Molekylærgenetiske metoder til diagnosticering af arvelige sygdomme

DNA-teknologiske metoder bruges til at bestemme lokaliseringen af et mutantgen i et bestemt kromosom, der er ansvarlig for oprindelsen af visse former for arvelig patologi. Da et gen er en del af DNA, og en genmutation er en skade på DNA'ets primære struktur (mutation forstås som alle ændringer i DNA-sekvensen, uanset deres lokalisering og indvirkning på individets levedygtighed), er det muligt at fastslå lokaliseringen af det patologiske gen ved at undersøge præparater af metafasekromosomer hos en patient med en arvelig sygdom. Molekylære genetiske metoder skaber muligheder for at diagnosticere sygdomme på niveau med ændret DNA-struktur, de giver os mulighed for at bestemme lokaliseringen af arvelige lidelser. Molekylære genetiske metoder kan identificere mutationer forbundet med udskiftning af selv en enkelt base.

Det vigtigste trin i genidentifikation er dets isolering. DNA kan isoleres fra enhver type væv og celler, der indeholder kerner. Trinene i DNA-isolering omfatter: hurtig lysis af celler, fjernelse af fragmenter af cellulære organeller og membraner ved centrifugering, enzymatisk destruktion af proteiner og deres ekstraktion fra opløsning ved hjælp af phenol og chloroform, koncentrering af DNA-molekyler ved udfældning i ethanol.

I genetiske laboratorier isoleres DNA oftest fra blodleukocytter, hvortil 5-20 ml venøst blod tages fra patienten og overføres til et sterilt reagensglas med en antikoagulerende opløsning (heparin). Derefter separeres leukocytterne og behandles i henhold til ovenstående trin.

Det næste trin i forberedelsen af materialet til forskning er at "skære" DNA'et i fragmenter i områder med en strengt specifik basesekvens, hvilket udføres ved hjælp af bakterielle enzymer - restriktionsendonukleaser (restriktionsenzymer). Restriktionsenzymer genkender specifikke sekvenser på 4-6, sjældnere 8-12 nukleotider i et dobbeltstrenget DNA-molekyle og opdeler det i fragmenter på placeringen af disse sekvenser, kaldet restriktionssteder. Antallet af resulterende restriktionsfragmenter af DNA bestemmes af hyppigheden af forekomsten af restriktionssteder, og størrelsen af fragmenterne bestemmes af fordelingen af disse steder langs det oprindelige DNA-molekyles længde. Jo oftere restriktionsstederne er placeret, desto kortere er DNA-fragmenterne efter restriktion. I øjeblikket kendes mere end 500 forskellige typer restriktionsenzymer af bakteriel oprindelse, og hvert af disse enzymer genkender sin egen specifikke nukleotidsekvens. I fremtiden kan restriktionssteder bruges som genetiske markører for DNA. DNA-fragmenterne dannet som følge af restriktion kan sorteres efter længde ved elektroforese i en agarose- eller polyacrylamidgel, og dermed kan deres molekylvægt bestemmes. Typisk identificeres DNA i en gel ved specifik farvning (normalt ethidiumbromid) og ved at se gelen i transmitteret ultraviolet lys. DNA-lokaliseringsstederne er farvet røde. Hos mennesker dannes der imidlertid så mange fragmenter af forskellig længde, når DNA bearbejdes af flere restriktionsenzymer, at de ikke kan adskilles ved elektroforese, dvs. det er ikke muligt visuelt at identificere individuelle DNA-fragmenter på elektroforesen (ensartet farvning opnås langs hele gelens længde). Derfor anvendes hybridiseringsmetoden med mærkede DNA-prober for at identificere de ønskede DNA-fragmenter i en sådan gel.

Ethvert enkeltstrenget segment af DNA eller RNA er i stand til at binde (hybridisere) med en komplementær streng, hvor guanin altid binder til cytosin og adenin til thymin. Sådan dannes et dobbeltstrenget molekyle. Hvis en enkeltstrenget kopi af et klonet gen mærkes med et radioaktivt mærke, opnås en probe. Proben er i stand til at finde et komplementært segment af DNA, som derefter let identificeres ved hjælp af autoradiografi. En radioaktiv probe tilsat et præparat af strakte kromosomer gør det muligt at lokalisere genet på et specifikt kromosom: ved hjælp af en DNA-probe kan specifikke områder identificeres under Southern blotting. Hybridisering forekommer, hvis den DNA-sektion, der testes, indeholder et normalt gen. I tilfælde af, at en unormal nukleotidsekvens er til stede, dvs. at de tilsvarende kromosomstrukturer indeholder et mutantgen, vil hybridisering ikke forekomme, hvilket gør det muligt at bestemme lokaliseringen af det patologiske gen.

For at opnå DNA-prober anvendes genkloningsmetoden. Metodens essens er, at et DNA-fragment svarende til et gen eller en sektion af et gen indsættes i en kloningspartikel, normalt et bakterieplasmid (ringformet ekstrakromosomalt DNA, der findes i bakterieceller og bærer antibiotikaresistensgener), og derefter multipliceres bakterierne med plasmidet med det indsatte humane gen. Takket være synteseprocesserne i plasmidet kan der opnås milliarder af kopier af det humane gen eller dets sektion.

De resulterende DNA-kopier, mærket med et radioaktivt mærke eller fluorokromer, bruges derefter som sonder til at søge efter komplementære sekvenser blandt den undersøgte pulje af DNA-molekyler.

I øjeblikket findes der mange forskellige typer metoder, der bruger DNA-prober til at diagnosticere genmutationer.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ]