udviklet teknologier til at opnå kollagenpræparater tværbundet med glutaraldehyd. Deres fordel ligger i større stabilitet og lavere immunogenicitet, hvilket har fundet praktisk anvendelse til at eliminere defekter og atrofi af stemmebåndene. Injektioner af autologt kollagen blev første gang brugt i 1995. Teknikken sikrede bevarelsen af den primære struktur af autologe kollagenfibre, herunder intramolekylære enzymatisk katalyserede tværbindinger. Faktum er, at naturlige kollagenfibre er mere modstandsdygtige over for ødelæggelse af proteaser end rekonstitueret kollagen, hvor telopeptiderne er skåret. Telopeptidernes integritet er vigtig for den kvaternære struktur af kollagenfibre og dannelsen af tværbindinger mellem tilstødende kollagenmolekyler. I modsætning til bovine kollagenpræparater forårsager autologt kollagen ikke immunreaktioner hos modtageren, men det er ikke effektivt nok som et genopfyldende middel. En stabil korrektion kan opnås gennem lokal kollagenproduktion ved transplantation af autologe fibroblaster. Imidlertid blev visse vanskeligheder identificeret under undersøgelsen af effektiviteten af autolog fibroblasttransplantation i klinikken. I den tidlige periode efter fibroblasttransplantation var den kliniske effekt svagere sammenlignet med den efter introduktion af bovint kollagen. Ved dyrkning af autologe fibroblaster kan muligheden for transformation af normale fibroblaster til patologiske, de såkaldte myofibroblaster, der er ansvarlige for udviklingen af fibrose og ardannelse, hvilket fremgår af sammentrækningen af kollagengelen forårsaget af den specifikke interaktion mellem fibroblaster og kollagenfibriller, ikke udelukkes. Derudover mister fibroblaster efter seriel passage in vitro evnen til at syntetisere ekstracellulære matrixproteiner.

Der er imidlertid nu eksperimentelt udviklet en metode til dyrkning af autologe humane fibroblaster, som eliminerer de ovennævnte mangler og ikke resulterer i onkogen transformation af normale fibroblaster. Autologe fibroblaster opnået ved hjælp af denne metode anvendes til at genoprette defekter i blødt ansigtsvæv. I en undersøgelse foretaget af G. Keller et al. (2000) blev 20 patienter i alderen 37 til 61 år med rynker og atrofiske ar behandlet. Hudbiopsier (4 mm) fra den retroaurikulære region blev transporteret til laboratoriet i sterile reagensglas indeholdende 10 ml dyrkningsmedium (Eagles medium med antibiotikum, mykoseptisk middel, pyruvat og føtalt kalveserum). Materialet blev placeret i 3-5 dyrkningsskåle med en diameter på 60 mm og inkuberet i en termostat med en atmosfære indeholdende 5% CO2. Efter 1 uge blev cellerne fjernet fra skålene ved trypsinering og placeret i 25 cm2 hætteglas. Cellerne blev injiceret i patienter i en mængde på 4 x 107. En signifikant og vedvarende klinisk effekt blev observeret hos patienter under korrektion af nasolabiale folder, såvel som hos patienter med ar 7 og 12 måneder efter den tredje transplantation af autologe fibroblaster. Ifølge flowcytometri producerede de dyrkede fibroblaster en stor mængde type I-kollagen. In vitro-studier har vist normal kontraktilitet af de injicerede fibroblaster. To måneder efter subkutan administration af dyrkede fibroblaster i en dosis på 4 x 107 celler blev der ikke påvist tumorer i nøgne mus. De injicerede fibroblaster forårsagede ikke ardannelse eller diffus fibrose hos patienterne. Ifølge forfatteren er de indpodede autologe fibroblaster i stand til konstant at producere kollagen, hvilket vil give en kosmetisk foryngelseseffekt. Samtidig er fibroblaster taget fra en ung patient mere effektive end dem, der opnås fra ældre mennesker, da levetiden for differentierede celler er begrænset. I fremtiden antages det, at det vil være muligt at kryopræservere en kultur af fibroblaster taget fra en ung donor for senere at transplantere sine egne unge celler til en ældre patient. Afslutningsvis er det ikke helt korrekt at konkludere, at autologe fibroblaster, forudsat at de er funktionelt bevarede, er et ideelt middel til at korrigere defekter i ansigtets bløde væv. Samtidig bemærker forfatteren selv, at der under undersøgelsen opstod nogle problematiske situationer relateret til brugen af det autologe fibroblast-kollagen-system. Den kliniske effekt var ofte svagere end ved brug af bovint kollagen, hvilket forårsagede skuffelse hos patienterne.

Generelt ser litteraturdataene om udsigterne for klinisk anvendelse af mesenkymale stamceller ret optimistiske ud. Der gøres forsøg på at anvende autologe multipotente mesenkymale progenitorceller fra knoglemarv til behandling af degenerative ledlæsioner. De første kliniske forsøg med brugen af dyrkede mesenkymale progenitorceller i behandlingen af komplekse knoglefrakturer er under gennemførelse. Auto- og allogene mesenkymale stromale celler fra knoglemarv bruges til at skabe bruskvæv til transplantation i forbindelse med korrektion af ledbruskdefekter på grund af traumer eller autoimmune læsioner. Der udvikles metoder til klinisk anvendelse af multipotente mesenkymale progenitorceller for at eliminere knogledefekter hos børn med en alvorlig form for ufuldstændig osteogenese forårsaget af mutationer i type I-kollagengenet. Efter myeloablation transplanteres recipientbørn med knoglemarv fra HLA-kompatible raske donorer, da ufraktioneret knoglemarv kan indeholde et tilstrækkeligt antal mesenkymale stamceller til at kompensere for en alvorlig knogledefekt. Efter transplantation af allogen knoglemarv har sådanne børn vist positive histologiske forandringer i trabekulære knogler, en stigning i vækstraten og et fald i forekomsten af knoglebrud. I nogle tilfælde opnås et positivt klinisk resultat ved transplantation af nært beslægtet allogen knoglemarv og osteoblaster. MSC-transplantation bruges også til at behandle medfødt knogleskørhed forårsaget af en ubalance mellem osteoblaster og osteoklaster i knoglevævet. I dette tilfælde opnås genoprettelse af knogledannelsen gennem kimærisering af puljen af stam- og progenitorstromale celler i patienternes knoglevæv.

Forbedring af metoder til genetisk modifikation af donor-mesenkymale stamceller med det formål at korrigere genetiske defekter i stromalt væv fortsættes. Det antages, at mesenkymale progenitorceller i den nærmeste fremtid vil blive anvendt i neurologi til målrettet kimærisering af hjerneceller og skabelse af en sund pulje af celler, der er i stand til at generere et defekt enzym eller en faktor, der er ansvarlig for kliniske manifestationer af sygdommen. Transplantation af mesenkymale stamceller kan bruges til at genoprette knoglemarvsstroma hos kræftpatienter efter stråle- og kemoterapi, og i kombination med knoglemarvsceller - til genoprettelse af hæmatopoiesen. Udvikling af erstatningsterapi med det formål at eliminere defekter i bevægeapparatet ved hjælp af MSC'er fremmes af tekniske udviklinger inden for design af matrixbiomaterialer eller biomimetika, der danner rammer befolket af afkom af mesenkymale stamceller.

Kilder til mesenkymale stamceller

Hovedkilden til mesenkymale stamceller er knoglemarv, hvis hæmatopoietiske stamceller i pattedyrs krop konstant differentierer til blod- og immunsystemceller, mens mesenkymale stamceller er repræsenteret af en lille population af fibroblastlignende celler i knoglemarvsstroma og bidrager til at bevare den udifferentierede tilstand af hæmatopoietiske stamceller. Under visse betingelser differentierer mesenkymale stamceller til brusk- og knoglevævsceller. Når de sås på et dyrkningsmedium under plantningsbetingelser med lav tæthed, danner mononukleære stromale celler i knoglemarven kolonier af adhæsive celler, som faktisk er fibroblastlignende multipotente mesenkymale progenitorceller. Nogle forfattere mener, at ubundne mesenkymale stamceller aflejres i knoglemarven, som på grund af deres evne til selvfornyelse og høje differentieringspotentiale forsyner alt væv i kroppen med mesenkymale forstadier til stromale elementer gennem hele pattedyrsorganismens levetid.

I knoglemarven danner stromale cellulære elementer et netværk, der fylder rummet mellem sinusoiderne og knoglevævet. Indholdet af sovende MSC'er i knoglemarven hos en voksen er sammenligneligt med mængden af hæmatopoietiske stamceller og overstiger ikke 0,01-0,001%. Mesenkymale stamceller isoleret fra knoglemarv og ikke dyrket mangler adhæsionsmolekyler. Sådanne MSC'er udtrykker ikke CD34, ICAM, VCAM, kollagen type I og III, CD44 og CD29. Følgelig er det in vitro ikke mesenkymale stamceller, der er fikseret på kultursubstratet, men mere avancerede progenitorderivater af mesenkymale stamceller, der allerede har dannet komponenterne i cytoskelettet og receptorapparatet for celleadhæsionsmolekyler. Stromale celler med CD34-fænotypen findes selv i perifert blod, selvom der i knoglemarven er betydeligt færre af dem end CD34-positive mononukleære celler. CD34-celler isoleret fra blodet og overført til kultur binder sig til substratet og danner kolonier af fibroblastlignende celler.

Det er kendt, at i den embryonale periode stammer det stromale grundlag for alle organer og væv hos pattedyr og mennesker fra en fælles pulje af mesenkymale stamceller før og på stadiet af organogenesen. Derfor antages det, at størstedelen af mesenkymale stamceller i en moden organisme bør være i binde- og knoglevævet. Det er blevet fastslået, at hoveddelen af de cellulære elementer i stroma af løst binde- og knoglevæv er repræsenteret af engagerede progenitorceller, som dog bevarer evnen til at proliferere og danne kloner in vitro. Når sådanne celler introduceres i den generelle blodbane, implanteres mere end 20% af de mesenkymale progenitorceller blandt de stromale elementer i det hæmatopoietiske væv og de parenkymatøse organer.

En potentiel kilde til mesenkymale stamceller er fedtvæv, blandt hvilke der i varierende grad er identificeret adipocytforløbere. De mindst modne progenitorelementer af fedtvæv er stromal-vaskulære celler, som, ligesom multipotente mesenkymale forløberceller i knoglemarv, er i stand til at differentiere til adipocytter under påvirkning af glukokortikoider, insulinlignende vækstfaktor og insulin. I kultur differentierer stromal-vaskulære celler til adipocytter og chondrocytter, og i fedtvæv af knoglemarvsoprindelse er der celler, der danner adipocytter og osteoblaster.

Stromale stamceller er også blevet fundet i muskler. I den primære kultur af celler isoleret fra human skeletmuskulatur detekteres stellatceller og multinukleære myotuber. I nærvær af hesteserum prolifererer stellatceller in vitro uden tegn på cytodifferentiering, og efter tilsætning af dexamethason til næringsmediet er deres differentiering karakteriseret ved forekomsten af cellulære elementer med fænotypen af skelet- og glatmuskelceller, knogle, brusk og fedtvæv. Derfor er både dedikerede og ikke-dedikerede multipotente mesenkymale progenitorceller til stede i humant muskelvæv. Det er blevet vist, at populationen af progenitorceller, der er til stede i skeletmuskulatur, stammer fra ikke-dedikerede multipotente mesenkymale progenitorceller i knoglemarven og adskiller sig fra myogene satellitceller.

Adhæsive stellatceller svarende til multipotente mesenkymale progenitorceller i differentieringspotentiale blev også fundet i myokardiet hos nyfødte rotter, da de under påvirkning af dexamethason differentierer til adipocytter, osteoblaster, chondrocytter, glatte muskelceller, skeletmuskulaturmyotuber og kardiomyocytter. Det blev vist, at vaskulære glatte muskelceller (pericytter) er derivater af udifferentierede perivaskulære multipotente mesenkymale progenitorceller. I kultur udtrykker perivaskulære mesenkymale stamceller glat muskel a-actin og blodpladeafledt vækstfaktorreceptor og er i stand til at differentiere i det mindste til glatte muskelceller.

En særlig plads, set fra stamcellernes synspunkt, indtages af bruskvæv, hvis ekstremt lave reparationspotentiale menes at skyldes en mangel på multipotente mesenkymale progenitorceller eller differentierings- og vækstfaktorer. Det antages, at multipotente mesenkymale progenitorceller, der er prædedikeret til kondro- og osteogenese, trænger ind i bruskvæv fra andre vævskilder.

Vævsoprindelsen og betingelserne for mesenkymale progenitorcellers binding i sener er heller ikke blevet fastslået. Eksperimentelle observationer indikerer, at kanin-achillesseneceller i primære kulturer og ved første passage i den tidlige postnatale periode bevarer ekspressionen af type I-kollagen og decorin, men ved yderligere dyrkning mister de tenocytternes differentieringsmarkører.

Det skal bemærkes, at svaret på spørgsmålet om, hvorvidt multipotente mesenkymale progenitorceller lokaliseret i forskellige væv faktisk konstant er til stede i deres stroma, eller om vævspuljen af mesenkymale stamceller genopfyldes ved migration af knoglemarvsstromale stamceller, endnu ikke er modtaget.

Ud over knoglemarv og andre mesenkymale vævszoner i en voksen organisme kan navlestrengsblod være en anden kilde til MSC'er. Det er blevet vist, at navlestrengsveneblod indeholder celler, der har lignende morfologiske og antigene egenskaber med multipotente mesenkymale progenitorceller, er i stand til adhæsion og ikke er ringere end multipotente mesenkymale progenitorceller af knoglemarvsoprindelse i differentieringspotentiale. I kulturer af mesenkymale stamceller fra navlestrengsblod blev der fundet 5 til 10% uengagerede multipotente mesenkymale progenitorceller. Det viste sig, at deres antal i navlestrengsblod er omvendt proportionalt med gestationsalderen, hvilket indirekte indikerer migrationen af multipotente mesenkymale progenitorceller til forskellige væv under fosterudviklingen. De første oplysninger er dukket op om den kliniske anvendelse af mesenkymale stamceller isoleret fra navlestrengsblod, såvel som dem, der er opnået fra embryonalt biomateriale, hvilket er baseret på den kendte evne hos føtale stamceller til at integrere, indpode og fungere i organer og vævssystemer hos voksne recipienter.

Søgning efter nye kilder til mesenkymale stamceller

Brugen af mesenkymale stamceller af embryonal oprindelse, såvel som andre føtale celler, skaber en række etiske, juridiske, retslige og lovgivningsmæssige problemer. Derfor fortsætter søgningen efter ekstraembryonalt donorcellemateriale. Et forsøg på klinisk anvendelse af humane hudfibroblaster var mislykket, hvilket ikke kun var forudbestemt af teknologiens høje økonomiske kapacitet, men også af den hurtige differentiering af fibroblaster til fibrocytter, som har et betydeligt lavere proliferationspotentiale og producerer et begrænset antal vækstfaktorer. Yderligere fremskridt i studiet af biologien af MSC'er og multipotente mesenkymale progenitorceller fra knoglemarv tillod os at udvikle en strategi for klinisk anvendelse af autologe mesenkymale stamceller. Teknologien til deres isolering, dyrkning, ex vivo-reproduktion og målrettet differentiering krævede først og fremmest undersøgelse af spektret af molekylære markører for MSC'er. Deres analyse viste, at primære kulturer af humant knoglevæv indeholder flere typer multipotente mesenkymale progenitorceller. Proosteoblastfænotypen blev detekteret i celler, der udtrykker markøren for stromale progenitorceller STRO-1, men ikke bærer osteoblastmarkøren - alkalisk fosfatase. Sådanne celler er karakteriseret ved en lav evne til at danne mineraliseret knoglematrix, såvel som fraværet af osteopontin og parathyroidhormonreceptorekspression. Derivater af STRO-1-positive celler, der ikke udtrykker alkalisk fosfatase, er repræsenteret af intermediært og fuldstændigt differentierede osteoblaster. Det blev fundet, at cellulære elementer af klonede linjer af STRO-1-positive humane trabekulære knogleceller er i stand til at differentiere til modne osteocytter og adipocytter. Differentieringsretningen af disse celler afhænger af effekten af flerumættede fedtsyrer, proinflammatoriske cytokiner - IL-1b og tumornekrosefaktor a (TNF-a), såvel som antiinflammatorisk og immunsuppressiv TGF-b.

Det blev senere konstateret, at multipotente mesenkymale progenitorceller mangler en specifik fænotype, der kun er iboende for dem, men udtrykker et kompleks af markører, der er karakteristiske for mesenkymale, endotel-, epitel- og muskelceller, i fravær af ekspression af immunfænotypiske antigener fra hæmatopoietiske celler - CD45, CD34 og CD14. Derudover producerer mesenkymale stamceller konstitutivt og inducerbart hæmatopoietiske og ikke-hæmatopoietiske vækstfaktorer, interleukiner og kemokiner, og receptorer for nogle cytokiner og vækstfaktorer udtrykkes på multipotente mesenkymale progenitorceller. Hvilende celler med en immunfænotype, der er næsten identisk med antigenprofilen for ubehandlede multipotente mesenkymale progenitorceller uden 5-fluorouracil, er blevet fundet blandt cellerne i den stromale matrix i det menneskelige legeme - begge celler udtrykker CD117, som markerer "voksne" stamceller.

Således er en cellemarkør, der er unik for mesenkymale stamceller, endnu ikke blevet identificeret. Det antages, at hvilende celler repræsenterer en population af ikke-dedikerede multipotente mesenkymale progenitorceller, da de ikke udtrykker markører for celler, der er dedikeret til osteo- (Cbfa-1) eller adipogenese (PPAR-y-2). Langvarig eksponering af langsomt prolifererende hvilende celler for føtalt bovint serum fører til dannelsen af terminalt differentierende dedikerede progenitorceller, der er karakteriseret ved hurtig vækst. Klonal ekspansion af sådanne mesenkymale stamceller understøttes af FGF2. Det ser ud til, at genomet af stromale stamceller er ret tæt "lukket". Der er rapporter om fravær af spontan differentiering i MSC'er - uden særlige betingelser for dedikation transformerer de sig ikke engang til celler af den mesenkymale afstamning.

For at studere populationsstrukturen af mesenkymale stamcellederivater udføres en søgning efter differentieringsmarkørproteiner på stromale cellelinjer og i primære kulturer. In vitro klonal analyse af knoglemarvskolonidannende celler har vist, at EGF øger den gennemsnitlige kolonistørrelse og mindsker klonal ekspression af alkalisk fosfatase, når det anvendes på primære kulturer, mens tilsætning af hydrocortison aktiverer ekspressionen af alkalisk fosfatase, som er en markør for den osteogene retning af MSC-differentiering. Monoklonale antistoffer mod STRO-1 gjorde det muligt at separere og studere populationen af STRO-1-positive adhæsive celler i et heterogent system af Dexter-kulturer. Et spektrum af cytokiner er blevet bestemt, som ikke kun regulerer proliferation og differentiering af hæmatopoietiske og lymfoide celler, men også deltager i dannelse, dannelse og resorption af skeletvæv gennem para-, auto- og endokrine mekanismer. Receptormedieret frigivelse af sekundære budbringere som cAMP, diacylglycerol, inositoltriphosphat og Ca2+ anvendes også til markøranalyse af forskellige kategorier af stromale vævsceller, der udtrykker de tilsvarende receptorer. Brugen af monoklonale antistoffer som markører gjorde det muligt at fastslå tilhørsforholdet af retikulære celler i stroma i lymfoide organer til de T- og B-afhængige zoner.

I nogen tid fortsatte videnskabelige debatter om spørgsmålet om muligheden for, at MSC stammer fra en hæmatopoietisk stamcelle. Når knoglemarvscellesuspensioner eksplanteres i monolagskulturer, vokser der adskilte kolonier af fibroblaster i dem. Det blev imidlertid vist, at tilstedeværelsen af forløbere for fibroblastkolonier og forskellige spirer af hæmatopoietisk vævsdifferentiering i knoglemarven ikke er bevis for deres fælles oprindelse fra en hæmatopoietisk stamcelle. Ved hjælp af diskriminantanalyse af knoglemarvsstamceller blev det fastslået, at mikromiljøet under heterotopisk knoglemarvstransplantation ikke overføres af hæmatopoietiske celler, hvilket beviser eksistensen af en population af MSC'er i knoglemarven, der er histogenetisk uafhængig af hæmatopoietiske celler.

Derudover gjorde den selektive kloningsmetode det muligt at identificere en ny kategori af stromale progenitorceller i monolagskulturer af knoglemarvsceller, bestemme deres antal og studere deres egenskaber, proliferative og differentierende potentialer. Det viste sig, at stromale fibroblastlignende celler prolifererer in vitro og danner diploide kolonier, som, når de transplanteres tilbage i kroppen, sørger for dannelsen af nye hæmatopoietiske organer. Resultaterne af undersøgelsen af individuelle kloner indikerer, at der blandt de stromale progenitorceller findes en population af celler, der på grund af deres proliferative og differentierende potentiale kan gøre krav på rollen som stamceller i stromalt væv, histogenetisk uafhængige af hæmatopoietiske stamceller. Cellerne i denne population er karakteriseret ved selvopretholdende vækst og differentierer til progenitorcelleelementer af knogle, brusk og retikulært væv i knoglemarven.

