Blommesækkens hæmatopoietiske stamceller

Det er tydeligt, at forskellige proliferative og differentierende potentialer for hæmatopoietiske stamceller bestemmes af deres ontogenetiske udviklings særegenheder, da selv lokaliseringen af de vigtigste områder for hæmatopoiese ændrer sig hos mennesker under ontogenesen. Hæmatopoietiske progenitorceller i fosterets blommesæk er dedikeret til dannelsen af en udelukkende erytropoietisk cellelinje. Efter migrationen af primære HSC'er til leveren og milten udvides spektret af commitment-linjer i disse organers mikromiljø. Især hæmatopoietiske stamceller erhverver evnen til at generere lymfoide cellelinjer. I den prænatale periode når hæmatopoietiske progenitorceller zonen for endelig lokalisering og fylder knoglemarven. Under intrauterin udvikling indeholder fosterblodet et betydeligt antal hæmatopoietiske stamceller. For eksempel når HSC-niveauet i den 13. graviditetsuge 18% af det samlede antal mononukleære blodlegemer. Efterfølgende observeres et progressivt fald i deres indhold, men selv før fødslen adskiller mængden af HSC'er i navlestrengsblodet sig kun lidt fra deres mængde i knoglemarven.

Ifølge klassiske koncepter udføres den naturlige ændring i lokaliseringen af hæmatopoiese under pattedyrs embryonale udvikling ved migration og introduktion i et nyt mikromiljø af pluripotente hæmatopoietiske stamceller - fra blommesækken til leveren, milten og knoglemarven. Da det hæmatopoietiske væv i de tidlige stadier af embryonal udvikling indeholder et stort antal stamceller, som falder efterhånden som fosteret modnes, anses det mest lovende for at opnå hæmatopoietiske stamceller for at være det hæmatopoietiske væv fra den embryonale lever, isoleret fra aborteret materiale i 5-8 ugers graviditet.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ]

Spørgsmål om oprindelsen af hæmatopoietiske stamceller

Der er ingen tvivl om, at den embryonale dannelse af erytrocytter stammer fra blommesækkens blodøer. Differentieringspotentialet in vitro for blommesækkens hæmatopoietiske celler er dog meget begrænset (de differentierer primært til erytrocytter). Det skal bemærkes, at transplantation af blommesækkens hæmatopoietiske stamceller ikke er i stand til at genoprette hæmatopoiesen i lang tid. Det viste sig, at disse celler ikke er forløbere for voksne HSC'er. Ægte HSC'er optræder tidligere, i den 3.-5. uge af den intrauterine udvikling, i dannelseszonen for mavevæv og endotel i blodkarrene (paraaortisk splanchnopleura, P-SP), såvel som i stedet for aorta, gonader og primære nyrer - i mesonephros eller den såkaldte AGM-region. Det er blevet vist, at celler i AGM-regionen er en kilde ikke kun til HSC'er, men også til endotelceller i blodkarrene, såvel som osteoklaster involveret i knoglevævsdannelsesprocesser. I den 6. gestationsuge flytter tidlige hæmatopoietiske stamceller fra AGM-regionen til leveren, som forbliver fosterets primære hæmatopoietiske organ indtil fødslen.

Da dette punkt er yderst vigtigt set fra et celletransplantationssynspunkt, fortjener problemet med oprindelsen af HSC'er i processen med menneskelig embryogenese en mere detaljeret præsentation. De klassiske ideer om, at hæmatopoietiske stamceller fra pattedyr og fugle stammer fra en ekstraembryonal kilde, er baseret på studier af Metcalf og Moore, som var de første til at bruge metoder til kloning af HSC'er og deres efterkommere isoleret fra blommesækken. Resultaterne af deres arbejde tjente som grundlag for migrationsteorien, ifølge hvilken HSC'er, der først optrådte i blommesækken, sekventielt befolker de forbigående og definitive hæmatopoietiske organer, efterhånden som det tilsvarende mikromiljø dannes i dem. Sådan blev synspunktet etableret om, at dannelsen af HSC'er, der oprindeligt var lokaliseret i blommesækken, tjener som det cellulære grundlag for definitiv hæmatopoiese.

