Hæmatopoietiske stamceller

Hæmatopoietiske stamceller (HSC'er) som mesenchymale progenitorceller er kendetegnet ved multipotency og give anledning til cellelinier, endelige elementer, som danner blodceller og nogle specialiserede væv celler i immunsystemet.

Hypotesen om, at der foreligger en fælles forfader af alle blodceller, samt udtrykket "stamcelle", der ejes af A. Maximov (1909) den potentielle dannelse af cellemasse fra GSK enorme -. Knoglemarvsstamceller producere den 10. Dag celler, der udgør blodlegemer i selve perifere. Eksistensen af hæmatopoietiske stamceller blev etableret i 1961 i forsøg med genvinding af hæmatopoiese i mus, der modtager en dødelig dosis af stråling, der ødelægger knoglemarvsstamceller. Pos dvs. Transplantation af syngene knoglemarvsceller så letalt bestrålede dyr diskrete foci af hæmatopoiese blev påvist i milten for modtagere hvis kilde - single klonogene progenitorceller.

Derefter blev hæmopoietiske stamcellers evne til selvstøtte demonstreret, hvilket tilvejebringer funktionen af hæmatopoiesis under ontogenese. I forbindelse med embryonal udvikling er HSC karakteriseret ved høj migrationsaktivitet, som er nødvendig for deres migration til de hæmatopoietiske organers lokaliteter. Denne egenskab af HSC'er bevares også i ontogenese - på grund af deres konstante migration opstår der en permanent fornyelse af puljen af immunkompetente celler. Evnen af GSK migration, penetration gennem blod-vævsbarrierer, implantation i vævsvækst og klonogeniske dannede grundlag for knoglemarvstransplantation celler i en række af sygdomme forbundet med lidelser i det hæmopoietiske system.

Ligesom alle stamcellens ressourcer er hæmatopoietiske stamceller til stede i deres niche (knoglemarv) i meget små mængder, hvilket medfører visse vanskeligheder ved deres tildeling. Immunfænotypiske humane HSC'er er karakteriseret som CD34 + NK-celler er i stand til at migrere ind i blodbanen og kolonisere organer i immunsystemet eller til at genbefolke knoglemarvsstroma. Det er nødvendigt klart at forstå, at GSK er ikke de mest umodne knoglemarvsceller, og er afledt af forstadier, som omfatter dormantnye fibroblast SB34-negative celler. Det konstateredes, at cellerne med fænotypen af CD34 er i stand til at komme ind i blodbanen, hvor ændre deres fænotype i CD34 +, men returmigration i knoglemarven under påvirkning af mikromiljøet igen blive CD34-negativ stamcelle elementer. I hvile reagerer CD34-celler ikke på parakrine regulatoriske stromalsignaler (vækstfaktorer, cytokiner). Men i situationer, der kræver forstærkning intensitet hæmatopoietiske stamceller med fænotypen CD34 svare differentieringssignaler danne både hæmatopoietiske og mesenkymale stamceller. Hæmatopoiese udføres ved direkte kontakt med GSK cellulære elementer af knoglemarvsstroma præsenterede et komplekst netværk af makrofager, retikulære endothelceller, osteoblaster, stromale fibroblaster og ekstracellulære matrix. Knoglemarvsstromaceller rammer - ikke kun en matrix eller et "skelet" for hæmatopoietisk væv, det bærer fint regulering af hæmatopoiese grund parakrine regulatoriske signaler af vækstfaktorer, cytokiner og chemokiner, og giver også adhæsive interaktioner er nødvendige for dannelsen af blodceller.

Grundlaget for det konstant opdaterede hemopoiesis-system er således den hæmopoietiske stamcelle, der er i stand til langvarig selvvedligeholdelse, polypotent (fra hæmopoiesisperspektivet). Under processen med at begå, undergår HSC'er primær differentiering og danner kloner af celler, der adskiller sig i deres cytomorfologiske og immunofenotypiske egenskaber. Den konsekutive dannelse af primitive og engagerede progenitorceller afsluttes ved dannelsen af morfologisk identificerbare stamceller fra forskellige hæmatopoietiske linjer. Resultatet af efterfølgende trin kompleks flertrinsproces er modningen af hæmatopoietiske celler og udbytte modne til perifert blod dannede elementer - erythrocytter, leukocytter, lymfocytter og blodplader.

[1], [2], [3],

Kilder til hæmatopoietiske stamceller

Hæmatopoietiske stamceller der betragtes som de mest studerede stamceller kilde, som i høj grad skyldes deres anvendelse i klinikken af knoglemarvstransplantation. Ved første øjekast er der meget kendt om disse celler. Til en vis grad dette er sandt, eftersom de mellemliggende og modne efterkommere GSK - de mest overkommelige cellulære elementer, som hver især (erytrocytter, leukocytter, lymfocytter, monocytter / makrofager og blodplader) er grundigt undersøgt på alle niveauer - fra lys til elektronmikroskopi fra biokemiske og immunofenotypiske egenskaber før identifikation ved PCR-analyse. Men overvågningen udføres af morfologiske, ultrastrukturelle, biokemiske, immunfænotypisk, og biofysiske parametre af genomisk GSK har ikke givet svar på mange problematiske forhold, er nødvendigt for udviklingen af celletransplantation hvis løsning. Det er stadig ikke etableret stabiliseringsmekanismer GSK i sovende tilstand, er de aktiverede, indtaste den fase af symmetrisk eller asymmetrisk deling, og vigtigst - engagement til uddannelse som funktionelt forskellige blodceller, erythrocytter, leukocytter, lymfocytter og blodplader.

Tilstedeværelsen i knoglemarvscellerne med fænotypen af CD34, som er de forfædre både mesenchymale og hæmatopoietiske stamceller har rejst spørgsmålet om eksistensen af de tidligste tæt på CD34 negative celler i progenitor celledifferentiering og hæmatopoietisk stromale linje. Langvarig dyrkningsmetode blev opnået ved den såkaldte langtidsdyrkning "indledning 'celler (langtidskultur-initierende celle - LTC-IC). Levetiden af sådanne progenitorceller i kolonidannende aktivitet af knoglemarvsstromaceller baseret på en kombination af vækstfaktorer er mere end 5 uger, mens levedygtigheden af engagerede kolonidannende enheder (CFU) i kulturen på kun 3 uger. Det antages for tiden, at LTC-IC - funktionel analog GCW som repopulyatsionnom ved en høj spænding på ca. 20% LTC-IC er kendetegnet ved en fænotype CD34 + CD38 og udviser en høj kapacitet for selvfornyelse. Sådanne celler findes i humant knoglemarv med frekvensen 1:50 000. Imidlertid bør det anerkendes limfoidoinitsiiruyuschie-myeloide celler tættest på HSC som opnås under betingelser med langvarig (15 uger) af kulturen. Sådanne celler betegnes som LTC, blandt humane knoglemarvsceller findes i 10 gange mindre end den LTC-IC, og er udformet som en myeloide cellelinier og lymfoide hæmopoietiske stamceller.

Selvom hæmatopoietiske stamceller mærkning med monoklonale antistoffer, efterfulgt af identifikation af immunfænotypisk er den vigtigste metode til identificering og selektiv sortering af hæmatopoietiske stamceller med den potentielle kliniske anvendelse af dedikerede GSK således begrænset. Blokerende CD34 receptor antistoffer eller andre markør antigener under sortering immunpositive uundgåeligt ændrer egenskaberne af celler isoleret med det. Mere foretrukket er den immun-negative sekretion af HSC på magnetiske søjler. Men i dette tilfælde, sortering anvendes sædvanligvis monoklonale antistoffer, på et metalsubstrat. Også vigtigere, både metoden til fordeling af GSK baseret på fænotypiske snarere end funktionelle egenskaber. Derfor er mange forskere foretrækker at bruge analysen af klonogene parametre GSK, der tillader størrelsen og sammensætningen af kolonierne til bestemmelse af graden af modenhed og retning af differentiering af stamceller. Det er kendt, at i processen med at begå antallet af celler og antallet af typer i kolonierne reduceres. Hæmatopoietisk stamcelletransplantation og dets datter celle tidligt, kaldet "granulocyt-erythrocyt monocyt-megakariotsitokolonieobrazuyuschaya enhed" (SFU-GEMM), oprette en kultur multilinear store kolonier indeholdende henholdsvis, granulocytter, erythrocytter, monocytter og megakaryocytter. Placeret under linien granulocyt-linjeforpligtelse monotsitokolonieobrazuyuschaya enhed (SFU-GM) frembringer kolonier af granulocytter og makrofager og granulocytiske kolonidannende enheder (SFU-G) - kun små kolonier af modne granulocytter. Tidlig erythrocyt forgænger - burstoobrazuyuschaya enhed af røde blodlegemer (SFU-E) - er en kilde til stor og mere modne røde blodlegemer kolonidannende enhed (SFU-E) - små røde blodlegemer kolonier. I den almindelige befolkning, med væksten af celler i halvfaste medier kan identificere celler, der danner seks typer af myeloide kolonier: SFU-GEMM, GM-SFU, SFU-G, M-SFU, VFU-E og E-SFU).

