Laboratoriediagnose af slidgigt

I de fleste tilfælde oplever patienter med slidgigt ingen ændringer i blod- og urinprøver, bortset fra tilfælde af synovitis med betydelig effusion, hvor der kan forekomme en stigning i ESR, hypergammaglobulinæmi, en stigning i niveauet af akutfaseindikatorer - CRP, fibrinogen osv. Ved undersøgelse af synovialvæsken afsløres ingen signifikante forskelle fra normale indikatorer.

I de senere år har der været en intensiv søgning efter mulige biologiske markører (BM) for nedbrydning og reparation af ledvæv (primært brusk og knogle). BM bør afspejle disse dynamiske ændringer, tjene som prædiktorer for prognosen for slidgigt og markører for effektiviteten af patogenetisk behandling. Opdagelsen af nye og mere dybdegående undersøgelser af kendte biologiske markører vil give mulighed for en bedre forståelse af mekanismerne bag slidgigts patogenese. Hovedopgaven ved at bruge biologiske markører for bruskmetabolisme er imidlertid at vurdere lægemidlers chondrobeskyttende egenskaber og overvåge behandling med lægemidler, der tilhører DMO AD-gruppen - "sygdomsmodificerende".

Ved slidgigt forekommer patologiske forandringer hovedsageligt i ledbrusken, såvel som i den subkondrale knogle, synovialmembranen og andet blødt væv i leddet. Da vores evne til direkte at undersøge disse strukturer er begrænset, er de vigtigste kilder til indsamling af biologiske markører blod, urin og synovialvæske.

Urinprøve er den mest foretrukne metode, da den ikke involverer nogen invasive procedurer. Efter vores mening er det ideelle materiale til testning daglig urin. Analyse af morgenurinen ville være mere passende, men muligheden for at bruge den er udelukkende baseret på, at denne type analyse bruges til at bestemme biologiske markører for knoglemetabolisme ved osteoporose: det er kendt, at biologiske markører er underlagt døgnrytmer, og den maksimale koncentration af biologiske markører for knoglemetabolisme forekommer om natten. I øjeblikket er der ingen information i litteraturen om døgnrytmerne for biologiske markører i blødt væv og brusk, så den endelige beslutning om valget af en passende urinprøve vil blive truffet efter at have udført passende undersøgelser.

Blodprøver er rutinemæssige kliniske tests. Nogle biologiske markører bestemmes allerede i blodet, såsom akutfaseindekser, mens andre kan blive inkluderet i standardlisten over biokemiske tests i den nærmeste fremtid. For hver biologisk markør er det nødvendigt at specificere, i hvilken komponent af blodet den skal bestemmes - plasma eller serum. Forskningsresultater tyder på, at koncentrationen af biologiske markører i blodplasma adskiller sig betydeligt fra koncentrationen i serum. Biologiske markører bestemmes normalt i blodserum. Ifølge V. Rayan et al. (1998) er koncentrationerne af biologiske markører i blod taget fra en vene nær det berørte led og fra en fjernere vene forskellige. Disse data indikerer behovet for at standardisere blodprøvetagning til undersøgelse af biologiske markører.

Ifølge LJ Attencia et al. (1989) udgør brusken i synovialleddene hos en voksen kun 10% af den samlede masse af hyalinbrusk i kroppen, inklusive intervertebrale diske. Bestemmelsen af biologiske markører i blod og urin afspejler således systemisk metabolisme snarere end lokale ændringer i det led, der er berørt af slidgigt. Synovialvæsken er tættest på det patologiske fokus ved slidgigt og afspejler sandsynligvis mest præcist de processer, der forekommer i det berørte led. Koncentrationen af biologiske markører i synovialvæsken kan være betydeligt højere end i blodet, hvilket betyder, at den er lettere at bestemme. Eksempler inkluderer epitop 846 af aggrecan - i synovialvæsken er den 40 gange mere end i blodserum, bruskoligomere matrixproteiner (COMP) - 10 gange mere end i blodserum. Nedbrydningsprodukter i synovialvæsken afspejler mere præcist kataboliske processer i ledbrusken. Dræning af molekyler fra synovialvæsken gennem det lokale lymfesystem kan føre til et fald i deres størrelse og endda til deres ødelæggelse.