Blommesæks hæmatopoietiske progenitorceller tilhører kategorien af de tidligste hæmatopoietiske progenitorceller. Deres fænotype er beskrevet af formlen AA4.1+CD34+c-kit+. I modsætning til modne knoglemarvs-HSC'er udtrykker de ikke Sca-1-antigener og MHC-molekyler. Det ser ud til, at forekomsten af markørantigener på overflademembranerne af blommesæks-HSC'er under dyrkning svarer til deres differentiering under embryonisk udvikling med dannelsen af engagerede hæmatopoietiske linjer: niveauet af CD34- og Thy-1-antigenekspression falder, CD38- og CD45RA-ekspression stiger, og HLA-DR-molekyler fremkommer. Med efterfølgende specialisering in vitro induceret af cytokiner og vækstfaktorer begynder ekspressionen af antigener specifikke for hæmatopoietiske progenitorceller fra en bestemt cellelinje. Resultaterne af undersøgelsen af embryonal hæmatopoiese hos repræsentanter for tre klasser af hvirveldyr (padder, fugle og pattedyr), og især analysen af oprindelsen af HSC'er, der er ansvarlige for definitiv hæmatopoiese i postnatal ontogenese, modsiger imidlertid klassiske koncepter. Det er blevet fastslået, at der hos repræsentanter for alle de betragtede klasser dannes to uafhængige regioner, hvor HSC'er opstår, under embryogenesen. Den ekstraembryonale "klassiske" region er repræsenteret af blommesækken eller dens analoger, mens den nyligt identificerede intraembryonale zone for HSC-lokalisering omfatter det paraaortale mesenkym og AGM-regionen. I dag kan det argumenteres for, at hos padder og fugle stammer definitive HSC'er fra intraembryonale kilder, mens hos pattedyr og mennesker kan deltagelse af blommesæk-HSC'er i definitiv hæmatopoiese endnu ikke fuldstændigt udelukkes.

Embryonal hæmatopoiese i blommesækken er faktisk primær erytropoiese, som er karakteriseret ved bevarelsen af cellekernen i alle stadier af erytrocytmodningen og syntesen af hæmoglobin af føtal type. Ifølge de seneste data slutter bølgen af primær erytropoiese i blommesækken på den 8. dag af embryonal udvikling. Den efterfølges af en periode med akkumulering af definitive erytroide progenitorceller - BFU-E, som udelukkende dannes i blommesækken og først optræder på den 9. dag af drægtigheden. I den næste fase af embryogenesen er definitive erytroide progenitorceller - CFU-E, såvel som (!) mastceller og CFU-GM allerede dannet. Dette er grundlaget for synspunktet om, at definitive progenitorceller opstår i blommesækken, migrerer med blodbanen, sætter sig i leveren og hurtigt initierer den første fase af intraembryonal hæmatopoiese. Ifølge disse koncepter kan blommesækken på den ene side betragtes som stedet for primær erytropoiese, og på den anden side som den første kilde til definitive hæmatopoietiske stamceller i embryonisk udvikling.

Det er blevet vist, at kolonidannende celler med højt proliferativt potentiale kan isoleres fra blommesækken allerede på den 8. drægtighedsdag, dvs. længe før embryoets og blommesækkens vaskulære system lukker. Desuden danner celler med højt proliferativt potentiale, der er opnået fra blommesækken in vitro, kolonier, hvis størrelse og cellulære sammensætning ikke afviger fra de tilsvarende parametre for kulturvækst af knoglemarvsstamceller. Samtidig dannes der betydeligt flere datterkolonidannende celler og multipotente stamceller, når der retransplanteres kolonidannende celler fra blommesækken med højt proliferativt potentiale, end når der anvendes knoglemarvsstamceller fra hæmatopoiese.

En endelig konklusion om blommesæks hæmatopoietiske stamcellers rolle i definitiv hæmatopoiese kunne tilvejebringes af resultaterne af det arbejde, hvor forfatterne opnåede en linje af blommesæksendotelceller (G166), som effektivt understøttede proliferationen af dens celler med de fænotypiske og funktionelle egenskaber ved HSC'er (AA4.1+WGA+, lav densitet og svage adhæsionsegenskaber). Indholdet af sidstnævnte steg mere end 100 gange, når de blev dyrket på et fødelag af C166-celler i 8 dage. Makrofager, granulocytter, megakaryocytter, blastceller og monocytter, samt B- og T-lymfocytforløberceller blev identificeret i blandede kolonier dyrket på et underlag af C166-celler. Blommesækceller, der voksede på et underlag af endotelceller, havde evnen til at selvreproducere sig og modstod op til tre passager i forfatternes eksperimenter. Genoprettelse af hæmatopoiese med deres hjælp hos modne mus med svær kombineret immundefekt (SCID) blev ledsaget af dannelsen af alle typer leukocytter, såvel som T- og B-lymfocytter. Forfatterne anvendte dog i deres studier blommesækceller fra et 10 dage gammelt embryo, hvor de ekstra- og intraembryonale vaskulære systemer allerede er lukkede, hvilket ikke tillader os at udelukke tilstedeværelsen af intraembryonale HSC'er blandt blommesækcellerne.