Ud over hæmatopoietiske derivater indeholder ethvert kildemateriale til separering af HSC et betydeligt antal samtidige celler. I denne forbindelse er en forudgående oprensning af transplantationen først og fremmest af de aktive celler i donorens immunsystem nødvendig. Normalt anvendes immunosektion baseret på lymfocytekspression af specifikke antigener til dette, hvilket gør det muligt at isolere og fjerne dem ved anvendelse af monoklonale antistoffer. Derudover en teknik immunorozetochnaya T-lymfocyt-udtømt knoglemarv transplantation, som er baseret på dannelsen af komplekser af CD4 + lymfocytter og specifikke monoklonale antistoffer effektivt fjernet ved hjælp af aferese. Denne teknik tilvejebringer et oprenset cellemateriale med 40-60% hæmatopoietiske stamceller.

Forøgelse af antallet af progenitorceller som følge af fjernelsen af modne blodceller fra et leukaferese produkt opnås ved modstrøm centrifugering efterfulgt af filtrering (i nærvær af chelateringsmidlet - trinatriumcitrat) gennem en søjle indeholdende nylonfibre overtrukket med humant immunoglobulin. Den konsekvente anvendelse af disse to teknikker sikrer en fuldstændig rensning af transplantatet fra blodplader, 89% fra erytrocytter og 91% fra hvide blodlegemer. På grund af en signifikant reduktion i HSC-tab, kan niveauet af CD34 + -celler i den samlede cellemasse øges til 50%.

For de funktionelle egenskaber hos isolerede hæmatopoietiske stamceller anvendes deres evne til at skabe kolonier af modne blodelementer i kultur. Analyse af de dannede kolonier gør det muligt at identificere og kvantificere typer af progenitorceller, graden af deres forpligte og for at fastslå retningen af deres differentiering. Klonogen aktivitet bestemmes i halvfast medium på methylcellulose, agar, plasma eller fibringel, hvilket reducerer migrationsaktiviteten af celler, hvilket forhindrer deres binding til overfladen af glas eller plast. Under optimale kulturbetingelser udvikler kloner fra en enkelt celle inden for 7-18 dage. Hvis der er mindre end 50 celler i klonen, identificeres det som en enkelt klynge, hvis antallet af celler overstiger 50 - som en koloni. Antallet af celler, der er i stand til at danne en koloni (kolonidannende enheder - CFU eller kolonidannende celler - COC'er) tages i betragtning. Det skal bemærkes, at parametrene og CFU COC ikke svare til antallet af HSC i cellesuspensionen, selvom det korrelerer med det igen understreger behovet for at identificere den funktionelle (kolonidannende) aktivitet af HSC'er in vitro.

Blandt knoglemarvets celler har hæmatopoietiske stamceller det højeste proliferative potentiale, som de største kolonier dannes i kultur. Ved antallet af sådanne kolonier foreslås det indirekte at bestemme antallet af stamceller. Efter dannelsen af kolonier in vitro på over 0,5 mm i diameter og med antallet af celler 1000, har forfatterne undersøgt stabiliteten af disse celler til at subletale doser af 5-fluoruracil og undersøgt deres evne til at genbefolke knoglemarven letalt bestrålede dyr. Ifølge disse parametre adskilte de isolerede celler sig ikke meget fra HSC og modtog forkortelsessymbolet HPP-CFC - kolonidannende celler med et højt proliferativt potentiale.