Trods den invasive karakter af synovialvæskeopsamlingsteknikken, der er forbundet med en række mulige komplikationer, er værdien af at bestemme biologiske markører i den åbenlys. For at undgå problemer med det såkaldte tørre led kan 20 ml isotonisk NaCl-opløsning injiceres i leddet umiddelbart før væskeopsamling. Umiddelbart efter injektionen af den isotoniske opløsning skal patienten bøje og strække lemmet i leddet 10 gange, efterfulgt af hurtig aspiration af den fortyndede synovialvæske. Ifølge EM-JA Thonar (2000) påvirker en sådan fortynding af synovium metabolismen i ledbrusken. Resultaterne af undersøgelsen foretaget af FC Robion et al. (2001) indikerer dog, at gentagen udskylning af hestens kvæleled ikke forårsager signifikante ændringer i bruskmetabolismen. Disse data kræver bestemt bekræftelse. Derfor skal effekten af ledudskylning på ændringer i dens koncentration for hver biologisk markør bestemmes i prækliniske dyreforsøg.

Det næste vigtige punkt er at bestemme halveringstiden i synovialvæske og blod for hver biologisk markør. Uden sådanne data vil fortolkning af testresultaterne være vanskelig. Normalt er halveringstiden for biologisk aktive stoffer i blod kortere end i andre flydende medier på grund af effektiv clearance af lever og nyrer. For hver biologisk markør er det derfor også nødvendigt at bestemme eliminationsvejen. N-propeptidet af type III-kollagen udskilles således af leveren via receptormedieret endocytose, og ikke-glykosylerede kollagenfragmenter udskilles hovedsageligt via urin, ligesom osteocalcin. Der er receptorer for glycosaminoglycaner på endotelcellerne i bihulerne i leverlobulerne, så hyaluronsyre og proteoglykaner elimineres af leveren. Halveringstiden for hyaluronsyre i blodet er 2-5 minutter. Tilstedeværelsen af synovitis kan accelerere clearance af biologiske markører fra led, selvom et studie på kaniner ikke fandt signifikante forskelle i proteoglykanclearance med eller uden synovitis. Derfor skal effekten af inflammation på ændringer i koncentrationen af biologiske markører i kropsvæsker undersøges.

Nyrerne filtrerer selektivt biologiske markører. Således kan glycosaminoglycaner, som bærer en stor negativ ladning, muligvis ikke trænge ind i nyrernes basalmembran, hvorimod glycosaminoglycaner såsom chondroitin-6-sulfat og chondroitin-4-sulfat detekteres i urinen.

Ud over patologi (især slidgigt) kan en række faktorer påvirke koncentrationen af biologiske markører i kroppens væsker:

1. Døgnrytmer er kun blevet undersøgt for et lille antal biologiske markører. De er blevet undersøgt for knoglemetabolismemarkører. Således forekommer den maksimale koncentration af osteocalcin om natten, og den maksimale koncentration af kollagen-tværbindinger om morgenen - klokken 8. Ved leddegigt forekommer den maksimale aktivitet af IL-6 også om natten (omkring klokken 14) og tidligere end osteocalcins. Disse data er af en vis interesse i forhold til IL-6's rolle i inflammation og fysiologi af knoglevæv. TNF-α har derimod ingen døgnrytmer. Receptorerne for dette cytokin kan dog adlyde dem.
2. Peristaltik. Hyaluronsyre syntetiseres af synovialceller (såvel som mange andre celler) og er en potentiel markør for synovitis ved slidgigt og leddegigt. Den højeste koncentration af hyaluronat findes dog i tarmens lymfesystem. Ikke overraskende kan koncentrationen af cirkulerende hyaluronsyre stige efter at have spist. Derfor bør blodprøver til bestemmelse af biologiske markører tages på tom mave eller 3 timer efter at have spist. Og effekten af peristaltik på niveauet af biologiske markører i blodet kræver undersøgelse.
3. Fysisk aktivitet om morgenen efter søvn fører til en stigning i koncentrationen af hyaluronsyre i blodet, MMP-3 og epitopen af keratansulfat hos raske individer. Fysisk aktivitet kan ændre koncentrationen af visse markører i både synovialvæske og blodserum. En sådan stigning er mere udtalt hos patienter med leddegigt, og desuden korrelerer koncentrationen af biologiske markører med disse patienters kliniske tilstand.
4. Lever- og nyresygdomme. Levercirrose forårsager en betydelig stigning i serumniveauet af hyaluronsyre og påvirker sandsynligvis elimineringen af proteoglykaner. Nyresygdomme er kendt for at påvirke osteocalcinkoncentrationerne. Dette problem kræver også en mere dybdegående undersøgelse.
5. Alder og køn. Under vækst øges aktiviteten af vækstpladeceller, hvilket ledsages af en stigning i koncentrationen af skeletale biologiske markører i blodserum. Et eksempel er stigningen i koncentrationen af aggrecanfragmenter og type II-kollagen i perifert blod og urin hos voksende dyr. Derfor er fortolkningen af biologiske markøranalyser hos børn og unge med muskuloskeletale sygdomme vanskelig. For mange biologiske markører blev der fundet en stigning i koncentrationen med aldring. Hos mænd overstiger koncentrationen af biologiske markører betydeligt koncentrationen hos kvinder i brusk og knoglevæv. Derudover kan man hos kvinder i menopausen og postmenopausen forvente ændringer i koncentrationen af biologiske markører for bruskmetabolisme, svarende til det, der observeres i knoglevæv.
6. Kirurgiske indgreb kan også påvirke niveauet af biologiske markører, og denne effekt kan vare i flere uger.