Samtidig afslørede analysen af differentieringspotentialet af hæmatopoietiske celler i tidlige udviklingsstadier, isoleret før foreningen af blomsækkens og embryoets vaskulære systemer (8-8,5 dages drægtighed), tilstedeværelsen af forløbere for T- og B-celler i blommesækken, men ikke i embryoets krop. I in vitro-systemet differentierede blommesækkens mononukleære celler til præ-T- og modne T-lymfocytter ved hjælp af en metode med totrinsdyrkning på et monolag af epitel- og subepitelceller fra thymus. Under de samme dyrkningsbetingelser, men på et monolag af stromale celler fra lever og knoglemarv, differentierede blommesækkens mononukleære celler til præ-B-celler og modne IglVT-B-lymfocytter.

Resultaterne af disse undersøgelser indikerer muligheden for udvikling af immunsystemceller fra ekstraembryonalt væv fra blommesækken, og dannelsen af primære T- og B-cellelinjer afhænger af faktorer i det stromale mikromiljø i embryonale hæmatopoietiske organer.

Andre forfattere har også vist, at blommesækken indeholder celler med potentiale for lymfoid differentiering, og de resulterende lymfocytter adskiller sig ikke i antigene egenskaber fra dem hos kønsmodne dyr. Det er blevet fastslået, at blommesækcellerne i et 8-9 dage gammelt embryo er i stand til at genoprette lymfopoiese i den athymocytiske thymus med fremkomsten af modne CD3+CD4+- og CD3+CD8+-lymfocytter, der besidder et dannet repertoire af T-cellereceptorer. Således kan thymus være befolket af celler af ekstraembryonal oprindelse, men det er umuligt at udelukke den sandsynlige migration af tidlige T-lymfocytforløberceller fra intraembryonale lymfopoiesekilder ind i thymus.

Samtidig resulterer transplantation af blommesæks hæmatopoietiske celler til voksne bestrålede modtagere ikke altid i langvarig repopulation af lokaliseringszoner for udtømt hæmatopoietisk væv, og in vitro-blommesækceller danner signifikant færre miltkolonier end celler i AGM-regionen. I nogle tilfælde er det stadig muligt at opnå langvarig (op til 6 måneder) repopulation af hæmatopoietisk væv i bestrålede modtagere ved hjælp af blommesækceller fra et 9 dage gammelt embryo. Forfatterne mener, at blommesækceller med CD34+c-kit+ fænotypen ikke blot ikke adskiller sig fra dem fra AGM-regionen i deres evne til at repopulere udtømte hæmatopoietiske organer, men også genopretter hæmatopoiesen mere effektivt, da blommesækken indeholder næsten 37 gange flere af dem.

Det skal bemærkes, at der i forsøgene blev anvendt blommesæk-hæmatopoietiske celler med markørantigener fra hæmatopoietiske stamceller (c-kit+ og/eller CD34+ og CD38+), som blev injiceret direkte i leveren eller abdominalvenen hos afkommet af hunmus, der modtog en injektion af busulfan på drægtighedens 18. dag. Hos sådanne nyfødte dyr blev deres egen myelopoiese kraftigt undertrykt på grund af elimineringen af hæmatopoietiske stamceller forårsaget af busulfan. Efter transplantation af blommesæk-hæmatopoietiske stamceller blev der i 11 måneder påvist dannede elementer indeholdende donormarkøren - glycerophosphatdehydrogenase - i modtagernes perifere blod. Det blev fundet, at blommesæk-HSC'er genopretter indholdet af lymfoide, myeloide og erytroide celler i blodet, thymus, milt og knoglemarv, og niveauet af kimærisme var højere i tilfælde af intrahepatisk snarere end intravenøs administration af blommesækceller. Forfatterne mener, at blommesæks-HSC'er fra tidlige embryoner (op til 10 dage) kræver forudgående interaktion med leverens hæmatopoietiske mikromiljø for at kunne befolke de hæmatopoietiske organer hos voksne recipienter. Det er muligt, at der er et unikt udviklingsstadium i embryogenesen, hvor blommesækceller, der i første omgang migrerer til leveren, derefter opnår evnen til at befolke stroma i de hæmatopoietiske organer hos modne recipienter.