Søgningen efter muligheden for et mere kvalitativt udvalg af hæmatopoietiske stamceller fortsætter. Men de hæmatopoietiske stamceller er morfologisk ligner lymfocytter og er relativt ensartet samling af celler med næsten runde kerner, chromatin og partikler slabobazofilnoy lille mængde cytoplasma. Det nøjagtige tal er også svært at bestemme. Det antages, at GSK i knoglemarv hos en person forekommer med en frekvens på 1 pr. 106 nucleusholdige celler.

Identifikation af hæmatopoietiske stamceller

At forbedre identifikationen af hæmatopoietiske stamceller udføres sekventielt eller samtidigt (på en multikanal sorbitan tere) forskning membrannosvyazannyh spektrum af antigener, hvor GSK-fænotype CD34 + CD38 bør kombineres med manglen på differentieringsmarkører lineær, især antigener af immunkompetente celler, såsom CD4, og overflade immunoglobuliner glycophorin.

Næsten alle ordninger af fænotyping af hæmatopoietiske stamceller indbefatter bestemmelsen af CD34 antigen. Dette glycoprotein med en molekylmasse på ca. 110 kDa, der bærer flere glycosyleringssites udtrykt på plasma cellemembran efter aktivering af genet lokaliseret på kromosom 1. Funktionen af CD34-molekylet er forbundet med den L-selektin-medierede interaktion mellem tidlige hæmatopoietiske precursorceller med knoglemarvsstrømbasen. Imidlertid bør det erindres, at tilstedeværelsen af CD34-antigenet på celleoverfladen tillader kun foretages en indledende vurdering af indholdet af GSK i cellesuspensionen, som det udtrykkes, og andre hæmatopoietiske celler og stromale knoglemarvsceller og endotelceller.

Under differentieringen af hæmatopoietiske stamceller er CD34-ekspression permanent reduceret. Erythrocyt-, granulocyt- og monocytforbudte stamceller enten svagt udtrykker CD34 antigen eller er slet ikke på deres overflade (fænotype CD34). På overflademembranen af differentierede celler i knoglemarv og modne blodlegemer detekteres ikke CD34 antigen.

Det skal bemærkes, at i dynamikken i differentiering af hæmatopoietiske progenitorceller ikke kun reducerer ekspressionsniveauet af CD34, men parallelt gradvist øget ekspression af CD38-antigen - integreret membranglycoprotein med molekylvægt på 46 kDa der NAD-glikogidrolaznoy og ADP-ribosyl cyclaseaktivitet, tyder på involvering i transport og syntese af ADP-ribose. Således er der mulighed for en dobbelt kontrol af graden af at begå de hæmatopoietiske stamceller. Population af celler med fænotypen CD34 + CD38 +, fra 90 til 99% CD34-positive knoglemarvsceller omfatter progenitorcellerne med begrænset proliferativt potentiale og differentiering, mens CD34 + CD38-celler med fænotypen kan kræve rollen GSK.

Faktisk indeholder populationen af knoglemarvsceller beskrevet ved formlen CD34 + CD38- et relativt stort antal primitive stamceller, der kan differentiere i myeloid- og lymfoide retninger. I forbindelse med langvarig dyrkning med fænotypen af CD34 + CD38-celler lykkes at få alle de modne blodlegemer: neutrofiler, eosinofiler, basofiler, monocytter, megakaryocytter, erytrocytter og lymfocytter.

Relativt nylig det konstateret, at CD34-positive celler udtrykker mere to markør - AC133 og CD90 (Thy-1), som også anvendes til at identificere hæmatopoietiske stamceller. Thy-1-antigen er co-udtrykkes med receptoren CD117 (c-kit) på CD34 + celler fra knoglemarv, ledning og perifert blod. Denne fosfatidilinozitolsvyazyvayuschy overflade glycoprotein med en molekylvægt på 25-35 kDa, som er involveret i celleadhæsionsprocesser. Nogle forfattere mener, at Thy-1 antigen er markøren for de mest umodne CD34-positive celler. Replikerende celler med fænotypen af CD34 + Thy-1 + give anledning til langvarige dyrkede linier til dannelse datterceller. Det foreslås, at Thy-1-antigenet blokerer de regulatoriske signaler, der forårsager celledeling at stoppe. På trods af at CD34 + TU1 + -celler er i stand til selvfornyelse og oprettelse af langsigtede dyrkede linjer, kan deres fænotype ikke vedrører alene HSC, som Thy-1 + indhold i totalvægten af CD34-positive celleelementer er omkring 50%, der langt overstiger den antallet af hæmatopoietiske celler.

Mere lovende for identifikationen af hæmatopoietiske stamceller er AC133, en antigenmarkør for hæmatopoietiske stamceller, hvis ekspression først blev detekteret på embryonale leverceller. AC133 er et transmembran glycoprotein, der vises på overfladen af cellemembranen i de tidligste stadier af GSK modning - det er muligt, at selv tidligere end antigenet CD34. I undersøgelserne af A. Petrenko og V. Grishchenko (2003) blev det konstateret, at AC133 udtrykker op til 30% af CD34-positive celler i den embryonale lever.

Således ideelle fænotypeprofil af hæmatopoietiske stamceller som nutidens begreber, summen af celle omrids, i de kredsløb, der skal være til stede CD34 antigener konfiguration, AC133 og Thy-1, men der er ikke plads til molekylær fremspring CD38, HLA-DR og markører lineær differentiering GPA , CD3, CD4, CD8, CD10, CD14, CD16, CD19, CD20.

Variationen af det fototype portræt af HSC kan være en kombination af CD34 + CD45RalowCD71low, da egenskaberne af cellerne beskrevet ved denne formel ikke afviger fra de funktionelle parametre af celler med fænotypen CD34 + CD38. Derudover kan human GSK identificeres ved fænotypiske tegn på CD34 + Thy-1 + CD38Iow / 'c-kit / low - kun 30 af disse celler genopretter helt hæmatopoiesis hos letbestrålede mus.

Fra analyse af de generelle fænotypiske egenskaber af knoglemarvsceller faktisk startede 40 års intensiv forskning GSK samtidig i stand til både selvfornyelse og differentiering til andre cellulære elementer, således at retfærdiggøre anvendelsen af knoglemarvstransplantation til behandling af forskellige patologier af hæmopoietiske system. Nyligt opdagede nye typer stamceller er endnu ikke blevet udbredt i klinisk praksis. Dog stamceller fra navlestrengen (ledning) blod og føtal lever betydeligt kan udvide celletransplantation ikke kun i hæmatologi, men også på andre områder af medicin, som forskellige fra HSC knoglemarv som en kvantitativ ydeevne og kvalitetsegenskaber.

Volumen stamme hæmatopoietisk celle masse, der kræves til transplantation, opnås sædvanligvis fra knoglemarv, perifert og ledningsblod og også fra den embryonale lever. Derudover kan hæmatopoiesis progenitorceller opnås in vitro ved udbredelse af ESC'er efterfulgt af deres retningsdifferentiering i hæmatopoietiske celleelementer. A. Petrenko, V. Grishchenko (2003) med rette påpege signifikante forskelle immunologiske egenskaber og evnen til at genoprette hæmatopoiese GSK forskellig oprindelse, skyldes ulige forhold indeholdt i deres kilder til pluripotent tidligt og senere engagerede progenitorer. Derudover har hæmatopoietiske stamceller afledt fra forskellige stamkilder helt forskellige sammenslutninger af ikke-hæmopoietiske celler kvantitativt og kvalitativt.

En traditionel kilde til hæmatopoietiske stamceller er knoglemarven. En suspension af knoglemarvsceller opnås fra abdominalbenet eller brystbenet ved udvaskning under lokalbedøvelse. Den således opnåede suspension er heterogen og indeholder en blanding af HSC, stromalcellele-ment, begavede progenitorceller af de myelide og lymfoide linjer, såvel som modne blodelementer. Antallet af celler med fænotyperne CD34 + og CD34 + CD38 blandt knoglemarvmononukleære celler er henholdsvis 0,5 til 3,6 og 0 til 0,5%. Perifert blod efter G-CSF-induceret mobilisering af HSC indeholder 0,4-1,6% CD34 + og 0-0,4% CD34 + CD38.

En højere procentdel af celler med CD34 + CD38 immunfænotype og CD34 + navlestrengsblod - og 0-0,6 OD-2,6%, og det maksimale antal detekteres blandt hæmatopoietiske fosterleverceller - og 2,3 0,2-12,5 -35,8%.

Men kvaliteten af implantatmaterialet afhænger ikke kun af mængden indeholdt deri af CD34 + -celler, men også af deres funktionelle aktivitet, som kan estimeres ved niveauet af kolonidannelse in vivo (marv repopulation i letalt bestrålede dyr) og in vitro - vækst af kolonier på halvfaste medier . Det konstateredes, at de kolonidannende og proliferative aktivitet af hæmopoietiske progenitorceller med fænotypen CD34 + CD38 HLA-DR, isoleret fra føtal lever, føtal knoglemarv og navlestrengsblod, og langt overstiger proliferative kapacitet hæmatopoietiske kolonidannende celler i knoglemarv og perifert blod fra en voksen. Kvantitativ og kvalitativ analyse af GSK forskellig oprindelse afslørede signifikante forskelle i deres relative indhold i cellesuspensionen, og funktionalitet. Det maksimale antal CD34 + celler (24,6%) blev fundet i transplantationsmaterialet opnået fra føtal knoglemarv. Knoglemarv hos et voksen menneske indeholder 2,1% af CD34-positive celleelementer. Blandt de mononukleare celler fra humant perifert blod fra voksne kun 0,5% har en fænotype CD34 +, hvorimod navlestrengsblod deres beløbet når 2%. Således kolonidannende evne af CD34 + celler fra føtal knoglemarv ved 2,7 gange overstiger kapaciteten af klonal vækst af hæmatopoietiske knoglemarv af voksne humane celler og navlestrengsblodceller danne væsentligt større kolonier end hæmatopoietiske elementer isoleret fra perifert blod fra voksne: 65,5 til 40 og , Henholdsvis 8 kolonier / 105 celler.

Forskelle i proliferativ aktivitet og kolonidannende evne hos hæmatopoietiske stamceller er ikke kun forbundet med forskellige grad af deres modenhed, men også med deres naturlige mikromiljø. Det er kendt, at intensiteten af proliferation og differentiering af stamceller hastighed, der bestemmes af integralet regulerende indflydelse af Multikomponentsystem af vækstfaktorer og cytokiner, der produceres af både stamcellerne og cellulære elementer i matrix-stromal mikromiljø. Under anvendelse af de oprensede cellepopulationer og serumfrie medier med henblik på cellekulturen giver karakteriserede vækstfaktorer, der har en stimulerende og hæmmende virkninger på stamceller af forskellige niveauer, progenitorceller og celler af begået i en bestemt lineær retning. Resultaterne af de gennemførte undersøgelser vidner overbevisende om, at GSK, der er opnået fra kilder med forskellige niveauer af ontogenetisk udvikling, afviger både fænotypisk og funktionelt. For GSK, der opholder sig i tidligere stadier af ontogeni, karakteriseret ved et stort potentiale for selvgengivelse og høj proliferativ aktivitet. Sådanne celler skelnes af en længere telomerlængde og udsættes for at begå dannelsen af alle hæmatopoietiske cellelinier. Reaktionen af immunsystemet til HSC-embryonisk oprindelse forsinkes, da sådanne celler mildt udtrykker HLA-molekyler. Der er en klar graduering af det relative indhold af HSC'er og deres evne til at forny sig selv og antallet af linjer danner de typer forpligtelser: CD34 + celler fra føtal lever> CD34 + celler fra navlestrengsblod> CD34 + celler i knoglemarven. Det er vigtigt, at sådanne forskelle er ikke unikke for intra- og neo postanatalnomu tidlige periode af den menneskelige udvikling, men også hele ontogeni - proliferativ og kolonidannende aktivitet af HSC'er afledt fra knoglemarv eller perifert blod fra en voksen, omvendt proportional med alder donoren.