Molekylære genetiske metoder til diagnosticering af arvelige sygdomme

DNA-teknologiske metoder anvendes til at bestemme lokaliseringen i et bestemt kromosom af et mutantgen, der er ansvarlig for oprindelsen af visse former for arvelig patologi. Da genet er et DNA-segment og genmutation - skader på den primære struktur af DNA (en mutation forstås af alle ændringer i DNA-sekvensen, uanset deres placering og indflydelsen på den enkelte levedygtighed) derefter probning præparater af metafase patient kromosomer nedarvet sygdom, muligt at etablere lokalisering af patologisk gen. Metoder til molekylær genetik skaber muligheder for at diagnosticere sygdomme på niveau med den ændrede DNA struktur, de tillader at finde ud af lokalisering af arvelige lidelser. Molekylære genetiske metoder kan afsløre mutationer forbundet med udskiftning af endog en enkelt base.

Det vigtigste stadium i identifikationen af et gen er dets isolering. DNA kan isoleres fra enhver type væv og celleholdige kerner. Trinene DNA-isolering omfatter hurtig lyse af cellerne ved centrifugering med fjernelse af fragmenter af cellulære organeller og membraner, enzymatisk nedbrydning af proteiner og deres udvinding fra opløsningen med phenol og chloroform, DNA-koncentration ved udfældning i ethanol.

I genetiske laboratorier isoleres DNA oftest fra blodleukocytter, for hvilke patienten tages 5-20 ml venøst blod i et sterilt rør med en antikoagulant opløsning (heparin). Leukocytter separeres derefter og behandles i overensstemmelse med trinene beskrevet ovenfor.

Den næste fase af materiale forberedelse til undersøgelsen - DNA "cut" i fragmenter på steder med strengt specifik basesekvens udføres ved hjælp af bakterielle enzymer - restriktionsendonucleaser (restriktionsenzymer). Restriktionsenzymer genkender specifikke sekvenser af 4-6, mindst 8-12 nukleotider i dobbeltstrenget DNA-molekyle og dets adskilt i fragmenter af disse sekvenser lokalisere områder kaldet restriktionssteder. Antal producerede restriktionsfragmenter af DNA bestemt ved hyppigheden af forekomsten af restriktionssteder og fragmenter af størrelse - arten af fordelingen af disse steder langs længden af den oprindelige DNA-molekyle. Jo oftere restriktionsstederne er placeret, jo kortere DNA-fragmenterne efter restriktion. I øjeblikket er mere end 500 forskellige typer restriktionsenzymer af bakteriel oprindelse kendt, og hver af disse enzymer genkender sin specifikke sekvens af nukleotider. I fremtiden kan restriktionssteder anvendes som genetiske markører for DNA. De resulterende DNA restriktionsfragmenter kan sorteres efter længde ved elektroforese i agarose eller polyacrylamidgeler, og således kan bestemmes deres molekylvægt. Sædvanligvis til påvisning af DNA i gelen anvendes af specifik farvning (sædvanligvis ethidiumbromid) og visning af gelen i transmitteret lys ultraviolet. Steder af DNA lokalisering har en rød farve. Imidlertid Endonukleaser en person i behandlingen af flere DNA-restriktion dannet så mange fragmenter af forskellige længder, at de undlader at adskilles ved elektroforese, er det ikke muligt visuelt at identificere de enkelte DNA-fragmenter til electrophoregram (produceret ensartet farvning gennem hele længden af gelen). Derfor anvendes en hybridiseringsmetode med mærkede DNA-prober til identifikation af de ønskede DNA-fragmenter i en sådan gel.

Ethvert enkeltstrenget segment af DNA eller RNA er i stand til at binde (hybridisere) til dets komplementære kæde, og guanin er altid forbundet med cytosin, adenin med thymin. Dette er dannelsen af et dobbeltstrenget molekyle. Hvis en enkeltstrenget kopi af det klonede gen er mærket med en radioaktiv mærkning, opnås en probe. Sonden kan finde et komplementært segment af DNA, som så let kan identificeres ved radioautografi. En radioaktiv probe sættes til et lægemiddel med strakte kromosomer gør det muligt for genet at lokaliseres på et bestemt kromosom: visse DNA-prøver kan identificeres med en DNA-probe i Southern blotting. Hybridisering sker, hvis testdelen af DNA'et indeholder et normalt gen. I det tilfælde, hvor der er en unormal sekvens af nukleotider, dvs. De tilsvarende kromosom strukturer indeholder et mutantgen, vil hybridisering ikke forekomme, hvilket gør det muligt at bestemme lokalisering af det unormale gen.

For at opnå DNA-prober anvendes genkloningmetoden. Essensen af fremgangsmåden består i, at DNA-fragmentet svarende til enhver gen eller region af genet indsat i kloning partikel, sædvanligvis et bakterielt plasmid (cirkulært ekstrakromosomalt DNA til stede i bakterieceller og transporterer resistensgener over for antibiotika), og derefter bakterierne at have et plasmid med et indbygget humant gen, multipliceres. På grund af de syntesefremgangsmåder er det muligt at opnå plasmidet milliarder af kopier af det humane gen eller en del deraf.

Endvidere anvendes DNA-kopier, der er mærket med en radioaktiv mærkning eller fluorochrom, som prober for at søge efter komplementære sekvenser blandt de undersøgte puljer af DNA-molekyler.

På nuværende tidspunkt er der mange forskellige metoder, der anvender DNA-prober til diagnose af genmutationer.

[1], [2], [3], [4], [5], [6], [7], [8], [9], [10], [11], [12]