I denne henseende skal det bemærkes, at kimærisme af immunsystemceller ofte observeres efter transplantation af knoglemarvsceller til bestrålede modne modtagere - i sidstnævntes blod findes celler af donorfænotypen i ret store mængder blandt modtagerens B-, T-lymfocytter og granulocytter, hvilket fortsætter i mindst 6 måneder.

Hæmatopoietiske celler hos pattedyr detekteres først ved morfologiske metoder på 7. dagen af embryonal udvikling og er repræsenteret af hæmatopoietiske øer inde i blommesækkens kar. Imidlertid er naturlig hæmatopoietisk differentiering i blommesækken begrænset til primære erytrocytter, der bevarer kerner og syntetiserer føtalt hæmoglobin. Ikke desto mindre har man traditionelt troet, at blommesækken tjener som den eneste kilde til HSC'er, der migrerer til de hæmatopoietiske organer i det udviklende embryo og sørger for definitiv hæmatopoiese hos voksne dyr, da forekomsten af HSC'er i embryonets krop falder sammen med lukningen af blommesækkens og embryoets vaskulære systemer. Dette synspunkt understøttes af data om, at blommesækceller, når de klones in vitro, giver anledning til granulocytter og makrofager, og in vivo - til miltkolonier. I løbet af transplantationsforsøg blev det derefter fastslået, at blommesækkens hæmatopoietiske celler, som i selve blommesækken kun er i stand til at differentiere til primære erytrocytter, i leverens mikromiljø hos nyfødte og voksne SCID-mus, får den udtømte thymus- eller stromale fødekilde evnen til at repopulere hæmatopoietiske organer med genoprettelse af alle hæmatopoietiske linjer, selv hos voksne recipientdyr. I princippet giver dette os mulighed for at klassificere dem som ægte HSC'er - som celler, der fungerer i den postnatale periode. Det antages, at blommesækken sammen med AGM-regionen fungerer som en kilde til HSC'er til definitiv hæmatopoiese hos pattedyr, men deres bidrag til udviklingen af det hæmatopoietiske system er stadig uklart. Den biologiske betydning af eksistensen af to hæmatopoietiske organer med lignende funktioner i tidlig pattedyrsembryogenese er også uklar.

Søgningen efter svar på disse spørgsmål fortsætter. In vivo var det muligt at bevise tilstedeværelsen i blommesækken hos 8-8,5 dage gamle embryoner af celler, der genopretter lymfopoiesen, hos subletalt bestrålede SCID-mus med en udtalt mangel på T- og B-lymfocytter. Blommesækkens hæmatopoietiske celler blev injiceret både intraperitonealt og direkte i milt- og levervæv. Efter 16 uger blev der påvist TCR/CD34 CD4+ og CD8+ T-lymfocytter og B-220+IgM+ B-lymfocytter mærket med donor MHC-antrxgener hos recipienterne. Samtidig fandt forfatterne ikke stamceller, der var i stand til en sådan genoprettelse af immunsystemet, i kroppen hos 8-8,5 dage gamle embryoner.

Hæmatopoietiske blommesækceller har et højt proliferativt potentiale og er i stand til langvarig selvreproduktion in vitro. Nogle forfattere identificerer disse celler som HSC'er baseret på den forlængede (næsten 7 måneder) generation af erytroide progenitorceller, som adskiller sig fra knoglemarvsprogenitorceller af erytroid-afstamningen ved en længere passageperiode, større kolonistørrelser, øget følsomhed over for vækstfaktorer og længere proliferation. Derudover dannes der også lymfoide progenitorceller under passende betingelser for blommesækcelledyrkning in vitro.

De præsenterede data tillader os generelt at betragte blommesækken som en kilde til HSC'er, mindre engagerede og derfor besiddende et større proliferativt potentiale end knoglemarvsstamceller. Men på trods af at blommesækken indeholder pluripotente hæmatopoietiske progenitorceller, der opretholder forskellige linjer af hæmatopoietisk differentiering in vitro i lang tid, er det eneste kriterium for fuldstændigheden af HSC'er deres evne til langsigtet at repopulere recipientens hæmatopoietiske organer, hvis hæmatopoietiske celler er ødelagte eller genetisk defekte. Derfor er det centrale spørgsmål, om pluripotente hæmatopoietiske celler i blommesækken kan migrere og populere hæmatopoietiske organer, og om det er tilrådeligt at revidere de kendte arbejder, der demonstrerer deres evne til at repopulere de hæmatopoietiske organer hos modne dyr med dannelsen af de vigtigste hæmatopoietiske linjer. Intraembryonale kilder til definitive GSC'er blev identificeret i fugleembryoner tilbage i 1970'erne, hvilket allerede dengang såede tvivl om de etablerede ideer om den ekstraembryonale oprindelse af GSC'er, herunder i repræsentanter for andre klasser af hvirveldyr. I de seneste par år er der udgivet publikationer om tilstedeværelsen af lignende intraembryonale områder, der indeholder GSC'er, hos pattedyr og mennesker.

Det skal endnu en gang bemærkes, at grundlæggende viden på dette område er yderst vigtig for praktisk celletransplantation, da det ikke blot vil hjælpe med at bestemme den foretrukne kilde til HSC'er, men også med at fastslå kendetegnene ved interaktionen mellem primære hæmatopoietiske celler og en genetisk fremmed organisme. Det er kendt, at introduktion af hæmatopoietiske stamceller fra human føtal lever i et fåreembryo på organogenesestadiet fører til fødslen af kimære dyr, hvor 3 til 5% af de humane hæmatopoietiske celler er stabilt bestemt i blod og knoglemarv. Samtidig ændrer humane HSC'er ikke deres karyotype, hvilket opretholder en høj proliferationshastighed og evnen til at differentiere. Derudover er transplanterede xenogene HSC'er ikke i konflikt med immunsystemet og fagocytterne i værtsorganismen og transformerer sig ikke til tumorceller, hvilket dannede grundlag for den intensive udvikling af metoder til intrauterin korrektion af arvelig genetisk patologi ved hjælp af HSC'er eller ESC'er transficeret med defekte gener.

Men på hvilket stadie af embryogenesen er det mere passende at udføre en sådan korrektion? For første gang optræder celler, der er bestemt for hæmatopoiese, hos pattedyr umiddelbart efter implantation (6. drægtighedsdag), når morfologiske tegn på hæmatopoietisk differentiering og formodede hæmatopoietiske organer stadig er fraværende. På dette stadie er dispergerede celler fra museembryoet i stand til at repopulere de hæmatopoietiske organer hos bestrålede modtagere med dannelse af erytrocytter og lymfocytter, der adskiller sig fra værtscellerne ved henholdsvis typen af hæmoglobin eller glycerofosfatisomerase, samt en yderligere kromosomal markør (Tb) af donorceller. Hos pattedyr, som hos fugle, optræder hæmatopoietiske celler samtidig med blommesækken, før lukningen af det fælles karleje, direkte i embryoets krop i den paraaortiske splanchnopleura. Hæmatopoietiske celler af AA4.1+ fænotypen blev isoleret fra AGM-regionen og karakteriseret som multipotente hæmatopoietiske celler, der danner T- og B-lymfocytter, granulocytter, megakaryocytter og makrofager. Fænotypisk er disse multipotente progenitorceller meget tæt på HSC'erne i knoglemarven hos voksne dyr (CD34+c-kit+). Antallet af multipotente AA4.1+ celler blandt alle cellerne i AGM-regionen er lille - de udgør ikke mere end 1/12 af dens del.

I det menneskelige embryo er der også identificeret en intraembryonal region, der indeholder HSC'er, som er homologe med AGM-regionen hos dyr. Desuden findes mere end 80 % af multipotente celler med højt proliferativt potentiale i embryoets krop hos mennesker, selvom sådanne celler også findes i blommesækken. En detaljeret analyse af deres lokalisering viste, at hundredvis af sådanne celler er samlet i kompakte grupper, der er placeret i umiddelbar nærhed af endotelet i den ventrale væg af den dorsale aorta. Fænotypisk er de CD34CD45+Lin-celler. Tværtimod er sådanne celler enkelte i blommesækken, såvel som i andre hæmatopoietiske organer i embryoet (lever, knoglemarv).

Derfor indeholder AGM-regionen i det menneskelige embryo klynger af hæmatopoietiske celler, der er tæt forbundet med det ventrale endotel i den dorsale aorta. Denne kontakt spores også på det immunkemiske niveau - både cellerne i de hæmatopoietiske klynger og endotelcellerne udtrykker den vaskulære endotelvækstfaktor, Flt-3-liganden, deres receptorer FLK-1 og STK-1, samt transkriptionsfaktoren for leukæmistamceller. I AGM-regionen er mesenkymale derivater repræsenteret af en tæt streng af afrundede celler placeret langs hele den dorsale aorta og udtrykker tenascin C - et glykoprotein af grundsubstansen, der er aktivt involveret i processerne for intercellulær interaktion og migration.

Multipotente stamceller fra AGM-regionen genopretter hurtigt hæmatopoiese hos modne, bestrålede mus efter transplantation og giver effektiv hæmatopoiese i lang tid (op til 8 måneder). Forfatterne fandt ikke celler med sådanne egenskaber i blommesækken. Resultaterne af denne undersøgelse bekræftes af data fra et andet arbejde, som viste, at AGM-regionen i embryoner i tidlige udviklingsstadier (10,5 dage) er den eneste kilde til celler, der svarer til definitionen af HSC, og som genopretter myeloid og lymfoid hæmatopoiese hos modne, bestrålede mus.

AGM-S3-stromallinjen blev isoleret fra AGM-regionen, hvis celler understøtter dannelsen af dedikerede progenitorceller CFU-GM, BFU-E, CFU-E og blandede kolonidannende enheder i kultur. Indholdet af sidstnævnte under dyrkning på et feeder-underlag af AGM-S3-linjeceller stiger fra 10 til 80 gange. Mikromiljøet i AGM-regionen indeholder således stromale basisceller, der effektivt understøtter hæmatopoiesen, så AGM-regionen i sig selv kan meget vel fungere som et embryonalt hæmatopoietisk organ - en kilde til definitive HSC'er, dvs. HSC'er, der danner det hæmatopoietiske væv hos et voksent dyr.

Udvidet immunfænotypning af den cellulære sammensætning af AGM-regionen viste, at den ikke kun indeholder multipotente hæmatopoietiske celler, men også celler, der er dedikeret til myeloid og lymfoid (T- og B-lymfocytter) differentiering. Molekylær analyse af individuelle CD34+c-kit+ celler fra AGM-regionen ved hjælp af polymerasekædereaktion afslørede imidlertid kun aktivering af beta-globin- og myeloperoxidasegener, men ikke lymfoide gener, der koder for syntesen af CD34, Thy-1 og 15. Delvis aktivering af afstamningsspecifikke gener er karakteristisk for tidlige ontogenetiske stadier af genereringen af HSC'er og progenitorceller. I betragtning af at antallet af dedikerede progenitorceller i AGM-regionen i et 10-dages embryo er 2-3 størrelsesordener lavere end i leveren, kan det argumenteres for, at hæmatopoiesen i AGM-regionen lige er begyndt på den 10. dag af embryogenesen, hvorimod de hæmatopoietiske linjer allerede er udviklet i fosterets primære hæmatopoietiske organ i denne periode.

I modsætning til tidligere (9-11 dage) hæmatopoietiske stamceller fra blommesækken og AGM-regionen, som genopbygger det hæmatopoietiske mikromiljø hos den nyfødte, men ikke hos den voksne organisme, kræver hæmatopoietiske progenitorceller fra den 12-17 dage gamle embryonale lever ikke længere et tidligt postnatalt mikromiljø og befolker de hæmatopoietiske organer hos et voksent dyr ikke værre end en nyfødt. Efter transplantation af embryonale lever-HSC'er havde hæmatopoiesen hos bestrålede voksne recipientmus en polyklonal karakter. Derudover blev det ved hjælp af mærkede kolonier vist, at funktionen af de indpodede kloner er fuldstændig underlagt den klonale succession, der afsløres i den voksne knoglemarv. Følgelig besidder embryonale lever-HSC'er, mærket under de mest skånsomme forhold, uden præstimulering med eksogene cytokiner, allerede de vigtigste egenskaber ved voksne HSC'er: de kræver ikke et tidligt postembryonalt mikromiljø, går i en tilstand af dyb dvale efter transplantation og mobiliseres sekventielt til klonal dannelse i overensstemmelse med den klonale successionsmodel.

Det er naturligvis nødvendigt at dvæle ved fænomenet klonal succession mere detaljeret. Erythropoiese udføres af hæmatopoietiske stamceller, der har et højt proliferativt potentiale og evnen til at differentiere til alle linjer af engagerede precursorceller i blodlegemer. Ved normal hæmatopoieseintensitet er de fleste hæmatopoietiske stamceller i en sovende tilstand og mobiliseres til proliferation og differentiering, hvor de sekventielt danner kloner, der erstatter hinanden. Denne proces kaldes klonal succession. Eksperimentel evidens for klonal succession i det hæmatopoietiske system blev opnået i studier med HSC'er præget af retroviral genoverførsel. Hos voksne dyr opretholdes hæmatopoiese af mange samtidigt fungerende hæmatopoietiske kloner, derivater af HSC'er. Baseret på fænomenet klonal succession er der udviklet en repopulationstilgang til identifikation af HSC'er. Ifølge dette princip skelnes der mellem langtidsvirkende hæmatopoietiske stamceller (LT-HSC), som er i stand til at genoprette det hæmatopoietiske system gennem hele livet, og korttidsvirkende HSC, som udfører denne funktion i en begrænset periode.

Hvis vi betragter hæmatopoietiske stamceller ud fra repopulationsmetoden, er det særlige ved hæmatopoietiske celler i den embryonale lever deres evne til at skabe kolonier, der er betydeligt større end dem, der findes i væksten af navlestrengsblod eller knoglemarvs-HSC'er, og dette gælder for alle typer kolonier. Alene denne kendsgerning indikerer et højere proliferativt potentiale for hæmatopoietiske celler i den embryonale lever. En unik egenskab ved hæmatopoietiske progenitorceller i den embryonale lever er en kortere cellecyklus sammenlignet med andre kilder, hvilket er af stor betydning med hensyn til effektiviteten af repopulation af hæmatopoietiske organer under transplantation. Analyse af den cellulære sammensætning af den hæmatopoietiske suspension opnået fra kilder fra en moden organisme indikerer, at kerneceller i alle stadier af ontogenesen overvejende er repræsenteret af endeligt differentierede celler, hvis antal og fænotype afhænger af den ontogenetiske alder hos donoren af hæmatopoietisk væv. Især består suspensioner af mononukleære celler fra knoglemarv og navlestrengsblod af mere end 50% modne celler fra lymfoidserien, mens det hæmatopoietiske væv i den embryonale lever indeholder mindre end 10% lymfocytter. Derudover er cellerne fra den myeloide afstamning i den embryonale og føtale lever hovedsageligt repræsenteret af erytroidserien, mens granulocyt-makrofagelementer er fremherskende i navlestrengsblod og knoglemarv.

Det er også vigtigt, at den embryonale lever indeholder et komplet sæt af de tidligste hæmatopoietiske forstadier. Blandt sidstnævnte bør erythroide, granulopoietiske, megakaryopoietiske og multilineage-kolonidannende celler bemærkes. Deres mere primitive forstadier - LTC-IC - er i stand til at proliferere og differentiere in vitro i 5 uger eller mere, og bevarer også funktionel aktivitet efter indpodning i recipientens krop under allogen og endda xenogen transplantation til immundefekte dyr.

Den biologiske fordel ved overvægten af erytroide celler i den embryonale lever (op til 90% af det samlede antal hæmatopoietiske elementer) skyldes behovet for at forsyne det hurtigt stigende blodvolumen hos det udviklende foster med erytrocytmasse. I den embryonale lever er erytropoiesen repræsenteret af nukleære erytroide forstadier af varierende grad af modenhed, der indeholder føtalt hæmoglobin (a2u7), som på grund af sin højere affinitet for ilt sikrer effektiv absorption af sidstnævnte fra moderens blod. Intensivering af erytropoiesen i den embryonale lever er forbundet med en lokal stigning i syntesen af erythropoietin (EPO). Det er bemærkelsesværdigt, at tilstedeværelsen af erythropoietin alene er tilstrækkelig til at realisere det hæmatopoietiske potentiale af hæmatopoietiske celler i den embryonale lever, hvorimod en kombination af cytokiner og vækstfaktorer bestående af EPO, SCF, GM-CSF og IL-3 er nødvendig for at binde knoglemarvs- og navlestrengsblod-high-celle celler til erytropoiesen. Samtidig reagerer tidlige hæmatopoietiske progenitorceller isoleret fra den embryonale lever, som ikke har receptorer for EPO, ikke på eksogent erythropoietin. For at inducere erythropoietin i en suspension af mononukleære celler fra den embryonale lever er tilstedeværelsen af mere avancerede erythropoietin-følsomme celler med CD34+CD38+ fænotypen, som udtrykker EPO-receptoren, nødvendig.

I litteraturen er der stadig ingen konsensus om udviklingen af hæmatopoiese i den embryonale periode. Den funktionelle betydning af eksistensen af ekstra- og intraembryonale kilder til hæmatopoietiske progenitorceller er ikke blevet fastslået. Der er dog ingen tvivl om, at leveren i den menneskelige embryogenese er det centrale organ for hæmatopoiese, og i 6. til 12. graviditetsuge fungerer den som den primære kilde til hæmatopoietiske stamceller, der befolker milten, thymus og knoglemarven. GDR'er sikrer udførelsen af de tilsvarende funktioner i de præ- og postnatale udviklingsperioder.

Det skal endnu engang bemærkes, at den embryonale lever, sammenlignet med andre kilder, er karakteriseret ved det højeste indhold af HSC'er. Cirka 30% af CD344-cellerne i den embryonale lever har CD38-fænotypen. Samtidig er antallet af lymfoide progenitorceller (CD45+) i de tidlige stadier af hæmatopoiesen i leveren ikke mere end 4%. Det er blevet fastslået, at antallet af B-lymfocytter, efterhånden som fosteret udvikler sig, fra 7. til 17. graviditetsuge, stiger gradvist med et månedligt "trin" på 1,1%, mens niveauet af HSC'er falder permanent.

Den funktionelle aktivitet af hæmatopoietiske stamceller afhænger også af den embryonale udviklingsperiode af deres oprindelse. Undersøgelsen af den kolonidannende aktivitet af leverceller fra humane embryoner ved 6-8 og 9-12 ugers gestationsalder under dyrkning i et halvflydende medium i nærvær af SCF, GM-CSF, IL-3, IL-6 og EPO viste, at det samlede antal kolonier er 1,5 gange højere ved såning af HSC'er fra embryonal lever i tidlige udviklingsstadier. Samtidig er antallet af myelopoiese-progenitorceller, såsom CFU-GEMM, i leveren ved 6-8 ugers embryogenese mere end tre gange højere end deres antal ved 9-12 ugers gestationsalder. Generelt var den kolonidannende aktivitet af hæmatopoietiske leverceller fra embryoner i første trimester af gestationsalderen signifikant højere end af føtale leverceller i andet trimester af graviditeten.

Ovenstående data indikerer, at den embryonale lever i begyndelsen af embryogenesen ikke kun kendetegnes ved et øget indhold af tidlige hæmatopoietiske progenitorceller, men at dens hæmatopoietiske celler er karakteriseret ved et bredere spektrum af differentiering i forskellige cellelinjer. Disse træk ved den funktionelle aktivitet af hæmatopoietiske stamceller i den embryonale lever kan have en vis klinisk betydning, da deres kvalitative egenskaber giver os mulighed for at forvente en udtalt terapeutisk effekt ved transplantation af selv et lille antal celler opnået i tidlige stadier af drægtighedsperioden.

Ikke desto mindre er problemet med mængden af hæmatopoietiske stamceller, der kræves til effektiv transplantation, fortsat åbent og relevant. Der gøres forsøg på at løse det ved hjælp af det høje potentiale for selvreproduktion af hæmatopoietiske celler i den embryonale lever in vitro, når de stimuleres af cytokiner og vækstfaktorer. Med konstant perfusion af tidlige embryonale lever-HSC'er i en bioreaktor er det efter 2-3 dage muligt at opnå en mængde hæmatopoietiske stamceller ved output, der er 15 gange højere end deres oprindelige niveau. Til sammenligning skal det bemærkes, at det kræver mindst to uger at opnå en 20-dobbelt stigning i outputtet af humane navlestrengsblod-HSC'er under de samme betingelser.

Den embryonale lever adskiller sig således fra andre kilder til hæmatopoietiske stamceller ved et højere indhold af både engagerede og tidlige hæmatopoietiske progenitorceller. I kultur med vækstfaktorer danner embryonale leverceller med CD34+CD45Ra1 CD71l0W-fænotypen 30 gange flere kolonier end lignende navlestrengsblodceller og 90 gange flere end knoglemarvs-HSC'er. De mest udtalte forskelle i de specificerede kilder er indholdet af tidlige hæmatopoietiske progenitorceller, der danner blandede kolonier - mængden af CFU-GEMM i den embryonale lever overstiger mængden i navlestrengsblod og knoglemarv med henholdsvis 60 og 250 gange.

Det er også vigtigt, at mere end 60% af levercellerne er involveret i implementeringen af den hæmatopoietiske funktion indtil den 18. uge af embryonal udvikling (perioden for starten af hæmatopoiese i knoglemarven). Da det menneskelige foster ikke har en thymus og dermed thymocytter indtil den 13. udviklingsuge, reducerer transplantation af hæmatopoietiske celler fra embryonal lever fra 6-12 ugers graviditet risikoen for at udvikle en "graft versus host"-reaktion betydeligt og kræver ikke valg af en histokompatibel donor, da det gør det relativt nemt at opnå hæmatopoietisk kimærisme.