Resultaterne af studierne foretaget af R. Chailakhyan og medforfattere (1997-2001) er af stor interesse, og de dyrkede stromale stamceller fra knoglemarv fra kaniner, marsvin og mus på a-MEM-næringsmediet med tilsætning af føtalt kalveserum. Forfatterne udførte eksplantation med en initial tæthed på 2-4 x 103 knoglemarvsceller pr. 1 cm2. Homologe eller heterologe strålingsinaktiverede knoglemarvsceller blev anvendt som fødekilde i en dosis, der bevarede fødekildeeffekten, men fuldstændigt blokerede deres proliferation. To uger gamle primære, diskrete kolonier af fibroblaster blev trypsiniseret for at opnå monoklonale stammer. Bevis for koloniernes klonale oprindelse blev opnået ved hjælp af en kromosomal markør i blandede knoglemarvskulturer af han- og hunmarsvin, time-lapse-fotografering af levende kulturer og i blandede kulturer af syngenisk knoglemarv fra CBA- og CBAT6T6-mus. Transplantation af en suspension af frisk isolerede knoglemarvsceller eller in vitro-dyrkede stromale fibroblaster under nyrekapslen blev udført i ivalon- eller gelatineporøse scaffolds, såvel som inaktiveret svampet kaninknoglematrix. Til transplantation af kloner i en knogleskede blev marsvine-lårben renset for blødt væv og periosteum, epifyserne blev trimmet, og knoglemarven blev grundigt vasket ud. Knoglen blev skåret i fragmenter (3-5 mm), tørret og bestrålet med en dosis på 60 Gy. Individuelle kolonier af fibroblaster blev placeret i knogleskeder og implanteret intramuskulært. Til intraperitoneal transplantation af in vitro-dyrkede stromale fibroblaster blev diffusionskamre af typerne A (V=0,015 cm3, h=0,1 mm) og O (V=0,15 cm3, h=2 mm) anvendt.

I forbindelse med undersøgelsen af vækstdynamikken i klonale stammer fandt R. Chailakhyan et al. (2001), at individuelle celler, der danner fibroblastkolonier, såvel som deres efterkommere, har et enormt proliferativt potentiale. Ved den 10. passage var antallet af fibroblaster i nogle stammer 1,2-7,2 x 109 ^celler. Under deres udvikling udførte de op til 31-34 cellefordoblinger. I dette tilfælde resulterede heterotoptransplantation af knoglemarvsafledte stammer dannet af stromale forstadier fra flere dusin kloner i overførsel af knoglemarvsmikromiljøet og dannelsen af et nyt hæmatopoietisk organ i transplantationszonen. Forfatterne stillede spørgsmålet om, hvorvidt individuelle kloner er i stand til at overføre knoglemarvsmikromiljøet i stromale celler, eller om samarbejde mellem flere forskellige klonogene stromale forstadier er påkrævet til dette? Og hvis individuelle kloner er i stand til at overføre mikromiljøet, vil det så være komplet for alle tre hæmatopoietiske spirer, eller sørger forskellige kloner for dannelsen af mikromiljøet for forskellige hæmatopoietiske spirer? For at løse disse problemer blev der udviklet en teknologi til dyrkning af stromale progenitorceller på en kollagengel, hvilket gør det muligt at fjerne de dyrkede fibroblasterkolonier fra overfladen til efterfølgende heterotopisk transplantation. Individuelle kloner af stromale fibroblaster dyrket fra knoglemarvsceller fra CBA-mus og marsvin blev udskåret sammen med et fragment af gelbelægningen og transplanteret heterotopisk - under nyrekapslen hos syngene mus eller i mavemusklen hos autologe marsvin. Når kolonierne på gelen blev transplanteret ind i musklen, blev de placeret i knogleskeder.

Forfatterne fandt, at der 50-90 dage efter transplantation af knoglemarvsfibroblastkolonier blev observeret udvikling af knogle eller knogle og hæmatopoietisk væv i transplantationszonen i 20% af tilfældene. Hos 5% af recipientdyrene indeholdt de dannede foci af knoglevæv et hulrum fyldt med knoglemarv. Inde i knoglecylindrene havde sådanne foci en afrundet form og en kapsel bygget af knoglevæv med osteocytter og et veludviklet osteoblastisk lag. Knoglemarvshulrummet indeholdt retikulært væv med myeloide og erytroide celler, hvis proportionale forhold ikke adskilte sig fra det i normal knoglemarv. I nyren var transplantatet et typisk knoglemarvsorgan dannet under transplantation af nativ knoglemarv, hvor knoglekapslen kun dækkede knoglemarvshulrummet fra siden af nyrekapslen. Det hæmatopoietiske væv omfattede myeloide, erytroide og megakaryocytiske elementer. Knoglemarvshulrummets stroma havde et veludviklet sinussystem og indeholdt typiske fedtceller. Samtidig blev knoglevæv uden tegn på hæmatopoiese fundet i transplantationszonen i nogle kolonier under nyrekapslen. Undersøgelsen af de individuelle kloners proliferative og differentierende potentialer blev fortsat på monoklonale knoglemarvsstammer fra kaniner, hvis celler blev resuspenderet i et næringsmedium, og i en separat ivalonsvamp med en masse på 1-2 mg blev transplanteret under nyrekapslen hos en kanin-knoglemarvsdonor. Celler fra 21 monoklonale stammer blev underkastet en sådan autotransplantation. Resultaterne blev taget i betragtning efter 2-3 måneder. Forfatterne fandt, at i 14% af tilfældene dannede de transplanterede monoklonale stammer et knoglemarvsorgan bestående af knoglevæv og et knoglemarvhulrum fyldt med hæmatopoietiske celler. I 33% af tilfældene dannede de transplanterede stammer en kompakt knogle af varierende størrelse med osteocytter indlejret i hulrummene og et udviklet osteoblastisk lag. I nogle tilfælde udviklede sig retikulært væv uden knogle eller hæmatopoietiske elementer i svampene med transplanterede kloner. Nogle gange blev der dannet retikulært stroma med et veludviklet netværk af sinusoider, men det var ikke populeret med hæmatopoietiske celler. De opnåede resultater svarede således til de data, der blev opnået under klontransplantation på kollagengel. Men hvis transplantation af kloner dyrket på et substrat resulterede i dannelsen af knoglemarvsvæv i 5% af tilfældene, knoglevæv i 15% og retikulært væv i 80% af tilfældene, så blev der ved transplantation af monoklonale stammer observeret dannelsen af knoglemarvselementer i 14% af tilfældene, knoglevæv i 53% og retikulært væv i 53% af tilfældene. Ifølge forfatterne indikerer dette, at betingelserne for implementering af proliferativt og differentierende potentiale for stromale fibroblaster under transplantation på porøse scaffolds var mere optimale end under deres transplantation i knogleskeder og på et kollagensubstrat.Det er muligt, at brugen af mere avancerede metoder til dyrkning og omvendt transplantation af kloner kan forbedre betingelserne for realisering af deres differentieringspotentiale af kloner og ændre disse forhold. På den ene eller anden måde, men den primære betydning af de udførte undersøgelser er, at nogle kloner af stromale celler er i stand til at danne knoglevæv og samtidig give et stromalt hæmatopoietisk mikromiljø for tre spirer af knoglemarvshæmatopoiese på én gang: erytroid, myeloid og megakaryocytisk, hvilket skaber ret store platforme af hæmatopoietisk væv og en vis knoglemasse.

Forfatterne behandlede derefter spørgsmålet om individuelle klonogene stromale progenitorcellers evne til at undergå disse typer celledifferentiering i et lukket system af diffusionskamre. Derudover var det nødvendigt at bestemme, om individuelle kloner besidder polypotens, eller om manifestationen af differentieringspotentiale kræver kooperativ interaktion mellem flere kloner med et fast cytodifferentieringstræk, hvis forskellige forhold bestemmer den foretrukne dannelse af knogle-, retikulært eller bruskvæv. Ved at kombinere to metodologiske tilgange - at opnå monoklonale stammer af knoglemarvsstromale progenitorceller og transplantere dem i diffusionskamre - opnåede R. Chailakhyan og medforfattere (2001) resultater, der gjorde det muligt for dem at komme tættere på forståelsen af den strukturelle organisering af knoglemarvsstroma. Transplantation af monoklonale stammer af stromale progenitorceller i O-type kamre resulterede i dannelsen af både knogle- og bruskvæv, hvilket indikerer evnen hos efterkommere af en enkelt stromal kolonidannende celle til samtidig at danne knogle- og bruskvæv. Antagelsen om, at knogle- og bruskvæv stammer fra en fælles stromal progenitorcelle, er blevet fremført gentagne gange. Denne hypotese havde dog ingen korrekt eksperimentel bekræftelse. Dannelsen af knogle og brusk i diffusionskamre var det nødvendige bevis på eksistensen af en fælles progenitorcelle for disse to typer væv blandt stromale stamceller i knoglemarven.

Derefter blev 29 klonale stammer af anden-tredje passager opnået fra primære kulturer af kaninknoglemarv placeret i diffusionskamre og implanteret intraperitonealt i homologe dyr. Undersøgelserne viste, at 45% af de monoklonale knoglemarvsstammer har osteogent potentiale. Ni kamre indeholdt udelukkende retikulært væv, men det var til stede sammen med knogle- og bruskvæv i 13 yderligere kamre, hvilket udgjorde 76% af alle stammer. I type O-kamre, hvor differentiering af både knogle- og bruskvæv var mulig, blev 16 stammer undersøgt. I fire kamre (25%) blev både knogle- og bruskvæv dannet. Det skal endnu engang bemærkes, at i undersøgelserne af R. Chailakhyan et al. (2001) gennemgik individuelle progenitorceller 31 til 34 fordoblinger inden for en cellestamme, og deres afkom omfattede 0,9-2,0 x 109 ^celler. Antallet af mitoser, som progenitorceller af polyklonale stammer gennemgik, var stort set identisk med antallet af monoklonale stammer. Udviklingshastigheden af polyklonale stammer, især i den første fase af deres dannelse, afhang i betydelig grad af antallet af kolonier, der blev brugt til at initiere stammerne. Diploide stammer af humane embryonale fibroblaster (WI-38) dannede også kolonier, der varierede i diameter og celleindhold, når de blev rekloneret ved 12-15. fordoblingsniveau. Store kolonier indeholdende mere end 103 celler udgjorde kun 5-10%. Med en stigning i antallet af delinger faldt procentdelen af store kolonier. Mono- og polyklonale stammer af knoglemarvsstromale fibroblaster beholdt et diploidt sæt af kromosomer efter 20 eller flere fordoblinger, og tendensen i deres udvikling var sammenlignelig med dynamikken i udviklingen af diploide stammer af embryonale fibroblaster. Analyse af differentieringspotentialet af individuelle knoglemarvsstromale progenitorceller, udført ved transplantation af monoklonale stammer i diffusionskamre, viste, at halvdelen af dem var osteogene. Store kolonier tegnede sig for 10% af deres samlede antal. Følgelig svarede antallet af osteogene kolonidannende celler til cirka 5% af deres samlede population. Den samlede masse af osteogene progenitorceller identificeret af forfatterne omfattede celler, der var i stand til samtidig at danne knogle- og bruskvæv. Desuden blev det for første gang fastslået, at disse to typer væv i en voksen organisme har en fælles progenitorcelle: 25% af de testede kloner blev skabt af sådanne celler, og deres antal blandt den samlede population af progenitorceller var mindst 2,5%.

Heterotoptransplantation af individuelle kloner af knoglemarvsfibroblaster har således afsløret nye aspekter af den strukturelle organisering af populationen af mesenkymale progenitorceller. Der er fundet stromale progenitorceller, der er i stand til at overføre et specifikt mikromiljø for alle hæmatopoietiske spirer på én gang, hvoraf antallet blandt de store kloner, der er undersøgt i forskellige modeller, varierer fra 5 til 15% (0,5-1,5% af det samlede antal detekterede progenitorceller). Sammen med kloner, der overfører hele knoglemarvsmikromiljøet, er der progenitorceller, der kun er bestemt til osteogenese, og som, når de overføres i et åbent system, danner knoglevæv, der ikke understøtter udviklingen af hæmatopoiese. Deres antal ud fra det samlede antal progenitorceller er 1,5-3%. Nogle af disse celler er i stand til at danne knoglevæv med en begrænset periode med selvvedligeholdelse. Følgelig er populationen af stromale progenitorceller heterogen i sit differentieringspotentiale. Blandt dem er der en kategori af celler, der hævder at være stromale stamceller, der er i stand til at differentiere i alle tre retninger, der er karakteristiske for stromalt væv i knoglemarv, og danne knogle, brusk og retikulært væv. De præsenterede data giver os håb om, at det ved hjælp af forskellige cellemarkører vil være muligt at bestemme bidraget fra hver type stromale celler til organiseringen af et specifikt mikromiljø og understøttelsen af hæmatopoiese i Dexter-kulturer.

Funktioner af mesenkymale stamceller

I de senere år er det blevet fastslået, at multipotente mesenkymale progenitorceller i stationære knoglemarvskulturer er repræsenteret af en begrænset population af små agranulære celler (RS-1-celler), der er karakteriseret ved en lav kolonidannende kapacitet og fravær af ekspression af Ki-67-antigenet, der er specifikt for prolifererende celler. De antigene parametre for sovende RS-1-celler adskiller sig fra spektret af antigener fra hurtigt prolifererende, dedikerede stromale progenitorceller. Det er blevet fastslået, at en høj proliferationsrate for dedikerede progenitorceller kun observeres i nærvær af RS-1-celler. Til gengæld øger RS-1-celler deres vækstrate under påvirkning af faktorer, der udskilles af de mest modne derivater af multipotente mesenkymale progenitorceller. Det ser ud til, at RS-1-celler er en underklasse af ikke-dedikerede MSC'er, der er i stand til at recirkulere. In vitro er 5-fluorouracilresistente stromale progenitorceller i knoglemarv karakteriseret ved lavt RNA-indhold og høj ekspression af ornithin-decarboxylasegenet, en markør for ikke-prolifererende celler.

Intensiv proliferation af stromale progenitorceller begynder efter deres fiksering på substratet. I dette tilfælde udtrykkes markørprofilen for dårligt differentierede celler: SH2 (TGF-(3) receptor), SH3 (signalproteindomæne), kollagen type I og III, fibronektin, adhæsionsreceptorer VCAM-1 (CD106) og ICAM (CD54), cadherin-11, CD44, CD71 (transferrinreceptor), CD90, CD120a og CD124, men uden ekspression af karakteristiske markører for hæmatopoietiske stamceller (CD34, CD14, CD45). Klonal vækst gør det muligt gentagne gange at overføre mesenkymale stamceller med dannelse af talrige genetisk homogene pluripotente stromale progenitorceller i kultur. Efter 2-3 passager når deres antal 50-300 millioner. I en kultur med tilstrækkelig tæthed differentierer stromale progenitorceller, efter at proliferationen er stoppet, i modsætning til hæmatopoietiske vævsfibroblaster, til adipocytter, myocytter, brusk- og knogleceller. En kombination af tre regulatoriske differentieringssignaler, herunder 1-methyl-isobutylxanthin (en inducer af intracellulær cAMP-dannelse), dexamethason (en hæmmer af fosfolipaser A og C) og indomethacin (en hæmmer af cyclooxygenase, som også reducerer aktiviteten af thromboxansyntase), omdanner op til 95% af progenitor-mesenkymale celler til adipocytter. Dannelsen af adipocytter fra umodne stromale elementer bekræftes af ekspressionen af lipoproteinlipase-genet, histokemisk detektion af apolipoproteiner og peroxisomale receptorer. Celler af den samme klon under påvirkning af TGF-b i et serumfrit medium skaber en homogen population af chondrocytter. Flerlagscellekulturen af dette bruskvæv er karakteriseret ved en udviklet intercellulær matrix bestående af proteoglycan og type II-kollagen. I et næringsmedium med 10% effekt fører et differentieringssignalkompleks bestående af b-glycerofosfat (en uorganisk fosfatdonor), ascorbinsyre og dexamethason i den samme kultur af stromale progenitorceller til dannelsen af cellulære aggregater. I sådanne celler observeres en progressiv stigning i alkalisk fosfataseaktivitet og osteopontinniveauer, hvilket indikerer dannelsen af knoglevæv, hvis mineralisering af cellerne bekræftes af en progressiv stigning i intracellulært calciumindhold.

Ifølge nogle data kombineres mesenkymale stamcellers evne til ubegrænset deling og reproduktion af forskellige typer celler i den mesenkymale differentieringslinje med en høj grad af plasticitet. Når de introduceres i hjernens ventrikler eller hvide substans, migrerer mesenkymale stamceller til nervevævets parenkym og differentierer til derivater af glial- eller neuronalcellelinjen. Derudover findes der information om transdifferentiering af MSC'er til hæmatopoietiske stamceller både in vitro og in vivo. En mere dybdegående analyse i nogle undersøgelser har fastslået en usædvanlig høj plasticitet af MSC'er, hvilket manifesterer sig i deres evne til at differentiere til astrocytter, oligodendrocytter, neuroner, kardiomyocytter, glatte muskelceller og skeletmuskelceller. En række undersøgelser af MSC'ers transdifferentieringspotentiale in vitro og in vivo har fastslået, at multipotente mesenkymale progenitorceller af knoglemarvsoprindelse terminalt differentierer til cellelinjer, der danner knogle-, brusk-, muskel-, nerve- og fedtvæv, samt sener og stroma, der understøtter hæmatopoiese.

Andre undersøgelser har imidlertid ikke vist tegn på begrænsning af pluripotensen i det mesenkymale stamcellegenom og progenitorpopulationer af stromale celler, selvom mere end 200 kloner af MSC'er isoleret fra én primærkultur blev undersøgt for at teste mulig pluripotens af stromale celler. Langt de fleste kloner in vitro bevarede evnen til at differentiere i osteogene, kondrogene og adipogene retninger. Når man udelukkede sandsynligheden for migration af recipientceller ved transplantation af mesenkymale stamceller under nyrekapslen eller i diffusionskamre, viste det sig, at stromale progenitorceller in situ bevarer en heterogen fænotype, hvilket indikerer enten fraværet af restriktionsfaktorer i transplantationszonen eller fraværet af MSC-pluripotens som sådan. Samtidig tillades eksistensen af en sjælden type somatiske pluripotente stamceller, som er fælles forstadier til alle voksne stamceller.

Multipotensen, men ikke pluripotensen, hos ægte mesenkymale stamceller, som udgør en meget lille andel af knoglemarvsceller og er i stand til at proliferere under visse betingelser under in vitro-dyrkning uden at differentiere, fremgår af deres inducerede binding til knogle-, brusk-, fedt- og muskelvævsceller samt tenocytter og stromale elementer, der understøtter hæmatopoiesen. Som regel fremkalder langvarig eksponering for et dyrkningsmedium med føtalt kalveserum frigivelsen af MSC'er i dedikerede stromale progenitorceller, hvis afkom undergår spontan terminal differentiering. In vitro er det muligt at opnå målrettet dannelse af osteoblaster ved at tilsætte dexamethason, ß-glycerophosphat og ascorbinsyre til konditioneringsmediet, mens en kombination af dexamethason- og insulindifferentieringssignaler inducerer dannelsen af adipocytter.

Det er blevet fastslået, at knoglemarvs-MSC'er, før de går ind i stadiet med terminal differentiering, initialt differentierer til fibroblastlignende mesenkymale stamceller under visse dyrkningsbetingelser. Derivater af disse celler deltager in vivo i dannelsen af knogler, brusk, sener, fedt- og muskelvæv samt stroma, der understøtter hæmatopoiesen. Mange forfattere forstår udtrykket "multipotente mesenkymale progenitorceller" som både MSC'erne selv og dedikerede stromale progenitorceller fra knoglemarv og mesenkymale væv. Klonal analyse af multipotente mesenkymale progenitorceller af knoglemarvsoprindelse viste, at lidt mere end en tredjedel af alle kloner differentierer til osteo-, kondro- og adipocytter, mens cellerne fra de resterende kloner kun har osteogent potentiale og kun danner kondro- og osteocytter. En klon af multipotente mesenkymale progenitorceller, såsom BMC-9, differentierer under passende mikromiljøforhold til celler med fænotype og funktionelle karakteristika, ikke kun for osteoblaster, chondrocytter og adipocytter, men også for stromale celler, der understøtter hæmatopoiesen. En klon af RCJ3.1-celler isoleret fra rotteføtal knoglemarv differentierer til mesenkymale celler af forskellige fænotyper. Under den kombinerede virkning af ascorbinsyre, b-glycerofosfat og dexamethason danner de cellulære elementer i denne klon først multinukleære myocytter og derefter, sekventielt, adipocytter, chondrocytter og øer af mineraliseret knoglevæv. Populationen af granulære celler fra periosteum hos rottefostre svarer til ikke-engagerede multipotente mesenkymale progenitorceller, da den er karakteriseret ved en lav proliferationshastighed, ikke udtrykker differentieringsmarkører og under kulturforhold differentierer til dannelse af chondro-, osteo- og adipocytter samt glatte muskelceller.

Det skal således erkendes, at spørgsmålet om pluri- eller multipotensen af mesenkymale stamcellers genom forbliver åbent, hvilket følgelig også påvirker ideerne om stromale progenitorcellers differentieringspotentiale, hvilket heller ikke er endeligt fastslået.

En eksperimentelt dokumenteret og vigtig egenskab ved mesenkymale stamceller er deres evne til at forlade vævsnichen og cirkulere i den generelle blodbane. For at aktivere det genetiske differentieringsprogram skal sådanne cirkulerende stamceller trænge ind i det passende mikromiljø. Det er blevet vist, at med systematisk introduktion af MSC'er i blodbanen hos recipientdyr implanteres umodne celler i forskellige organer og væv, hvorefter de differentieres til blodceller, myocytter, adipocytter, chondrocytter og fibroblaster. Følgelig forekommer der signalregulerende interaktioner i lokale vævszoner mellem ikke-dedikerede og dedikerede stromale progenitorceller, såvel som mellem dem og de omgivende modne celler. Det antages, at differentiering induceres af parakrine regulatoriske faktorer af mesenkymal og ikke-mesenkymal oprindelse (vækstfaktorer, eicosanoider, ekstracellulære matrixmolekyler), som giver rumlige og tidsmæssige forbindelser i mikromiljøet af multipotente mesenkymale progenitorceller. Derfor bør lokal skade på mesenkymalt væv føre til dannelsen af zoner i mikromiljøet af multipotente mesenkymale progenitorceller, der er kvalitativt forskellige fra komplekset af regulatoriske signaler i intakte væv, hvor fysiologiske snarere end reparative regenereringsprocesser finder sted. Denne forskel er ekstremt vigtig med hensyn til specialiseringen af den cellulære fænotype i det normale og skadesinducerede mikromiljø.

Ifølge koncepterne er det her, at mekanismerne bag den grundlæggende forskel mellem de to kendte processer - fysiologisk regenerering og inflammatorisk proliferation - er indlejret. Den første af dem ender med genoprettelsen af vævets specialiserede cellulære sammensætning og dets funktion, mens resultatet af implementeringen af proliferationsprocessen er dannelsen af modne bindevævselementer og tabet af funktion i den beskadigede vævszone. For at udvikle optimale programmer til brug af multipotente mesenkymale progenitorceller i regenerativ-plastisk medicin er det derfor nødvendigt med en grundig undersøgelse af karakteristikaene ved virkningen af mikromiljøfaktorer på differentieringen af MSC'er.

Afhængigheden af stamcelle-kompartmentets struktur af cellulære para- og autokrine regulatorer, hvis ekspression moduleres af eksterne signaler, er uden tvivl. Blandt de regulatoriske faktorers funktioner er de vigtigste kontrol af asymmetrisk deling af MSC'er og ekspression af gener, der bestemmer stadierne for commitment og antallet af celledelinger. Eksterne signaler, som den videre udvikling af MSC'er afhænger af, leveres af deres mikromiljø. I en umoden tilstand prolifererer MSC'er i lang tid, mens de opretholder evnen til at differentiere til linjer af adipocytter, myofibroblaster, hæmatogent vævsstroma, brusk- og knogleceller. Det er blevet fastslået, at en begrænset population af CD34-negative stromale cellulære elementer, der cirkulerer i blodet, vender tilbage fra den generelle blodbane til knoglemarvsstroma, hvor de transformeres til linjer af CD34-positive hæmatopoietiske stamceller. Disse observationer tyder på, at recirkulation af progenitor-mesenkymale celler i blodbanen opretholder vævsbalancen af stromale stamceller i forskellige organer ved at mobilisere en fælles pulje af umodne stromale elementer i knoglemarven. Differentiering af MSC'er til celler med flere mesenkymale fænotyper og deres deltagelse i regenerering eller reparation af knogle, brusk, fedtvæv og sener in vivo er blevet bevist ved hjælp af adoptive transfermodeller i forsøgsdyr. Ifølge andre forfattere kombineres fjern migration af MSC'er langs det vaskulære leje med kortdistance- eller lokal bevægelse af multipotente mesenkymale progenitorceller i vævet under bruskreparation, muskelregenerering og andre genoprettende processer.

Lokale stamcellereserver i stromalvævsbasen fungerer som en kilde til celler i processerne for fysiologisk vævsregenerering og genopfyldes ved fjerntransport af MSC'er, når stamcellernes ressourcer i stromalvævet forbruges. Imidlertid deltager hele MSC-niveauet i processerne for reparativ regenerering, f.eks. i tilfælde af polytraume, i tilfælde af behov for akut mobilisering af det reparative cellulært potentiale, og mesenkymale stamceller i knoglemarven rekrutteres til periferien gennem den generelle blodgennemstrømning.

Mesenkymal stamcelletransplantation

Visse paralleller kan spores mellem processerne for fysiologisk vævsregenerering og deres dannelse under intrauterin udvikling. I menneskelig og pattedyrs embryogenese sker dannelsen af forskellige typer specialiserede celler fra ekto-, meso- og endodermale pool af kimlag, men med obligatorisk deltagelse af mesenkymet. Det løse cellulære netværk af embryonalt mesenkymalt væv udfører adskillige regulatoriske, metaboliske, ramme- og morfogenetiske funktioner. Lægningen af provisoriske organer sker først efter kondensering af mesenkymet på grund af den klonogene vækst af progenitorceller, som genererer de primære morfogenetiske signaler for organogenese. Stromale derivater af det embryonale mesenkym skaber det cellulære rammeværk for provisoriske organer og danner grundlaget for deres fremtidige energi-plastiske forsyning på grund af væksten af primære blod- og lymfekar. Med andre ord opstår de stromale elementer i den mikrocirkulerende enhed af føtale organer før dannelsen af deres strukturelle og funktionelle enheder. Derudover giver aktiv migration af mesenkymale celler under organogenese den rumlige orientering af udviklende organer ved at markere deres volumengrænser gennem begrænsning af homøtiske Hox-typer. Det stromale rammeværk tjener også som grundlag for samlingen af strukturelle og funktionelle enheder i parenkymatiske organer, som ofte omfatter morfogenetisk og funktionelt fuldstændig forskellige celler. Følgelig er mesenkymets funktioner primære under embryogenesen og realiseres gennem generering af regulatoriske signaler, der aktiverer regional proliferation og differentiering af progenitor epitelceller. Embryonale mesenkymceller producerer vækstfaktorer såsom HGF-b, HGF-b, CSF, for hvilke parenkymale progenitorceller har tilsvarende receptorer. I differentieret modent væv i en voksen organisme genererer det stromale netværk af celler også signaler for at opretholde levedygtigheden og proliferationen af progenitorceller af ikke-mesenkymal oprindelse. Spektret af stromale regulatoriske signaler i postnatal ontogenese er imidlertid forskelligt (SCF, HGF, IL-6, IL-1, IL-8, IL-11, IL-12, IL-14, IL-15, GM-CSF, flt-3, LIF osv.) og har til formål at sikre fysiologisk regenerering eller reparation af beskadigede vævszoner. Desuden er de spektrale karakteristika for stromale regulatoriske faktorer i hver vævstype og endda inden for ét organ forskellige. Især forekommer hæmatopoiese og lymfopoiese med proliferation og differentiering af hæmatopoietiske og immunkompetente celler kun i visse organer, inden for hvis grænser det stromale mikromiljø opererer og giver betingelser for modning af hæmatopoietiske og lymfoide celler. Hæmatopoietiske og lymfoide cellers evne til at genbefolke et givet organ, proliferere og modnes i dets mikrostrukturelle nicher afhænger af mikromiljøets regulatoriske faktorer.

Blandt komponenterne i den ekstracellulære matrix, som multipotente mesenkymale progenitorceller producerer, skal nævnes fibronektin, laminin, kollagen og proteoglycaner, samt CD44 (hyaluronan- og osteopontinreceptor), som spiller en væsentlig rolle i organiseringen af intercellulære interaktioner og dannelsen af den ekstracellulære matrix i knoglemarv og knoglevæv. Det er blevet bevist, at multipotente mesenkymale progenitorceller i knoglemarv skaber et stromalt mikromiljø, der leverer induktive og regulatoriske signaler ikke kun til MSC'er, men også til hæmatopoietiske progenitorceller og andre ikke-mesenkymale stamceller i knoglemarven. Det er kendt, at MSC'ers deltagelse i hæmatopoiesen bestemmes af deres evne til at differentiere til stromale celler, der understøtter hæmatopoiesen, og dette instruktive signal modtages af MSC'er direkte fra hæmatopoietiske stamceller. Derfor fungerer netværket af stromale progenitorceller i kultur som en fødebase for udviklingen af alle kloner af hæmatopoietiske celler.

I en moden organisme er intensiteten af hæmo- og lymfopoiese i en dynamisk ligevægtstilstand med "forbruget" af modne blodlegemer og immunsystemceller i periferien. Da stromale celler i knoglemarven og lymfoide organer fornyes ekstremt sjældent, forekommer der ikke nogen signifikant omstrukturering af stromale strukturer i dem. Systemet kan bringes ud af dynamisk ligevægt ved mekanisk skade på et hvilket som helst af hæmo- eller lymfopoieseorganerne, hvilket fører til ensartede sekventielle ændringer, der ikke kun og ikke så meget vedrører de hæmatopoietiske eller lymfoide elementer som de stromale strukturer i det beskadigede organ. I processen med reparativ regenerering dannes først den stromale base, som derefter genopbygges af hæmatopoietiske eller immunkompetente celler. Denne længe kendte kendsgerning gør posttraumatisk regenerering til en bekvem model til at studere det stromale mikromiljø i hæmatopoietiske organer. Især mekanisk tømning af medullærhulen i rørknoglerne anvendes til at studere reparativ regenerering af knoglemarv - curettage, hvilket muliggør hurtig og effektiv fjernelse af hæmatopoietisk væv fra den dynamiske ligevægtstilstand. Ved undersøgelse af processerne for reparativ regenerering af de hæmatopoietiske og stromale komponenter i knoglemarv efter mekanisk tømning af medullærhulen i skinnebenet hos marsvin, blev det konstateret, at der ikke er nogen direkte korrelation mellem regenereringsindekserne for hæmatopoietiske og stromale celler (antallet af hæmatopoietiske celler, koncentrationen og antallet af stromale progenitorceller). Derudover viste det sig, at en stigning i populationen af stromale progenitorceller forekommer tidligere efter curettage, og de stromale fibroblaster bliver selv fosfatasepositive, hvilket er typisk for osteogent væv. Det er også blevet fastslået, at curettage af 3-5 rørknogler fører til vækst af denne cellepopulation i knoglemarven på ikke-opererede knogler og endda i milten, som hos marsvin er et udelukkende lymfopoietisk organ.

Det morfologiske billede af reparative processer i knoglemarven fra kurerede skinneben hos marsvin svarer generelt til de data, der er beskrevet i litteraturen, der er opnået i forsøg på dyr af andre arter, og dynamikken i ændringer, der opstår efter fjernelse af hæmatopoietisk væv, er den samme for alle dyrearter, og forskellen vedrører kun tidsparametre. Morfologisk består faseordenen for hæmatopoiese-restaureringen i det tømte medullære hulrum af successive processer med blodproporganisering, dannelse af groft fibrøst knoglevæv, dets resorption, udvikling af sinusoider og dannelse af retikulært stroma, som efterfølgende genopbygges af hæmatopoietiske elementer. I dette tilfælde stiger antallet af hæmatopoietiske progenitorceller i processen med regenerering af knoglemarvsvæv parallelt med stigningen i indholdet af hæmatopoietiske stamceller.

Yu. Gerasimov og medforfattere (2001) sammenlignede ændringer i antallet af hæmatopoietiske celler og antallet af stromale progenitorceller i individuelle faser af regenereringsprocessen. Det viste sig, at kvantitative ændringer i knoglemarvsceller i kureret knogle svarer til dynamikken i regenerationens morfologiske karakteristika. Forfatterne forbinder faldet i celleindholdet i regenerationen i løbet af de første tre dage med døden af hæmatopoietiske celler på grund af den ugunstige effekt af mikromiljøet skabt af det prolifererende retikulære væv i den bevarede knoglemarv i epifyseregionen, samt med dannelsen af osteoidvævsfoci i sidstnævnte og vaskulær skade under curettage. På den 7.-12. dag falder en stigning i niveauet af kerneholdige celler sammen med forekomsten af individuelle foci af myeloid hæmatopoiese i zonerne for proliferation af stromale elementer. På den 20. dag vises betydelige områder med regenereret knoglemarv og veludviklede bihuler, hvilket ledsages af en signifikant stigning i det samlede antal celler. Antallet af hæmatopoietiske elementer i denne periode er dog 68 % af kontrolniveauet. Dette stemmer overens med tidligere offentliggjorte data, der viser, at antallet af hæmatopoietiske celler efter curettage først når normen på den 35.-40. dag efter operationen.

I den tidlige posttraumatiske periode er den primære kilde til genoprettelse af hæmatopoiese lokale cellulære elementer, der er bevaret under curettage. I senere stadier er den primære kilde til regenerering af knoglemarvens hæmatopoietiske væv stamceller, der genopbygger frie stromale zoner. Hvad angår individuelle kategorier af stromale celler (endotel, retikulære og osteogene), er de kilder, der sikrer deres dannelse under reorganiseringen af knoglemarvshulen, stadig uklare. Resultaterne af undersøgelsen foretaget af Yu. V. Gerasimov og medforfattere (2001) indikerer, at koncentrationen af celler, der danner fibroblasterkolonier, i knoglemarv bevaret efter curettage er signifikant højere end i normal knoglemarv. Forfatterne mener, at curettage resulterer i en mere intensiv selektiv udvaskning af hæmatopoietiske celler sammenlignet med kolonidannende stromale celler, som deltager i dannelsen af stroma og er stærkere forbundet med dets hovedsubstans end hæmatopoietiske celler.

Dynamikken i ændringen i antallet af celler, der danner fibroblastkolonier, korrelerer med intensiteten af osteogeneseprocesser, efterfølgende resorption af knogletrabekler og dannelse af retikulært stroma, som er befolket af hæmatopoietiske celler. De fleste af de stromale progenitorceller danner under de specificerede regenereringsbetingelser groft fibrøst knoglevæv og retikulært stroma. I tilfælde af lårbensfrakturer under forhold med langvarig osteosyntese øges koncentrationen og antallet af celler, der danner fibroblastkolonier, på den 5. dag i regenereringszonen, og i perioden med intensiv knogledannelse øges deres antal med 6 gange. Det er kendt, at knoglemarvsceller, der danner fibroblastkolonier, har osteogene egenskaber. Antallet af stromale progenitorceller stiger, før det kurerede knoglemarvsområde er blevet etableret af hæmatopoietiske celler. Dette stemmer godt overens med dataene om, at stromale celler sørger for dannelsen af et hæmatopoietisk mikromiljø. Tilsyneladende svarer skabelsen af et hæmatopoietisk mikromiljø til et vist niveau af stromal vævsregenerering, og antallet af hæmatopoietiske celler stiger med udvidelsen af den stromale platform, der er egnet til hæmatopoiese.

Af størst interesse er forfatternes data om, at antallet af stromale progenitorceller i de fjerne dele af skelettet stiger umiddelbart efter curettage. Fra den sjette time og op til den tyvende dag inklusive observeres en mere end dobbelt stigning i både koncentrationen og antallet af celler, der danner fibroblastkolonier, i den kontralaterale tibia. Mekanismen bag dette fænomen er sandsynligvis forbundet med det faktum, at massiv knoglemarvsskade fører til dannelsen af et stort antal blodpropper med samtidig ødelæggelse af et betydeligt antal blodplader og frigivelse af blodpladeafledt vækstfaktor (PDGF) i blodet, hvilket vides at forårsage proliferation af celler, der danner fibroblastkolonier, placeret i kroppen uden for den proliferative pool. I forsøg på kaniner fremmer lokal administration af MSC'er genoprettelsen af bruskvæv i det kirurgisk beskadigede knæled, hvilket kan være forbundet med dannelsen af chondrocytter, der stammer fra de injicerede MSC'er. Imidlertid forbedres reparativ regenerering af knogledefekter hos laboratorierotter betydeligt ved at anvende mesenkymale stamceller indesluttet i et keramisk rammeværk. Det kan derfor antages, at hvis ikke RBOC, så udøver en anden faktor, der stammer fra beskadigede stromale celler, en fjern stimulerende effekt på proliferationen af mesenkymale progenitorceller i intakte knoglemarvszoner og stimulerer deres migration til knoglemarvsdefektområdet. Dette modsiges til gengæld af litteraturdata fra tidligere år, der indikerer, at stromale celler, der er ansvarlige for mikromiljøet, i modsætning til hæmatopoietiske celler, ikke er i stand til at migrere og stammer fra lokale kilder.

Ikke desto mindre indikerer resultaterne af undersøgelsen foretaget af Yu. Gerasimov og medforfattere (2001), at mekanisk traume ikke blot forårsager en skarp omstrukturering af stromavævet i den kurerede knogle, men også betydelige ændringer i stroma i fjerne intakte knogler, dvs. der er en systemisk reaktion i stromavævet på lokalt traume. Desuden, når polytraume påføres - multiple curettage - forstærkes denne reaktion og observeres ikke kun i den opererede knogle og fjerne dele af skelettet, men også i lymfoide organer, især i milten. Mekanismen bag en sådan systemisk reaktion i stromavævet i knoglemarven og milten på lokalt traume og polytraume forbliver ukendt. Det antages, at denne proces er forbundet med virkningen af en humoral faktor, der udskilles af det mesenkymale stroma i knoglemarvens medullære hulrum. Muligheden for produktion af en organuspecifik humoral faktor, der er ansvarlig for proliferationen af celler, der danner fibroblastkolonier, af stromale celler i knoglemarv og milt, fremgår af data om deres kolonistimulerende aktivitet i monolagskulturer af knoglemarv.

I denne henseende er det værd at bemærke, at ved systemisk administration af multipotente mesenkymale progenitorceller repopulerer deres derivater ikke kun knoglemarv, men også andre væv, hvilket især anvendes til genterapi. Det er blevet vist, at ved intravenøs administration af store mængder MSC'er med et vildtypegenom til mus med en mutation i kollagen I-genet erstatter donorceller op til 30% af cellerne i knogle- og bruskvævet hos recipienter, og transficerede musemesenkymale stamceller, der udskiller humant IL-3, understøtter effektivt hæmatopoiesen i 9 måneder i tilfælde af samtidig administration med humane hæmatopoietiske stamceller til immundefekte mus.

[ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ]

Genetisk modifikation af mesenkymale stamceller

Blandt succeserne med eksperimentel genetisk modifikation af MSC'er er det værd at bemærke transfektionen af faktor IX-genet ind i humane MSC'er med efterfølgende overførsel af transfektante celler til immundefekte mus, hvilket fører til forekomsten af antihæmofil faktor B i blodet i 8 uger efter transplantation. I dette eksperiment blev posttranslationel modifikation af faktor IX med y-glutamylcarboxylase udført i de transfekterede celler. Transduktion af MSC'er med en retroviral vektor, der koder for human faktor IX, var mindre vellykket - efterfølgende administration af disse celler til en hund med hæmofili B gav et terapeutisk niveau af faktor IX, hvilket opretholdt normal intensitet af koagulationshæmostasen, i kun 12 dage.

Transplantation af mesenkymale stamceller ind i hjerneparenkym hos dyr har vist, at umodne donorceller transformeres til både neuronale og gliale populationer. Indpodning af neuronale derivater fra sundt donor-mesenkymalt væv gør det teoretisk muligt at korrigere genetiske abnormiteter i hjernemetabolismen hos patienter med Gauchers sygdom og andre lidelser i lipid-, gangliosid- eller kulhydratmetabolismen.

Den eksperimentelle søgning efter betingelser for transdifferentiering af stromale stamceller fra knoglemarv til neurale og levervævsprogenitorceller er i gang. Forskernes opmærksomhed er fokuseret på kombinationer af differentieringsinduktorer og specielle konditionerede medier. Især for at isolere den primære kultur af stromale celler podes knoglemarvsceller vasket og resuspenderet i DMEM/F12 (1/1) dyrkningsmedium med 10% føtalt kalveserum ved en densitet på 200.000/cm2. Efter 24 timer fjernes ikke-adhærente celler, og fibroblastlignende celler bundet til plastikken dyrkes i en uge. Til differentiering af knoglemarvsstromale celler til neuroblaster anvendes et konditioneret medium opnået ved tre dages dyrkning af den primære kultur af museembryonale fibroblaster, samt DMEM/F12-medium (1/1) med 2% føtalt kalveserum og tilsætning af 20 ng/ml NF eller 10-6 M retinsyre (neuroinducere, der anvendes til neural differentiering af muse- og humane embryonale stamceller). Differentiering af knoglemarvsstromale celler til hepatocytforløberceller induceres i et konditioneret medium skabt som et resultat af tre dages dyrkning af den primære kultur af museembryonale leverceller i DMEM/F12-medium (1/1) med tilsætning af 10% føtalt kalveserum.

Her skal det endnu engang bemærkes, at de kolonidannende celler i knoglemarvsstroma er heteromorfe og kan opdeles i to typer. Den første type omfatter fibroblastlignende celler, der danner filopodier med store kerner og en eller to nukleoler. Den anden type er repræsenteret af små spindelformede celler. Når celler af begge typer dyrkes i et konditioneret medium opnået på et fødelag af primære museembryonale fibroblaster, fremkommer celler, der ligner neuroblaster, i kulturen på 3. til 4. dag. På dette stadie har de oftest en spindelformet form med en eller to lange udløbere, der ender i filopodier. Mindre almindelige er pyramideformede eller stjerneformede celler med korte dendritter. Dendritterne hos nogle neuroblaster har karakteristiske udvidelser (vækstknopper) og grene i deres distale del, mens andre har tydelige vækstkegler med filopodier, hvorigennem dendritterne vokser. Lignende morfologiske træk (knopper og vækstkegler med filopodier), der er iboende i neuroblaster, der differentierer til neuroner, er blevet beskrevet i detaljer i studier af neurogenese. Baseret på dette konkluderer nogle forfattere, at de celler, de fandt i kulturen, er neuroblaster. Især E. Shchegelskaya og medforfattere (2002) fandt efter dyrkning af en primærkultur af stromale celler i to uger i et konditioneret medium, der blev skiftet hver 3. til 4. dag, at nogle af cellerne prolifererede, mens de opretholdt en udifferentieret tilstand. Udadtil lignede sådanne celler fibroblaster og blev detekteret i kulturen sammen med differentierende neuroblaster. Størstedelen af cellerne (ca. 80%) var på forskellige stadier af differentiering til celler i nervevævet, primært til neuroner. De dendritiske processer i disse celler var i tæt kontakt med hinanden, således at cellerne gradvist dannede sektioner af nervenetværket på substratet i form af lange flercellede tråde. Neuroblasternes dendritiske processer blev betydeligt længere, nogle af dem oversteg selve neuronkroppens længde med 8-10 gange. Andelen af pyramideformede og stellatformede celler steg gradvist. Dendritterne i stellatformede celler forgrenede sig. Ifølge forfatterne svarer den senere differentiering af pyramideformede og stellatformede celler sammenlignet med spindelformede celler til rækkefølgen af stadier i normal neurogenese hos dyr. Som et resultat konkluderer forfatterne, at knoglemarvsstromale stamceller undergår induceret neurogenese, hvor alle tre hovedtyper af neuroner dannes fra neuroblaster in vitro. Nervecelleforløbere blev også detekteret under dyrkning af knoglemarvsstromale celler i 3-4 dage i et medium med 2% føtalt serum og 20 ng/ml LIF. Men i dette tilfælde delte stamcellerne sig meget langsomt, neuroblastdifferentiering forekom kun i 30% af tilfældene, og de dannede ikke neuronale netværk. Ved at bruge retinsyre som en af induktorerne af nervecelledifferentiering opnåede forfatterne op til 25-30% af nervecellerne i kulturen,med overvejende gliale elementer - astrocytter og oligodendrocytter. Neuroner udgjorde kun en tredjedel af alle nerveceller, selvom de var repræsenteret af alle tre typer: spindelformede, pyramideformede og stjerneformede celler. På den 6. dag efter dyrkning af stromale celler i et medium med retinsyre blev nervecellerne mere differentierede, og axoner blev fundet i individuelle pyramideformede neuroner, som i normal neuroontogenese optræder senere end dannelsen af dendritiske processer. Ifølge forfatterne har retinsyreinduktionsmetoden, på trods af det lave udbytte af nerveceller, sine fordele: oligodendrocytter og astrocytter udfører myeliniserende og ernæringsmæssige funktioner under væksten af dendritter og axoner og er nødvendige for den normale dannelse af nervevæv. Derfor er det bedre at anvende en suspension af neuroner beriget med gliaceller til reparation af dets beskadigede områder in vivo.

I den anden serie af eksperimenter forsøgte forfatterne at inducere differentiering af knoglemarvsstromale celler til leverceller. Efter tre dages dyrkning af knoglemarvsstromale stamceller i et konditioneret medium opnået ved inkubation af museembryonale hepatocytter, blev der fundet store, sfæriske celler, ofte binukleære, med cytoplasmatiske inklusioner af varierende størrelser. Disse celler var på forskellige differentieringsstadier og varierede i størrelse, antal kerner og inklusioner i cytoplasmaet. Glykogen blev detekteret i de fleste af disse celler, på baggrund af hvilket forfatterne identificerede dem som hepatocyt-forløberceller. Da der ikke blev fundet celler svarende til neuroblaster i kulturen, blev det konkluderet, at det konditionerede medium opnået som følge af dyrkning af embryonale hepatocytter manglede differentieringsfaktorer for nerveceller og omvendt indeholdt faktorer, der inducerer differentiering af knoglemarvsstromale celler til hepatocyt-forløberceller. Afslutningsvis foreslår forfatterne tilstedeværelsen af pluripotens i knoglemarvsstromale celler, da de differentierer in vitro til nerve- eller levervævsceller afhængigt af det specifikke konditionerede medium og de anvendte induktorer.

Nogle undersøgelser har faktisk korrekt vist differentieringen af knoglemarvsstromale celler til kardiomyocytter, brusk, knoglevæv og nervevævsceller. Der er tegn på, at der blandt knoglemarvsceller findes populationer af stamceller, der er i stand til at differentiere til hepatocytter. I lyset af disse data kan resultaterne af ovenstående eksperimenter på mus stadig betragtes som en yderligere bekræftelse af tilstedeværelsen i knoglemarven af pluripotente mesenkymale stamceller, der er i stand til at differentiere til celler fra forskellige væv i en voksen organisme.

Mesenkymal stamcelletransplantation

I klinisk transplantologi kan humane mesenkymale stamceller bruges til at sikre ekspansion af hæmatopoietiske stamceller, såvel som deres tidlige prædefinerede efterkommere. Især introduktion af autologe hæmatopoietiske stamceller og MSC'er til kræftpatienter efter højdosis kemoterapi accelererer genoprettelsen af antallet af neutrofiler og blodplader i det perifere blod. Allo- og autologe transplantationer af mesenkymale stamceller anvendes til behandling af multipelt myelom, aplastisk anæmi og spontan trombocytopeni - sygdomme forbundet med en primær defekt i stroma i hæmatopoietisk væv. Effektiviteten af celleterapi i onkohæmatologisk patologi er i mange tilfælde højere ved samtidig introduktion af stromale og hæmatopoietiske stamceller, hvilket manifesterer sig ved en reduktion i den postoperative periode for hæmatopoiese-genoprettelse, et fald i antallet af dødelige udfald på grund af ikke-selektiv destruktion af regionale og cirkulerende kræftceller, hvor patientens egne hæmatopoietiske stamceller også dør. Udsigterne til at anvende MSC'er og andre multipotente mesenkymale progenitorceller i klinisk praksis skyldes den relative lethed, det er at udvinde dem fra knoglemarvsaspirater, ekspansion i kultur og transfektion af terapeutiske gener. Samtidig kan lokal implantation af multipotente mesenkymale progenitorceller bruges til at kompensere for lokale vævsdefekter, og i tilfælde af systemiske dysfunktioner i væv af mesenkymal oprindelse er deres introduktion i den generelle blodbane ikke udelukket.

Forfatterne til værker, hvor udsigterne for brugen af MSC'er til lokal, systemisk transplantation og genterapi analyseres ud fra et stromalt cellebiologisk synspunkt, er mere forsigtige i deres argumentation. Postnatal knoglemarv betragtes traditionelt som et organ bestående af to hovedsystemer af klart definerede cellelinjer - selve det hæmatopoietiske væv og det understøttende stroma, der er forbundet med det. Derfor blev mesenkymale stamceller fra knoglemarven oprindeligt udelukkende betragtet som en kilde til stromal basis for produktionen af regulatoriske faktorer i det hæmatopoietiske mikromiljø. Derefter skiftede forskernes opmærksomhed til at studere MSC'ers rolle som en stamkilde til skeletvæv. De seneste data indikerer et uventet potentiale for differentiering af stromale celler fra knoglemarven med dannelsen af neuralt eller muskelvæv. Med andre ord udviser mesenkymale stamceller transgermal plasticitet - evnen til at differentiere til celletyper, der fænotypisk ikke er relateret til cellerne i det oprindelige væv. Samtidig forbliver nogle aspekter af biologien af knoglemarvsstromale celler uklare og uafklarede, både generelt biologiske og individuelle detaljer, herunder identifikation, natur, oprindelse, udvikling og funktion in vivo af knoglemarvsstromale celler, samt det tilladte differentieringspotentiale ex vivo og mulighederne for terapeutisk anvendelse in vivo. De opnåede data om MSC'ers potentiale, såvel som resultaterne af undersøgelser af andre stamcellers regenerative potentiale, er i skarp modstrid med de dogmer, der er etableret i biologien.

Når de dyrkes ved lav densitet, danner stromale stamceller fra knoglemarv distinkte kolonier, der hver stammer fra en enkelt progenitorcelle. Procentdelen af stromale progenitorceller i kerneholdige knoglemarvsceller, bestemt af kolonidannende evne, er stærkt afhængig af både dyrkningsbetingelser og MSC-arter. For eksempel er tilstedeværelsen af bestrålede knoglemarvsfødeceller og serum i kulturen absolut nødvendig hos gnavere for at opnå det maksimale antal stromale progenitorceller, hvorimod den kolonidannende effektivitet af mesenkymale stamceller hos mennesker er uafhængig af både fødemediet og dyrkningsmediet. Antallet af kendte mitogene faktorer, der stimulerer stromal progenitorcelleproliferation, er begrænset. Disse omfatter PDGF, EGF, FGF, TGF-b og IGF1. Under optimale dyrkningsbetingelser kan polyklonale MSC-linjer modstå mere end 50 celledelinger in vitro, hvilket gør det muligt at opnå milliarder af stromale knoglemarvsceller fra 1 ml af dens aspirat.

Populationen af stromale celler i knoglemarven er imidlertid heterogen, hvilket manifesterer sig både ved variation i kolonistørrelser, forskellige dannelseshastigheder og en varieret cellulær morfologi, der dækker spektret fra fibroblastlignende spindelformede til store flade celler. Under udviklingen af sådanne kulturer bemærkes også fænotypisk heterogenitet efter 20 dage. Nogle kolonier er karakteriseret ved høj ekspression af alkalisk fosfatase, andre udtrykker det slet ikke, og kolonier af den tredje type er fosfatase-positive i den centrale region og fosfatase-negative i periferien. Individuelle kolonier danner knuder af knoglevæv (begyndelsen af matrixmineralisering markeres ved farvning med alizarinrødt eller for calcium ifølge Van Koss). I andre kolonier forekommer fedtophobning, identificeret ved G-farvning med olierødt. Sjældnere danner kolonier af mesenkymale stamceller brusk farvet med Alcianblåt).

Efter ektopisk transplantation til forsøgsdyr danner polyklonale MGK-linjer ektopisk knogle med et retikulært stroma forbundet med myelopoiese og adipocytter, og, mindre almindeligt, med bruskvæv. Når monoklonale linjer af knoglemarvsstromale celler transplanteres, observeres kimærisme i nogle tilfælde, hvor de novo-knoglen består af knoglevævsceller, indeholder stroma og adipocytter af donoroprindelse, mens cellerne fra den hæmatopoietiske afstamning og det vaskulære system stammer fra recipienten.

Resultaterne af disse undersøgelser bekræfter stamcellernes natur i den stromale stamcelle fra knoglemarven, hvorfra den klonale linje blev afledt. De indikerer også, at ikke alle celler, der er klonogene i kultur, er virkelig multipotente stamceller. Nogle forskere mener, og vi deler deres opfattelse, at den mest pålidelige information om det reelle differentieringspotentiale for individuelle kloner kun kan opnås in vivo efter transplantation og ikke ved at bestemme fænotypen af deres derivater in vitro. Ekspressionen i kultur af fænotypiske markører for osteo-, kondro- eller adipogenese (bestemt ved mRNA eller ved histokemiske teknikker) og selv produktionen af mineraliseret matrix afspejler ikke graden af pluripotens af en individuel klon in vivo. Derfor er identifikation af stamceller i en gruppe af stromale celler kun mulig a posteriori under de passende betingelser i et biologisk transplantationsassay. Især observeres kondrogenese meget sjældent i åbne transplantationssystemer, hvorimod bruskdannelse langt fra er ualmindelig i lukkede systemer såsom diffusionskamre eller in vitro-mikromassekulturer af stromale celler, hvor der opnås lokalt lavt ilttryk, hvilket fremmer dannelsen af bruskvæv. Derfor påvirker selv transplantationsteknikken, såvel som ikke-specifikke in vitro-kulturbetingelser, betydeligt omfanget af MSC-differentiering.

Eksperimentel transplantation under specificerede eksperimentelle forhold er guldstandarden for bestemmelse af differentieringspotentialet for knoglemarvsstromale celler og et nøgleelement i deres identifikation. Historisk set er studier af knoglemarvsstromale celletransplantationer forbundet med det generelle problem med knoglemarvstransplantation. Det er blevet fastslået, at det hæmatopoietiske mikromiljø skabes ved transplantation af knoglemarvsstromale cellelinjer og giver ektopisk udvikling af hæmatopoietisk væv i transplantationszonen. Oprindelsen af mikromiljøet fra donoren og det hæmatopoietiske væv fra værten giver os mulighed for at betragte ektopisk knogle som en ægte "inverteret" knoglemarvstransplantation. Lokal transplantation af knoglemarvsstromale celler fremmer effektiv korrektion af knogledefekter, mere udtalt end ved spontan reparativ regenerering. Adskillige prækliniske studier af eksperimentelle modeller har overbevisende vist muligheden for at anvende knoglemarvsstromale celletransplantationer i ortopædi, selvom det mest omhyggelige arbejde og analyse er nødvendigt for at optimere disse metoder, selv i de enkleste tilfælde. Især er de optimale betingelser for ekspansion af osteogene stromale celler ex vivo endnu ikke fastlagt, strukturen og sammensætningen af den ideelle bærer, såvel som antallet af celler, der er nødvendige for volumetrisk knogleregenerering, forbliver uudviklede.

Ud over brugen af ex vivo-ekspanderede knoglemarvsstromale celler til regenerering af væv af mesenkymal oprindelse, åbner MSC'ers uortodokse plasticitet op for potentielle anvendelser til regenerering af neurale celler eller levering af genprodukter til CNS. I princippet forenkler dette celleterapi for skader på nervesystemet, da der ikke er behov for at indhente autologe humane neurale stamceller. Potentielle anvendelser af knoglemarvsceller til generering af kardiomyocytter og myogene progenitorceller af både ægte stromal og ekstrastromal oprindelse er blevet rapporteret.

Der udføres eksperimenter med systemisk transplantation af knoglemarvsstromale celler til behandling af almindelige skeletsygdomme. Der er ingen tvivl om, at knoglemarvsstromale celler er den population, der er ansvarlig for genetiske lidelser i skeletsygdomme, hvilket illustreres godt af vektoroverførslen af genetisk information ved hjælp af disse celler, hvilket fører til dannelsen af patologisk knoglevæv hos forsøgsdyr. Stromale cellers evne til at implantere, indpode, proliferere og differentiere i skeletknogler efter introduktion i den generelle blodbane er dog endnu ikke blevet bevist.

Dette skyldes delvist, at stroma ved standard knoglemarvstransplantation ikke transplanteres sammen med det hæmatopoietiske væv, så der er endnu ikke udviklet strenge kriterier for vurdering af vellykket engraftment af systemisk administrerede stromale celler. Det skal huskes, at tilstedeværelsen af markørgener i vævsekstrakter eller isolering af celler af donoroprindelse i kultur ikke indikerer engraftment af cellerne, men kun deres overlevelse. Selv intraarteriel injektion af knoglemarvsstromale celler i en museben kan føre til praktisk talt ingen engraftment, på trods af at celler af donoroprindelse findes i stort antal i knoglemarvsmikrovaskulaturen. Desværre beskrives sådanne celler normalt som "engrafted" blot på baggrund af detektion af markørgener for donorceller i ex vivo-kultur. Derudover skal der fremlægges overbevisende beviser for langsigtet integration af differentierede og funktionelt aktive celler af donoroprindelse i de undersøgte væv. I mange publicerede artikler, der rapporterer om engraftment af knoglemarvsstromale celler i skelettet, er fraværet af klare data af denne art slående. Det skal dog bemærkes, at nogle korrekte dyreforsøg faktisk har etableret en begrænset, men reel engraftment af stromale progenitorceller efter deres systemiske administration.

Disse data er i overensstemmelse med resultaterne af undersøgelser af muligheden for at levere myogene stamceller fra knoglemarv til muskler via det vaskulære system. Det bør dog ikke glemmes, at både skelet- og muskelvæv dannes under udvikling og vækst baseret på ekstravaskulære cellebevægelser, der bruger migrationsprocesser, der ikke involverer blodcirkulation. Hvis der findes en uafhængig kredsløbsvej til levering af stamceller til fastfasevæv, er det så muligt at antage eksistensen af fysiologisk cirkulerende mesenkymale stamceller? Hvad er oprindelsen af disse celler i både den udviklende og postnatale organisme, og hvordan trænger de ind i karvæggen? Løsningen på disse spørgsmål synes absolut nødvendig og kræver den mest omhyggelige prækliniske analyse. Selv efter at svarene på disse spørgsmål er fundet, vil problematiske kinetiske aspekter forbundet med skeletvækst og bindevævsombygning forblive uløste. Samtidig synes behandling af osteogeneseforstyrrelser ved at erstatte hele populationen af muterede skeletstamceller med sunde stromale elementer at være et reelt klinisk perspektiv. I dette tilfælde kan lokale frakturzoner eller deformationer på grund af patologisk osteogenese, såvel som destruktive ændringer i knoglevæv, korrigeres ved hjælp af stromale stamceller dyrket in vitro. Derfor er det tilrådeligt at fokusere fremtidig forskning på problemerne med transformation eller genetisk korrektion af autologe muterede osteogene progenitorceller ex vivo.

Genteknologi af celler, kortvarig eller permanent, er blevet grundlaget for cellulær og molekylærbiologi og kilden til mange videnskabelige opdagelser vedrørende individuelle proteiners rolle i cellulær metabolisme in vitro og in vivo. Brugen af molekylære teknologier til korrektion af arvelig patologi og menneskelige sygdomme er meget lovende for praktisk medicin, da egenskaberne ved stromale stamceller fra knoglemarv gør det muligt at udvikle unikke transplantationsordninger til korrektion af genetiske sygdomme i skelettet. Samtidig kan mesenkymale precursorceller let udvindes fra den fremtidige modtager, de er modtagelige for genetisk manipulation og er i stand til at formere sig i store mængder på kort tid. Brugen af mesenkymale stamceller gør det muligt at undgå de begrænsninger og risici, der er forbundet med levering af genetisk informationsmateriale direkte til patienten gennem intravaskulære vektorkonstruktioner. En lignende strategi gælder for embryonale stamceller, men autologe postnatale stromale celler fra knoglemarv er et mere foretrukket materiale, da deres introduktion udelukker mulige immunologiske komplikationer efter transplantation. For at opnå en kortsigtet effekt, for eksempel for at accelerere knogleregenerering, er den mest optimale metode genetisk modifikation af mesenkymale stamceller ved hjælp af elektroporation, kemisk fusion, lipofektion, plasmider og adenovirale konstruktioner. Især viral transfektion ind i knoglemarvsstromale celler, BMP-2, har vist sig effektiv til at accelerere knogleregenerering ved eksperimentel polytraume. Oprettelsen af adenovirale vektorkonstruktioner foretrækkes på grund af fraværet af toksicitet. Imidlertid er genetisk modifikation af knoglemarvsstromale celler i dette tilfælde karakteriseret ved ekstremt lav stabilitet. Derudover kræver normale transformerede knoglemarvsstromale celler brugen af vektorbærere af genetisk information, der er 10 gange mere infektiøse end andre celletyper, hvilket øger procentdelen af død af transfekterede celler betydeligt.

Behandling af recessive sygdomme forårsaget af lav eller ingen biologisk aktivitet af visse gener kræver langvarig eller permanent modifikation af mesenkymale stamceller, hvilket kræver brug af adenoassocierede vira, retrovira, lentivira eller adeno-retrovirale kimærer. Transportregionerne af disse vira er i stand til at overføre store DNA-transfekter (op til 8 kb). Den videnskabelige litteratur har allerede rapporteret om den eksogene biologiske aktivitet af knoglemarvsstromale celler transficeret med retrovirale konstruktioner, der koder for syntesen af regulatoriske og markørmolekyler - IL-3, CD2, faktor VIII, samt enzymer involveret i syntesen af L-DOPA. Men selv i disse undersøgelser påpeger forfatterne en række begrænsninger, der skal overvindes, før denne teknologi kan anvendes i praksis. Det første problem er at optimere processen med MSC-modifikation ex vivo. Det er kendt, at langvarig (3-4 uger) proliferation af knoglemarvsstromale celler in vitro reducerer deres transfektion. Samtidig er det nødvendigt at udføre flere transfektionscyklusser for at opnå et højt niveau af genetisk modifikation af MSC'er. Det andet problem er forbundet med varigheden af terapeutisk genekspression, som endnu ikke overstiger fire måneder. Et naturligt fald i effektiv genekspression skyldes promotorinaktivering og død af modificerede celler. Med de generelle udsigter til at overføre genetisk information ved hjælp af mesenkymale stamceller indikerer resultaterne af foreløbige undersøgelser behovet for yderligere optimering af ex vivo transfektionsmetoder, valg af en passende promotor, der regulerer biologisk aktivitet i den ønskede retning, og en stigning i modificerede knoglemarvsstromale cellers evne til selvvedligeholdelse in vivo efter transplantation. Det skal bemærkes, at brugen af retrovirale konstruktioner til at modificere knoglemarvsstromale celler i den ønskede retning ikke altid kræver deres obligatoriske indpodning. Transficerede mesenkymale stamceller kan udføre en korrigerende funktion på baggrund af stabil opholdstid og uden obligatorisk aktiv fysisk inkorporering og funktion i bindevæv. I dette tilfælde bør de betragtes som en biologisk minipumpe, der in vivo producerer en faktor, hvis mangel bestemmer manifestationen af genetisk patologi.

Brugen af transformerede knoglemarvsstromale celler til behandling af dominant genetisk patologi, som er karakteriseret ved ekspressionen af et gen med patologisk eller unormal biologisk aktivitet, er langt mere problematisk, da det i dette tilfælde er nødvendigt at blokere overførslen eller implementeringen af forvrænget genetisk information. En af metoderne til genteknologi er homolog rekombination af embryonale stamceller for at skabe transgene dyr. Den ekstremt lave grad af homolog rekombination i kombination med problemerne med identifikation, separation og ekspansion af sådanne rekombinanter vil dog sandsynligvis ikke bidrage til den udbredte anvendelse af denne metode i den nærmeste fremtid, selvom nye teknologiske metoder udvikles. Den anden tilgang i genterapi af dominant patologi er baseret på automatisk korrektion af beskadiget DNA, da genetiske mutationer kan korrigeres ved at introducere eksogent DNA med den ønskede sekvens (korte DNA-oligonukleotider eller kimære RNA/DNA-oligonukleotider), som binder til homologer i det beskadigede genom. Den tredje mulighed involverer blokering af transmissionen af patologisk information, hvilket opnås ved brug af specifikt designede oligonukleotider, der binder til et specifikt gen for at danne en ternær spiralstruktur, der eliminerer muligheden for transkription.

Selvom korrektion af en genetisk sygdom på genomniveau fortsat er den mest optimale og foretrukne terapeutiske metode, er mRNA også en lovende vektor (muligvis endnu mere tilgængelig) til at blokere et dominant negativt gen. Proteinmolekyler med antisense-oligonukleotid eller komplette sekvenser, der blokerer mRNA-binding til det cellulære biosyntetiske apparat, har længe været brugt til at hæmme translation og/eller øge mRNA-nedbrydning. Derudover inducerer dobbeltstrenget RNA hurtig mRNA-nedbrydning, hvis mekanisme stadig er uklar. Det er dog usandsynligt, at blot eliminering af mRNA'er transkriberet fra en mutant allel med korte eller enkelte mutationer vil fremme ekspressionen af mRNA fra den normale allel. Et alternativ er brugen af hammerhoved- og hårnåle-ribosynteser, som har evnen til at binde til meget specifikke regioner af mRNA med efterfølgende induktion af deres spaltning og inaktivering under translation. Muligheden for at anvende denne metode i behandlingen af patologisk osteogenese undersøges i øjeblikket. Uanset hvad målet præcist er - genomiske eller cytoplasmatiske elementer - vil succesen med nye genterapiteknologier blive bestemt af effektiviteten af inkluderingen af reagenser i knoglemarvsstromale celler ex vivo, det optimale valg af en specifik vektor og mesenkymale stamcellers stabile evne til at udtrykke de nødvendige faktorer in vivo.

Opdagelsen af mesenkymale stamceller med deres uventede egenskaber skaber således et nyt konceptuelt skema for udvikling af cellelinjer. Yderligere tværfaglig forskning er dog nødvendig for at forstå den biologiske rolle af stromale stamceller, deres natur, deres evne til at transdifferentiere eller dedifferentiere, deres fysiologiske betydning under embryonal udvikling, postnatal vækst, modning og aldring, samt i forbindelse med menneskelige sygdomme.