Konceptet med biologiske markører for slidgigt er baseret på antagelsen om, at de afspejler visse aspekter af metaboliske processer i ledvæv. Forholdet mellem koncentrationerne af biologiske markører i kroppens væsker og metabolismen af brusk, synovialvæv og andet væv har imidlertid vist sig at være meget komplekst.

For eksempel kan koncentrationen af markører for nedbrydning af ledbrusk-ECM i synovialvæsken ikke kun afhænge af graden af nedbrydning af selve matrixen, men også af andre faktorer, såsom graden af eliminering af molekylære fragmenter fra synovium, som allerede er nævnt ovenfor, samt af mængden af bruskvæv, der er tilbage i leddet.

Trods ovenstående fakta korrelerer koncentrationen af biologiske markører i synovialvæsken generelt med metabolismen af ECM-molekyler i ledbrusk. For eksempel er ændringer i koncentrationen af aggrecan-fragmenter, epitop 846, COMB og C-propeptid af kollagen II i synovialvæsken efter ledskade og under udvikling af slidgigt i overensstemmelse med ændringer i intensiteten af aggrecan-, COMB- og kollagen II-metabolisme i eksperimentelle modeller af slidgigt hos dyr/og in vivo og i ledbrusk hos patienter med slidgigt/og in vitro.

Identifikation af specifikke kilder til molekylære fragmenter er en kompleks proces. Øget frigivelse af molekylære fragmenter kan forekomme både på grund af en generel stigning i nedbrydningsprocesser, der ikke kompenseres af syntetiske processer, og på grund af øget nedbrydning med en samtidig stigning i synteseintensiteten af de samme ECM-molekyler; i sidstnævnte tilfælde ændres koncentrationen af ECM-molekyler ikke. Det er derfor nødvendigt at søge efter markører, der er specifikke for nedbrydning og syntese. Et eksempel på førstnævnte er fragmenter af aggrecan, og sidstnævnte er C-propeptidet af kollagen 11.

Selv hvis en biologisk markør er forbundet med et specifikt aspekt af metabolismen, er det nødvendigt at tage hensyn til de specifikke træk ved denne proces. For eksempel kan de identificerede fragmenter dannes som følge af nedbrydning af et de novo syntetiseret molekyle, der endnu ikke er integreret i det funktionelle ECM, et molekyle, der netop er blevet integreret i ECM, og endelig et permanent ECM-molekyle, der er en vigtig funktionel del af den modne matrix. Et andet problem er definitionen af den specifikke matrixzone (pericellulær, territorial og interterritorial matrix), der fungerede som kilde til biologiske markører, der blev detekteret i synovialvæske, blod eller urin. In vitro-studier indikerer, at intensiteten af metabolismen i individuelle zoner af ledbrusk-ECM kan være forskellig. Undersøgelsen af visse epitoper forbundet med chondroitinsulfatsulfatering kan hjælpe med at identificere populationen af de novo syntetiserede aggrecanmolekyler.

Det kan antages, at forekomsten af fragmenter af molekyler, der normalt findes i brusk-ECM i synovialvæsken, er forbundet med metabolismen af bruskmatrixen. Dette er dog ikke altid tilfældet, da det afhænger af en række faktorer, især hvor meget koncentrationen af et givet molekyle i ledbrusken overstiger den i andre ledvæv, og hvor meget intensiteten af dets metabolisme i brusken overstiger den i andre ledvæv. Således overstiger den samlede masse af aggrecan i ledbrusken betydeligt den for eksempel i knæleddets menisk, mens den samlede masse af COMB i menisken praktisk talt ikke er forskellig fra den i ledbrusken. Både chondrocytter og synovocytter producerer stromelysin-1, men det samlede antal celler i synovialmembranen overstiger antallet i brusken, så en betydelig del af stromelysin-1, der findes i synovialvæsken, er højst sandsynligt af synovial oprindelse. Derfor er identifikation af den specifikke kilde til biologiske markører ekstremt vanskelig og ofte umulig.

Når man studerer biologiske markører i blodserum og urin, opstår problemet med at bestemme deres mulige ekstraartikulære kilde. Derudover kan biologiske markører udskilt af det berørte led i tilfælde af monoartikulær skade blandes med markører udskilt af intakte led, herunder kontralaterale. Ledbrusk udgør mindre end 10% af den samlede masse af hyalinbrusk i kroppen. Bestemmelse af biologiske markører i blod og urin kan derfor snarere være berettiget ved polyartikulære eller systemiske sygdomme (i forbindelse med slidgigt - ved generaliseret slidgigt).

Kravene til biologiske markører afhænger af, om de bruges som en diagnostisk, prognostisk eller evaluerende test. For eksempel bestemmer en diagnostisk test forskelle mellem raske individer og patienter med slidgigt, hvilket udtrykkes i testens sensitivitet og specificitet. En prognostisk test identificerer individer i en kohorte, der har størst sandsynlighed for hurtigt at udvikle sygdommen. Endelig er en evaluerende test baseret på markørens evne til at overvåge ændringer over tid hos en individuel patient. Derudover kan biologiske markører bruges til at bestemme patienters følsomhed over for et bestemt lægemiddel.

Oprindeligt blev det antaget, at biologiske markører kunne tjene som diagnostiske tests, der ville hjælpe med at skelne et led, der var påvirket af slidgigt, fra et intakt led, samt udføre differentialdiagnostik med andre ledsygdomme. Derfor blev bestemmelse af koncentrationen af keratansulfat i blodserum betragtet som en diagnostisk test for generaliseret slidgigt. Efterfølgende undersøgelser viste dog, at denne biologiske markør kun kan afspejle nedbrydningen af bruskproteoglykaner i nogle situationer. Det viste sig, at koncentrationerne af biologiske markører i blodserum afhænger af den undersøgtes alder og køn.

Mulige biologiske markører for ledvævsmetabolisme i synovialvæske og blodserum hos patienter med slidgigt

Biologisk markør	Behandle	I synovialvæske (links)	I blodserum (links)
1. Brusk
Aggrecan
Kerneproteinfragmenter	Aggrecan-nedbrydning	Lohmander LS. et al., 1989; 1993	Thonar EJMA et al., 1985; Campion GV et al., 1989; MehrabanF. et al., 1991; Spector TD et al., 1992; Lohmander LS., Thonar EJ-MA, 1994; Poole AR et al., 1994) t (Poole AR et al., 1994)
Kerneproteinepitoper (spaltningszonespecifikke neoepitoper)	Aggrecan-nedbrydning	Sandy JD et al., 1992; LohmanderLS. et al., 1993; LærkeM.W. et al., 1997
Epitoper af keratinsulfater	Aggrecan-nedbrydning	Campion GV et al., 1989; Belcher C et al., 1997
Epitoper af chondroitinsulfater (846, ЗВЗ, 7D4 og DR.)	Aggrecansyntese/nedbrydning	Poole AR et al., 1994; HazellP.K. et al., 1995; Slater RR Jr. et al., 1995; Plaas AHK et al., 1997; 1998; Lohmander LS. et al., 1998
Forholdet mellem chondroitin-6 og chondroitin-4 sulfater	Aggrecansyntese/nedbrydning	Shinme iM. et al. 1993
Små proteoglykaner	Nedbrydning af små proteoglykaner	Witsch-PrehmP. et al., 1992
Matrixproteiner af brusk
HOMP	Nedbrydning af HOMP	Saxne T., Heinegerd D., 1992"; LohmanderLS. et al., 1994; Petersson IF et al., 1997	Sharif M. m.fl., 1995
Bruskkollagener
C-propeptid af type II kollagen	Kollagen II-syntese	ShinmeiM. et al., 1993; YoshiharaY. et al., 1995; LohmanderLS. et al., 1996
Fragmenter af alfakæden af type II kollagen	Nedbrydning af kollagen II	Hollander AP et al., 1994; Billinghurst RC et al., 1997; AtleyLM. et al., 1998
MMP'er og deres inhibitorer	Syntese og sekretion	Fra synovium eller ledbrusk?
II. Menisker
HOMP	Nedbrydning af HOMP	Fra ledbrusk, menisker eller synovium?
Små proteoglykaner	Nedbrydning af små proteoglykaner
III. Synovialmembran
Hyaluronsyre	Syntese af hyaluronsyre		Goldberg RL et al., 1991; Hedin P.-J. et al., 1991; Sharif M. et al., 1995
MMP'er og deres inhibitorer
Stromelysin (MMP-3)	MMP-3 syntese og sekretion	LohmanerLS et al., 1993	ZuckerS. et al., 1994; YoshiharaY. et al., 1995
Interstitiel kollagenase (MMP-1)	MMP-1 syntese og sekretion	Clark IM et al., 1993; Lohmander LS. et al., 1993	Manicourt DH et al., 1994
TIMP	Syntese og sekretion af TIMP	Lohmander LS. et al., 1993; Manicourt DH et al., 1994	Yoshihara Y. et al., 1995
N-propeptid af type III kollagen	Kollagen III syntese/nedbrydning	Sharif M. m.fl., 1996	Sharif M. m.fl., 1996

En række studier har vist forskelle i koncentrationerne af aggrecanfragmenter, HOMP og MMP samt deres inhibitorer i ledvæsken i knæleddene hos raske frivillige, patienter med leddegigt, reaktiv artritis eller slidgigt. Selvom forfatterne påviser signifikante forskelle i de gennemsnitlige koncentrationer af biologiske markører, er fortolkningen af dataene vanskelig, da den sammenlignende analyse var profilanalyse og retrospektiv. De prognostiske egenskaber af disse tests skal bekræftes i prospektive studier.

Biologiske markører kan bruges til at vurdere sygdommens sværhedsgrad eller stadieinddelingen af den patologiske proces. I tilfælde af slidgigt bedømmes sygdommens sværhedsgrad og dens stadier ud fra resultaterne af røntgenundersøgelser, artroskopi, samt smertesyndromets sværhedsgrad, begrænsning af de berørte leds funktion og patientens funktionelle kapacitet. L. Dahlberg et al. (1992) og T. Saxne og D. Heinegard (1992) foreslog at bruge nogle molekylære markører for ledbruskmetabolisme til yderligere karakterisering af stadierne af slidgigt. Yderligere forskning i denne retning er dog nødvendig for at introducere sådanne biologiske markører i medicinsk praksis.

Der findes rapporter om mulig brug af biologiske markører som prognostiske tests. For eksempel blev det vist, at koncentrationen af hyaluronsyre (men ikke keratansulfat) i serum hos patienter med knæartrose i begyndelsen af studiet indikerer progression af gonartrose i løbet af 5 års observation. I den samme patientpopulation blev det vist, at et øget indhold af COMB i serum hos patienter med gonartrose i løbet af det første år efter studiets begyndelse var forbundet med radiografisk progression i løbet af 5 års observation. Studier af biologiske markører hos patienter med leddegigt har vist, at koncentrationen af COMB, epitop 846, chondroitinsulfat i serum er forbundet med hurtigere sygdomsprogression. Disse resultater, opnået i små patientgrupper, demonstrerer ofte ikke styrken af sammenhængen mellem niveauet af biologiske markører og sygdomsprogression, dvs. yderligere undersøgelser, prospektive og på større patientkohorter, er nødvendige.

TD Spector et al. (1997) fandt en lille stigning i serum-CRP hos patienter med tidlig slidgigt og rapporterede, at CRP kan være en indikator for slidgigtprogression. I dette tilfælde afspejler stigningen i CRP processerne med ledvævsskade og kan være forbundet med en stigning i hyaluronsyre, hvilket også indikerer sygdomsprogression. Det er muligt, at synovialmembranen er ansvarlig for det meste af den hyaluronsyre, der bestemmes i serum, hvilket indikerer tilstedeværelsen af mild synovitis. Øgede koncentrationer af stromelysin MMP i synovialvæske og serum hos patienter med slidgigt og efter ledskade kan også være forbundet med mild synovitis.

Endelig kan biologiske markører bruges som effektkriterier i kliniske forsøg med lægemidler, såvel som til overvågning af patogenetisk behandling. Der er dog to indbyrdes forbundne problemer: manglen på lægemidler med dokumenterede "strukturmodificerende" eller "sygdomsmodificerende" egenskaber skyldes i høj grad manglen på pålidelige biologiske markører, og omvendt skyldes manglen på specifikke markører for ledvævsmetabolisme i høj grad manglen på kontrollerede studier af lægemidler i disse grupper.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ]