Eksperimentelle modeller af slidgigt

Brusk er et højt specialiseret væv indeholdende kun en type celler (chondrocytter), der er kendetegnet ved fraværet af blod og lymfekar. Brusk ernæring udføres hovedsageligt ved absorption fra synovialvæsken. Kondrocyternes metabolisme reguleres af en række opløselige faktorer produceret lokalt af chondrocytter og omgivende væv. Funktionen af kondrocytter afhænger også af sammensætningen af det ekstracellulære medium (iltspænding, ionkoncentration, pH, etc.), VCM-sammensætning, celle- og matrixinteraktion, fysiske signaler. Hovedopgaven for eksperimentel modellering er dannelsen af kulturer i det ekstracellulære miljø uden at ændre fænotypen af modne celler. Den anden opgave er at skabe kulturer for at studere chondrocytters tidlige, forsinkede, korte eller langsigtede reaktion på kemiske og / eller fysiske signaler. Undersøgelser in vitro giver også en mulighed for at studere opførslen af chondrocyt i slidgigt. Den tredje opgave er udviklingen af co-kurative systemer, som gør det muligt at studere interaktionen mellem forskellige væv i leddet. Den fjerde opgave er udarbejdelsen af bruskimplantater til den efterfølgende transplantation. Og endelig er den femte opgave at studere vækstfaktorer, cytokiner eller terapeutiske midler, som er i stand til at stimulere reparation og / eller hæmme dets resorption af brusk.

I de seneste årtier er der blevet skabt forskellige modeller af artikulære bruskcellekulturer, herunder monolagskulturer, suspenderede kulturer, chondronkulturer, eksplantater, kulturer, udødelige cellekulturer. Hver kultur har sine fordele og ulemper, og hver er egnet til at studere et særligt aspekt af chondrocyt metabolisme. Bruskagtige eksplanter er således en glimrende model til undersøgelse af omsætningen af matrixelementer, som kræver ægte celleoverfladereceptorer og normale cellematrix- og matrix-celleinteraktioner. Samtidig anbefales undersøgelsen af forekomster i matrixen eller mekanismerne til regulering af chondrocyt metabolisme at udføres på en kultur af isolerede celler. En monolag lavdensitetskultur er nødvendig for at studere processen med celledifferentiering. Kulturer suspenderet i en naturlig eller syntetisk matrix er en model til analyse af det adaptive respons af chondrocytter til mekanisk stress.

[1], [2], [3], [4], [5], [6], [7]

Chondrocytkulturer

Når man vælger bruskvæv til in vitro-undersøgelser, skal der tages højde for flere vigtige punkter. Matriksammensætning og metabolisk aktivitet af kondrocytter varierer i forskellige led, og sidstnævnte afhænger også af dybden af chondrocyten i vævet. Disse data blev opnået i adskillige eksperimenter, hvor isolerede subpopulationer af chondrocytter fra bruskzonerne af forskellige dybder blev studeret. En række morfologiske og biokemiske forskelle blev fundet mellem dyrkede chondrocytter placeret i overfladen og dybe lag af ledbrusk. Overfladeceller syntetiserer en sjælden udtømt proteoglycanfibrillær matrix, mens dybere celler producerer en matrix, der er rig på fibriller og proteoglycaner. Ydermere producerer overfladeceller relativt flere små ikke-aggregerede proteoglycaner og hyaluronsyre og relativt mindre aggrecan og keratansulfat end de mere dybt beliggende chondrocytter. Et andet vigtigt kendetegn ved metabolisme af chondrocytter isoleret fra bruskzonerne af forskellig dybde er svaret på den eksogene stimulus. Ifølge M. Aydelotte og medforfattere var tyrekondrocyterne fra bruskens overflade zone mere følsomme for IL-1 end cellerne i dybzonen.

Opførelsen af cellerne afhænger også af placeringen af vævet. Chondrocytter brusk- og øre kanter, taget fra det samme dyr, der reagerer forskelligt på vækstfaktorer såsom fibroblast-vækstfaktor (FGF), og TGF-beta. FGF øget thymidininkorporering, prolin og leucin til kulturen af chondrocytter ribben men ikke øret. TGF-P forøges inkorporeringen af thymidin i brusk chondrocytter ribben og øre, men havde ingen virkning på thymidin-inkorporering i chondrocytter og prolin øre. Bruskceller opnået fra zoner med den største belastning afviger fra dem fra steder med lav belastning på brusk. F.eks modne chondrocytter i brusk af knæleddet fra det centrale område af får artikulær tibiale knogle overflade ikke er dækket af menisken, som bærer den største belastning in vivo, mindre syntetiseret aggrecan, decorin men større end cellerne i de områder, som menisken. Forfatterne understreger også betydningen af at bruge brusk fra identiske fælles zoner, når man undersøger den syntetiske funktion af leddene.

Kondrocytternes metabolisme og deres reaktion på regulatoriske faktorer afhænger også i høj grad af donorens alder, udviklingen af dets skelet og tilstanden af leddene, hvorfra cellerne tages. I humane chondrocytter observeres et signifikant fald med alderen af det proliferative respons. Det største fald ses hos donorer i alderen 40-50 år og over 60 år. Endvidere falder sværhedsgraden af det proliferative respons på vækstfaktorer (fx FGF og TGF-beta) under aldring. Udover kvantitative ændringer i proliferationen af chondrocytter er der også kvalitative ændringer. Unge donorceller (10-20 år gamle) reagerer bedre på blodpladeafledt vækstfaktor (PDGF) end til TGF-beta, hvorimod det modsatte observeres i voksne donorceller. For at forklare de aldersafhængige ændringer i chondrocytes syntetiske funktion og deres respons på virkningen af vækstfaktorer anvendes flere mekanismer. Blandt dem er et fald i antallet og affiniteten af overfladecellereceptorer, en ændring i syntesen og bioaktiviteten af vækstfaktorer og cytokiner, en modifikation af postreceptorsignaler.

Den patologiske tilstand af leddene ændrer også chondrocytes morfologi og metaboliske aktivitet. Så, J. Kouri og medforfattere (1996) identificerede tre subpopulationer af chondrocytter i brusk med slidgigt. Chondrocytter fra overfladen, og øvre midten af brusk- og danner klynger af større antal syntetiserede proteoglycaner og collagen. TGF-beta, og insulin-lignende vækstfaktor (IGF) kan stimulere proteoglycansyntese af chondrocytter og delvist neutralisere virkningerne af IL-1 og TNF-a. Bruskeksplantater blev ramt af slidgigt, og chondrocytterne isoleret fra brusk af patienter med slidgigt, er mere følsomme over for stimulering af TGF-beta end raske brusk chondrocytter. Disse forskelle er højst sandsynligt forbundet med fænotypiske ændringer i chondrocytter i de øvre lag i ledbrusk.

Isolering af individuelle chondrocytter opnås ved sekventiel behandling med proteolytiske enzymer af ECM. Efter deres frigivelse fra ECM er isolerede celler ideelt egnet til at studere syntesen af de novo matrixkomponenter . Nogle forfattere bruger kun clostridiumkollagenase, andre præinkuberer brusk med trypsin, pronase, DNase og / eller hyaluronidase. Antallet af isolerede celler afhænger af de anvendte enzymer. Således ved bearbejdning kan opnås en af 1 g kollagenase væv 1,4T0 ⁶ chondrocytter, hvorimod når der anvendes pronase, hyaluronidase og collagenase - 4,3-10 ⁶. Ved behandling med collagenase forbliver aggrecan, proteiner, IL-6, IL-8 i cellekulturen meget mere end i tilfælde af sekventiel behandling med forskellige enzymer. Der er flere forklaringer for disse forskelle mellem de to cellekulturer:

• Cellulære receptorer beskadigede eller deprimerede ved indvirkning af enzymer, TGF-beta inhiberer DNA-syntese af proteoglycaner i nyligt isolerede chondrocytter (dag 1), mens DNA'et og proteoglycansyntese af chondrocytter dyrket i monolag (7 dage) stimuleret af TGF-beta. For at genudtrykke disse membrankomponenter kræves der imidlertid en passende periode før forsøgets start.
• Eksogene proteaser kan bryde interaktionen mellem celler og matrixen, medieret af integrin. Integrinfamilien fremmer tilknytningen af chondrocytter til VKM-molekyler (Shakibaei M. Et al., 1997). Denne ruptur kan påvirke ekspressionen af matrixgener.
• Rester af matrixkomponenter kan regulere chondrocytes syntetiske funktion. Integriner er i stand til at genkende nedbrydningsprodukter af ECM og spiller dermed en vigtig rolle i vævsreparation efter eksponering for proteolytiske enzymer. T. Larsson og medforfattere (1989) rapporterede, at tilsætningen af intakte eller fragmenterede pro-theoglycaner til cellekultur stimulerer syntesen af proteiner og proteoglycaner. Imidlertid høje niveauer af hyaluronsyre forårsager en signifikant reduktion i optagelsen af sulfat proteoglycansyntese ved chondrocytter kyllingeembryofibroblaster chondrocytter modne porcine og rotte chondrosarcomceller. Desuden hyaluronsyre - inhibitor af proteoglycanfrigivelse fra cellerne selv i nærværelse af IL-lb, TNF-a, FGF, hvilket indikerer, at den første modvirke den biologiske aktivitet af vækstfaktorer og cytokiner. Den nøjagtige mekanisme, der ligger til grund for virkningen af hyaluronsyre, forbliver uklar; Det er kendt, at chondrocytter indeholder en receptor for hyaluronsyre forbundet med actinfilamenter i cytosolen. Bindingen af hyaluronsyre til dets receptor stimulerer fosforyleringen af proteiner. Således viser disse data metaboliske modulerende funktioner af native chondrocytter eller fragmenterede molekyler matrixproteiner ved at aktivere cellemembranreceptorer.
• Den hurtige stimulering af enzymer af syntesen af matrixproteiner ved chondrocytter kan være en følge af en forandring i form af chondrocytter og / eller omorganisering af cytoskelettet.
• Nogle cytokiner (fx IL-8) og vækstfaktorer (fx IGF-1, TGF-P) er fikseret i ECM. Det mest kendte eksempel er bindingen af TGF-beta med decore, hvilket fører til et fald i evnen hos den førstnævnte til at inducere cellulær vækst i æggestokkene i kinesiske hamstere. De data, som indholdet af bruskdekoration øges med alderen, indikerer et fald i biotilgængeligheden af TGF-beta i aldring. Vækstfaktorer og cytokiner kan frigives fra matrixrester under dyrkning og derefter modulere chondrocytfunktion.

[8], [9], [10], [11],

Monolagskultur af kondrocytter

Den differentierede fænotype af kondrocytter er primært karakteriseret ved syntesen af type II kollagen og vævsspecifikke proteoglycaner såvel som et lavt niveau af mitotisk aktivitet. Der er bevis for, at langvarig dyrkning af celler i et monolag, og efter flere gentagne passager af celler, chondrocytter mister deres sfæriske form, blive forlænget, fibroblast-lignende form. Med en sådan fibroblast metaplasi syntesefunktion modificeres også celler, kendetegnet ved en progressivt fald i syntesen af collagener II, IX og XI typer og forbedret syntese af kollagen I, III og Utipov. Små ikke-aggregerede proteoglycaner syntetiseres ved funktionel aggrecan. Syntetazatpsin B og L er ekstremt lave i differentierede celler, men i processen med tab af differentiering øges. Collagenase-1 udtrykkes i differentierede chondrocytter under langvarig dyrkning dets ekspression er reduceret henviser øget produktion af vævsinhibitor af metalloproteaser (TIMP).

De differentierede chondrocytter repræsenterer kollagenet af den differentierede fænotype, når de overføres fra en monolagskultur til en suspenderet. Processen med differentiering er sandsynligvis relateret til cellernes form. Denne ejendom bruges regelmæssigt af forskere, der studerer defekte transplantater med autologe chondrocytter. Et lille antal celler opnået fra et biopsimateriale kan multipliseres i en monolagskultur og derefter anbringes igen i en tredimensionel matrix før transplantation. Re-ekspression af en bestemt fænotype dedifferentierede chondrocytter migrerede i agarose kultur, kan stimuleres ved TGF-p-benbrusk hydroxyapatit kompleks og ascorbinsyre.

Som reaktion på virkningen af vækstfaktorer og cytokiner modificeres chondrocytter under differentieringsprocessen. Den cellulære respons på cytokiner og vækstfaktorer varierer mellem udifferentierede og differentierede chondrocytter. IL-1 stimulerer proliferationen af fibroblaster, medens væksten af udifferentierede chondrocytter inhiberes af IL-1. Syntese af DNA stimuleres af IGF-1 i langstrakte, men ikke flade chondrocytter. I de differentierede chondrocytter er de stimulerende virkninger af IL-1β og TNF-a på procollagenaseprodukter mere udtalte end i udifferentierede.

Dyrkning af chondrocytter

Dyrkningen af chondrocytter i suspension i et flydende medium eller i en naturlig eller syntetisk tredimensionel matrix stabiliserer chondrocytens fænotype. Celler beholder deres sfæriske form, syntetiserer vævsspecifikke proteiner. En vægtet chondrocytkultur anbefales normalt til undersøgelsen af dannelsen af en ny pericellulær matrix. Chondrocytkulturer i syntetiske eller naturlige absorberende polymerer anvendes til at implantere celler i bruskdefekter for at stimulere regenerering af bruskvævet i leddet. Syntetiske eller naturlige omgivelser for implanterbare celler skal opfylde en række krav:

• Implantater bør have en porøs struktur til adhæsion og cellevækst,
• hverken selve polymeren eller produkterne af dets nedbrydning bør forårsage inflammation eller toksiske reaktioner under in vivo implantation ,
• transplantationsbæreren bør være i stand til at binde til en tilstødende brusk eller subchondral knogle,
• en naturlig eller syntetisk matrix skal være i stand til absorption, dets nedbrydning skal afbalanceres af vævsregenerering,
• For at lette brusk reparation bør matrixens kemiske struktur og matrix arkitektur hjælpe med at opretholde den cellefænotype kodet af chondrocytterne og syntesen af vævsspecifikke proteiner,
• under implantation in vivo er det nødvendigt at studere de mekaniske egenskaber af den syntetiske eller naturlige matrix.

[12], [13], [14], [15], [16]

Suspension af chondrocytter i den flydende fase

Cellebinding til plastbeholdere, hvor dyrkningen af chondrocytter kan forhindres deres vægge coatet med en opløsning methylcellulose, agarose, hydrogel (poly-2-hydroxyethylmethacrylat) eller en blanding af collagen-agarose. Under disse betingelser danner chondrocytter klynger og syntetiserer hovedsageligt aggrecan og vævsspecifikke collagener (II, IX, XI typer). Normalt findes to typer celler. Cellerne i midten bevarer en sfærisk form omgivet af en veludviklet ECM, som bekræftes af histokemiske og ultrastrukturelle undersøgelser. I periferien har chondrocytter discoide konturer, omgivet af en sjælden ECM; Lidt er kendt om sådanne cellers funktionelle egenskaber.

Dyrkning af chondrocytter på mikrobærere understøttet i suspension er mulig; Dextranperler (cytodex), kollagenbelagte dextranperler (cytodex III), ikke-tomme mikrosfærer af collagen type I (collagen) anvendes som mikrobærere. Under disse kulturbetingelser fastgør chondrocytter til overfladen af mikrobæreren, bevarer deres sfæriske form og frembringer et matrixlignende materiale. Desuden fremmer anvendelsen af collagen proliferationen af chondrocytter og reekspression af en normal fænotype. Derfor kan dyrkning af chondrocytter på collagenes mikrosfærer anvendes til at genoprette cellefænotypen inden transplantation.

En anden fremgangsmåde til dyrkning af chondrocytter suspenderet i et flydende medium er i form af deres dyrkning tætte kugler, der består af celler (0,5-1 * 10 ^b ) opnået ved centrifugering. Sådanne chondrocytter er i stand til at producere matrix indeholdende store mængder af proteoglycaner II-typen collagen, men ikke type I-kollagen, som blev bekræftet ved histologisk, immunhistokemisk og kvantitative metoder.

Suspension af chondrocytter i en naturlig ECM

Chondrocytter kan dyrkes i suspension i en tredimensionel matrix (blød agar, agarose, collagen gel eller svamp, hyaluronsyre, fibrinlim, alginatperler).

Kulturerede agarosekondrocytter opretholder deres normale fænotype og syntetiserer kollagen type II og vævsspecifikke aggregat-nye aggregater. Når dyrket i agarose, frigives celle-syntetiserede proteoglycaner i mediet i 50 dage. Til sammenligning - i monolagskultur overfyldes cellefasen med glycosaminoglycaner allerede i de første 5-6 dages dyrkning; når dyrket i et medium efter syntesen og frigivelsen af glycosaminoglycaner intensiveres, forekommer det tidsafhængige fald i glycosaminoglycaner i de første 8-10 dage. Ikke desto mindre adskiller adfærd af chondrocytter under deres dyrkning i agarose fra det i in vivo betingelser. I agarose indeholder et stort antal syntetiserede Aggregan-aggregater mindre og mindre molekyler end in vivo. TGF-P stimulerer syntesen af proteoglycaner i eksplantanten, men reducerer syntesen af aggrecan i agarose.

Alginat er et lineært polysaccharid afledt af brunt tang. I nærværelse af divalente kationer, såsom Ca2 ^{+ -ioner}, bliver denne polymer en gel. Hver chondrocyt fanget i alginat, omgivet af en matrix af negativt ladede polysaccharider, porer som er sammenlignelige med hyalin brusk. Den matrix, som er dannet chondrocytter i alginatkugler, som består af to segmenter - et tyndt lag af celleassocieret matrix svarer til de pericellulære og territoriale matrixer af ledbrusk og mere fjerntliggende matrix interterritorialt ækvivalent i nativ væv. På den 30. Dag i kultur, relativ og absolut volumen, der optages af celler, og hver af de to afdelinger i alginatkugle er næsten fuldstændigt identiske med dem af nativ brusk. For næsten 30 dage chondrocytter bevarer deres sfæriske form og producere aggrecan, hydrodynamiske egenskaber, der ligner dem af aggrecan molekyler i matrixen af ledbrusk og collagenmolekylet II, IX og XI typer. På samme tid, ligesom andre kulturer, suspensioner, alginatkugler på overfladen af udfladede celler er til stede, der genererer en lille mængde af type I collagen molekyler, frigives direkte i miljøet og ikke er indarbejdet i videobåndoptageren. I alginatperlerne observeres moderat proliferation af chondrocytter. 8 måneder efter dyrkning i alginatgel modne chondrocytter ikke mister metabolisk aktivitet og fortsætter med at syntetisere vævsspecifik collagen type II og aggrecan.

N. Tanaka og coauthors (1984) undersøgte diffusionsegenskaberne for forskellige naturlige molekyler i alginatet og fandt ud af, at molekyler større end 70 kD ikke diffunderer gennem alginatet. Således er dyrkning af celler i alginatet egnet til at studere reguleringen af matrixbiosyntese og organisationen af ECM. Tilgængeligheden af celler dyrket i alginatet tillader en at undersøge effekten af peptidregulerende faktorer og farmakologiske midler på transkriptionelle, posttransskriptionelle og translationelle niveauer.

Chondrocytter dyrkes også i en matrix af kollagenfibre I og II typer. S. Nehrer og medforfattere (1997) sammenlignede funktionen af hundchondrocytter i porøse kollagen-proteoglycan-polymermatricer indeholdende collagener af forskellige typer. De fandt vigtige forskelle i morfologien af den biosyntetiske funktion af chondrocytter dyrket i kollagenmatricer indeholdende kollagentyperne I og II. Celler i matrixen af kollagen type II rullede deres sfæriske form, mens de i type I-kollagen havde en fibroblastlignende morfologi. I matrixen af type II-kollagen producerede chondrocytter desuden flere glycosaminoglycaner. J. Van Susante et al. (1995) sammenlignede egenskaberne af chondrocytter dyrket i alginat- og collagen (type I) -gelen. Forfatterne fandt en signifikant stigning i antallet af celler i kollagengelen, men fra den 6. Dyrkningstid mistede cellerne en karakteristisk fænotype og blev til fibroblastlignende celler. I alginatgelen blev der observeret et fald i antallet af celler, men chondrocyterne bevarede deres normale fænotype. Mængden af kollagen gel proteoglycaner per celle var signifikant højere end i alginat, men blev observeret faldet i gelen matrixelementer syntese begyndende fra den 6. Dag af dyrkningen, mens der i alginat syntese fortsatte med at vokse.

En solid tredimensionel fibrinmatrix er et naturligt stof, der understøtter kondrocyterne, der vejes ind i det i en differentieret fænotype. 3D-fibrinmatrixen kan også anvendes som bærer til chondrocyttransplantation. Fordelene ved fibrin er fraværet af cytotoksicitet, evnen til at fylde rummet, klæbemidlet. Ved histologiske og biokemiske studier Autoren-diografii, elektronmikroskopi afslørede, at chondrocytterne i fibringeler bevarer deres morfologi, formere sig og producere matrix selv efter 2 ugers dyrkning. Dog G. Homminga et al (1993) rapporterede, at efter 3 dages dyrkning, begynder opløsningen af fibrin skrider dedifferentiering af chondrocytter.

Suspension af chondrocytter i en kunstig (syntetisk) ECM

Bruskimplantater til rekonstruktiv eller ortopædisk kirurgi kan opnås ved at dyrke isolerede chondrocytter in vitro i en syntetisk biokompatibel matrix.

Kultiverede polyglycolsyrekondrocytter prolifererer og opretholder normal morfologi og fænotype inden for 8 uger. Chondrocyt-polyglycolsyre-komplekset består af celler, glycosaminoglycaner, collagener og har en ydre kollagenkapsel. Imidlertid findes der i sådanne implantater to typer af kollagenmolekyler - I og II. Implantater af dedifferentierede chondrocytter serie af passager har en større mængde af glycosaminoglycaner og kollagen end i implantaterne ifølge udifferentierede primære chondrocytter.

L. Freed et al (1 993b) sammenlignet adfærd chondrocytkulturer af human og bovin i en fibrøs polyglycolsyre (EQAP) og i uenighed polilaktilovoy syre (pPLC). Efter 6-8 ugers dyrkning af tyrchondrocytter i HSVG eller PPLC observerede forfatterne celleproliferation og bruskmatrixregenerering. I HSBC var chondrocyterne sfæriske, placeret i lakuner omgivet af en bruskformet matrix. Efter 8 ugers in vitro- kultur indeholdt det regenererede væv op til 50% tørstof (4% celle masse, 15% glycosaminoglycaner og 31% kollagen). I PPLK-celler var spindelformet, en lille mængde glycosaminoglycaner og collagen. I HSBC var cellevæksten 2 gange mere intens end i PTCA. I in vivo betingelser producerede chondrocytter dyrket i HPVC og PPLC i 1 til 6 måneder et væv histologisk svarende til brusk. Implantater indeholdt glycosaminoglycaner, type I og type II collagener.

Fostale tyrchondrocytter blev dyrket i porøs højdensitetshydrofob og hydrofil polyethylen. Efter 7 dages inkubation i begge substrater tilbageholdt cellerne en sfærisk form, hovedsageligt indeholdende type II kollagen. Efter 21 dages dyrkning viste det sig ud, at den hydrofile matrix indeholder mere type II kollagen end den hydrofobe matrix.

Bruskvæv kan også opnås ved dyrkning i et monolag på Millicell-CM-filtre. For-belægning af filtrene med kollagen er nødvendig til fastgørelse af konditorer. Histologisk undersøgelse af kulturen demonstrerer akkumulering af chondrocytter i ECM-holdige proteoglycaner og type II kollagen. Kollagen type I i en sådan kultur er ikke detekteret. Chondrocytter i det resulterende bruskvæv har en sfærisk form, men på overfladen af vævet er de noget fladt. Tykkelsen af det nydannede væv steg med tiden og var afhængig af den oprindelige tæthed af monolaget af celler. Under optimale dyrkningsbetingelser nåede bruskvævets tykkelse 110 μm, organisationen af dens celler og kollagen i overfladen og dybe lag ligner den af ledbrusk. VKM indeholder ca. 3 gange mere kollagen og proteoglycaner. Efter 2 ugers dyrkning blev akkumulationen af matrix-sa noteret, hvilket gjorde det muligt at ekstrahere vævet fra filteret og anvende det til transplantation.

Sims et al. (1996) studerede dyrkning af chondrocytter i en polyethylenoxid-gelindkapslet polymermatrix, der tillader et stort antal celler at blive transporteret ved injektion. Seks uger efter injektion i det subkutane væv af athymiske mus blev der dannet en ny brusk, som morfologisk blev kendetegnet ved hvid opalescens svarende til hyalinbrusk. Data fra histologiske og biokemiske undersøgelser indikerede tilstedeværelsen af aktivt prolifererende chondrocytter, der producerer ECM.

Eksplantation

Undersøgelse af bruskvæv anvendes til at studere de ana- og kataboliske processer i den, homeostase, resorption og reparation. Chondrocytter i bruskvævende eksplantater understøtter den normale fænotype og sammensætning af ECM, svarende til dem i ledbrusk in vivo. Efter 5 dages dyrkning i nærværelse af serum opnås en konstant niveau af syntese og naturlig nedbrydning. Resorption kan accelerere vævskultur og i hovedkulturen med tilsætning af serum ved anvendelse af en række agenter, fx IL-IB, TNF-a, bakterialnyhlipopolisaharidov, derivater af retinoinsyre eller aktive oxygenradikaler. At studere dens reparation bruskskader induceres af opløselige inflammatoriske mediatorer (H ₂ O ₂, IL-1, TNF-a) eller fysisk sprængning af matrixen.

Metoden for organotypiske kulturer er en model til undersøgelse af in vitro- effekter af isolerede eksterne faktorer på chondrocytter og den omgivende matrix. In vivo er chondrocytter sjældent placeret i ECM og kontakter ikke hinanden. Kulturen i den eksplanterede ledbrusk bevarer denne strukturelle organisation såvel som de særlige interaktioner mellem chondrocytterne og deres omgivende ekstracellulære miljø. Denne model bruges også til at studere virkningen af mekanisk stress, farmakologiske midler, vækstfaktorer, cytokiner, hormoner på bruskets metabolisme.

En anden fordel ved bruskudvæksteksplantering er fraværet af kondrocytskader ved proteolytiske enzymer eller en mekanisk faktor, hvilket er uundgåeligt, når celler isoleres. Receptorer og andre membranproteiner og glycoproteiner er beskyttet mod skadelige faktorer.

[17], [18], [19], [20], [21]

Kultur af kondroner

Hondron - strukturelle, funktionelle og metaboliske ledbrusk bestående af chondrocyt pericellulære matrix og dens kompakte filament kapslen og er ansvarlig for homeostase af matrixen. Kondronerne ekstraheres mekanisk fra brusk og opsamles ved adskillige successive lavhastighedshomogeniseringer. Isoleret fra zoner med forskellige dybder hondrony brusk kan inddeles i fire kategorier: single hondron, dobbelt hondrony, multipel (tre eller flere) anbragt lineært hondrony (kolonne hondronov) hondronov overbelastning.

Enkelt hondrony normalt findes i mellemlagene i det intakte brusk, twin - på grænsen af den midterste og dybe lag anbragt lineært multipel hondrony typiske for de dybe lag af den intakte brusk. Endelig består klynger af kondroner af tilfældigt organiserede grupper af enkelt- og parrede kondroner, der bevarer den aggregerede tilstand efter homogenisering. Hondronov klynger repræsenterer store brusk fragmenter, sædvanligvis omfatter flere radialt hondronov og collagenfibriler, t. E. Den typiske organisation, som er karakteristisk for de dybe lag af matrixen. Chondroner immobiliseres i en gennemsigtig agarose, som gør det muligt at studere deres struktur, molekylær sammensætning og metabolisk aktivitet. Hondron systemet - agarose betragtes som en mikro model af brusk, som er forskellig fra det traditionelle system med chondrocyt - agarose der bevarer den naturlige mikromiljø, er der ikke behov for at udføre dets syntese og samling. Kondronernes kultur er en model til undersøgelse af celler og matrixers vekselvirkning i ledbrusk under normale og patologiske forhold.

[22], [23], [24], [25], [26], [27]

Kultur af udødelige chondrocytter

For at skabe permanente cellelinier anvendes rekombinant DNA eller onkogenholdige vira, der kan gøre cellen "udødelig". Immortale chondrocytter har evnen til uendelig proliferation, idet der opretholdes en stabil fænotype. F. Mallein-Gerin et al (1995) viste, at onkogenet er SV40T-induceret proliferation af muse chondrocytter, der således fortsat stabilt udtrykker den kollagener II, IX og XI typer, samt fælles og aggrecan bindingsprotein. Men denne cellelinie erhverver evnen til at syntetisere kollagen type I ved dyrkning det i monolagskultur eller i en agarosegel.

W. Horton og medforfattere (1988) beskrev en linje af udødelige celler med et lavt niveau af kollagen type II mRNA ekspression. Disse celler blev opnået ved at transformere dem med et mus retrovirus indeholdende I-myc- og y-ra-onkogener. Denne type celler er en unik model til undersøgelse af artiklernes vekselvirkning i fravær af type II kollagen, såvel som reguleringen af syntesen af type II kollagen.

Kondropytternes kultur med muterede eller deleterede gener er en bekvem model til at studere deres fysiologiske funktion. Denne model er særlig egnet til undersøgelser af betydningen af specifikke molekyler i bruskmatrix organisationer eller undersøgelse af virkningerne af forskellige regulerende faktorer på brusk metabolisme. Chondrocytter remote gen syntetiseret collagen type IX collagenfibriler bredere end normalt, hvilket indikerer, at collagen type IX regulerer diameter fibriller. Som bemærket i kapitel 1, den nyligt fundne genmutation COLAI koder type II-collagen i familier med primær generaliseret osteoarthritis. At undersøge virkningen af mutant collagen type II i den artikulære matrix R. Dharmrvaram et al (1997) udført transfektion ( "forurening" en fremmed nukleinsyre) defekt COL ₂ AI (arginin ved position 519 er erstattet med cystein) i humane føtale chondrocytter in vitro.

System af kulturer. I leddet interagerer brusk med celler af andre typer indeholdt i den synoviale membran, synovialvæske, ledbånd, subchondralben. Metabolismen af chondrocytter kan påvirkes af forskellige opløselige faktorer syntetiseret af disse celler. Således ødelægges arthritisk leddbrusk af proteolytiske enzymer og frie radikaler, der produceres af synoviale celler. Derfor er der udviklet modeller til at studere komplekse interaktioner mellem brusk og omgivende væv, der kaldes coculture.

S. Lacombe-Gleise et al (1995) var dyrkede kanin chondrocytter og osteoblaster i cokultursystem (COSTAR), hvori cellerne blev separeret mikroporøs membran (0,4 um) tillader udveksling mellem de to celletyper uden direkte kontakt. Denne undersøgelse viste osteoblasternes evne til at stimulere væksten af chondrocytter gennem opløselige mediatorer.

AM Malfait og medforfattere (1994) undersøgte forholdet mellem monocytter af perifert blod og chondrocytter. Denne model er anvendelig til undersøgelse af processer medieret af cytokiner på inflammatoriske arthropatier (reumatoid arthritis, seronegative spondylitis et al.). Forfatterne af modellen separerede cellerne med en proteinbindende membran med porer 0,4 μm i diameter. Undersøgelsen fandt, at lipopolysaccharidstimulerede monocytter udarbejdet ifno IL-1-a, som hæmmer syntesen af chondrocytter aggrecan og bidrog til forringelse af allerede syntetiserede aggrecan aggregater.

K. Tada et al (1994) skabte en cokultur model, hvor endotelceller i kollagen (I-type) gel blev anbragt i det indre kammer fra det ydre kammer adskilt fra den ved chondrocytter anbragt i et filter med en porestørrelse på 0,4 mikrometer. I den fulde isolering tilstand fra det ydre kammer af human endotelcelle rør formet i kollagengelen under tilstedeværelse af EGF eller TGF-a. Ved samtidig dyrkning af begge typer TGF-celler blev den afhængige dannelse af rørene ved hjælp af endotelceller inhiberet. Chondrocytinhiberingen af denne proces blev delvist elimineret af anti-TGF-beta-antistoffer. Det kan antages, at TGF-beta produceret af chondrocytter, hæmmer vaskularisering af brusk.

S. Groot og medforfattere (1994) dyrkede samtidigt chondrocytter fra de hypertrofe og proliferative zoner af knoglen i en 16-dages gammel føtale mus med stykker hjernevæv. Efter 4 dages dyrkning observeredes transdifferentiering af chondrocytter i osteoblaster og begyndelsen af osteoiddannelse. Efter 11 dages dyrkning blev en del af brusk erstattet af knoglevæv, og knoglematrixen blev delvist forkalket. Nogle neuropeptider og neurotransmittere produceret af hjernevæv, påvirker metabolisme af osteoblaster eller har receptorer på dem. Blandt dem kan norepinephrin, vasoaktivt intestinalt peptid, peptid associeret med calcitoningenet, substans P og somatostatin isoleres . Kultiveret med kondrocytter, kan stykker hjernevæv producere nogle af disse faktorer, hvilket kan inducere processen med chondrocyt-transdifferentiering i osteoblaster.

[28], [29], [30], [31], [32], [33]

Indflydelsen af eksterne faktorer på kondrocytternes kultur

Effekten af iltspændinger på metabolisme af kondrocytter

I de fleste tilfælde udvikles chondrocytkulturer under betingelser med atmosfærisk iltspænding. Ikke desto mindre er det velkendt, at in vivo chondrocytter eksisterer under hypoxiske betingelser, og oxygenstrømmen varierer med forskellige patologiske tilstande. Under modningsprocessen observeres signifikante ændringer i blodtilførslen af epifyserne. Da vaskularisering varierer i forskellige områder af vækstpladen, varierer iltspændingen i dem også. C. Brighton og R. Heppenstall (1971) viste, at iltspændingen i den hypertrofiske zone i tibiapladen på kaniner er mindre end i den omgivende brusk. Målinger af nogle metaboliske parametre har vist, at chondrocytter er i stand til at reagere hurtigt på lokale ændringer i iltkoncentration. Først og fremmest reduceres forbruget af kondrocytter med lavt iltspænding. Med et fald i iltspændingen fra 21 til 0,04% øges glukoseudnyttelsen, glykolysenzymaktiviteten og mælkesyre syntese øges. Selv med en lav iltspænding forbliver den absolutte mængde ATP, ADP og AMP stabil. Disse data indikerer retningen af chondrocyt metabolisme for at maksimere energibesparelse. Ikke desto mindre ændres den syntetiske aktivitet og dermed erstatningsprocessen under hypoxiforhold.

Høj iltspænding påvirker også metabolisme af chondrocytter, hvilket medfører et fald i syntesen af proteoglycaner og DNA, nedbrydning af bruskens matrix. Disse virkninger ledsages som regel af produktionen af frie oxygenradikaler.

Indflydelse af ionkoncentration og osmotisk tryk på miljøet på chondrocytters funktion

I den native brusk ionkoncentration er væsentlig forskellig fra den for andre væv: natriumindholdet i det ekstracellulære medium er 250 - 350 mmol, og dens osmolaritet - 350-450 mOsm. Når isolere chondrocytter fra en videobåndoptager og inkubere dem i en standard medier (DMEM (Dulbeccos Minimal Essential Medium - Dulbeccos Minimum Essential medium) osmolaritet - 250-280,7 mOsm) ændrer kraftigt omgivende miljø af cellen. Derudover er koncentrationen af calcium og kalium i standardmedier meget lavere end i nativt væv, og koncentrationen af anioner er meget højere.

Tilsætning af saccharose til mediet fører til en stigning i dens osmolaritet og inducerer en forbigående intracellulær stigning i koncentrationen af H ⁺ og calciumanioner i cytosolen. Sådanne intracellulære ændringer kan påvirke processerne af chondrocyt differentiering og deres metaboliske aktivitet. J. Urban et al (1993) fandt, at optagelsen af ³⁵ 8-sulfat og ³ H-prolin isolerede chondrocytter inkuberet i DMEM standardmedium i 2-4 timer, var kun 10% af det i det native væv. Syntese intensitet toppede når osmolariteten af det ekstracellulære medium på 350-400 mOsm i nyligt isolerede chondrocytter og bruskeksplantaterne i. Endvidere steg chondrocytevolumenet med 30-40% efter anbringelse af isolerede celler i et standard DMEM-medium af osmolariteten. Men når dyrkede chondrocytter under ikke-fysiologiske osmolaritet i 12-16 timer, cellerne er tilpasset det nye miljø ved at reducere intensiteten af forskydning er proportional biosyntese osmolaritet det ekstracellulære medium.

P. Borgetti et al (1995) undersøgte virkningen af osmolariteten af det ekstracellulære medium på væksten, morfologi, og biosyntesen af porcine chondrocytter. Forfatterne demonstrerede lignende biokemiske og morfologiske forhold på chondrocytter dyrket i medier med en osmolaritet mOsm 0,28 og 0,38. Når 0,48 mOsm osmolaritet af mediet i løbet af de første 4-6 timers dyrkning blev observeret fald i celleproliferation og proteinsyntese, men efterfølgende forekom genoprette disse parametre, som til sidst nåede kontrolværdierne. Når dyrkning af chondrocytter i et medium med 0,58 mOsm osmolaritetsregulerende celler mister deres evne til at understøtte fysiologisk intensitet proliferative processer og efter 6 dage blev antallet af chondrocytter væsentligt. Med osmolaritet af mediet, 0,58 mosmol, observeres en dyb inhibering af proteinsyntese. Hertil kommer, når dyrket i medier med en osmolaritet mOsm 0,28-0,38 chondrocytter bibeholde fysiologisk fænotype ved en højere osmolaritet (mOsm 0,48-0,58) væsentlige ændringer i cellemorfologi, som manifesterede tab karakteristisk fænotype chondrocytter konvertering i fibroblastlignende celler, såvel som celletab, evnen til at samle matrixproteoglycaner. Resultaterne af denne undersøgelse indikerer chondrocytternes evne til at reagere på begrænsede osmolalitetsoscillationer i det ekstracellulære miljø.

Ændringen i koncentrationen af andre ioner kan også påvirke biosynteseprocessen i chondrocytter. Således er graden af inkorporering af ³⁵ er S (sulfater) øges med en halv med stigende kaliumionkoncentration af 5 mM (koncentrationen i standard miljø DM EM) til 10 mM (koncentrationen i ECM in vivo). calciumkoncentrationen under 0,5 mmol fremmes kollagenproduktion af modne bovine chondrocytter, medens koncentrationen af 1-2 mM (svarer til en koncentration i standard miljø DM EM) forårsagede en signifikant reduktion i collagensyntese. En moderat stigning i biosyntese blev observeret ved høje niveauer af calcium (2-10 mmol). Forskellige kationer deltager i bindingen af chondrocytter til VKM proteiner. Således tilvejebringer magnesium og manganioner binding til fibronectin og kollagen type II, medens calciumioner ikke deltager i bindingen af chondrocytter til proteiner. Således resultaterne af undersøgelser, der er beskrevet demonstrerer virkningen af ændringer i ekstracellulære kaliumioner, natrium, calcium, og osmolariteten af mediet på chondrocyt funktion biosyntetisk inkuberet i standard medier.

Indflydelsen af mekanisk stress på metabolisme af kondrocytter

Immobilisering af leddet forårsager en reversibel atrofi af brusk, hvilket indikerer behovet for mekaniske stimuli for det normale forløb af metaboliske processer i ECM. I de fleste tilfælde eksisterer de anvendte cellekulturmodeller under normale atmosfæriske trykforhold. M. Wright og medforfattere (1996) viste, at det mekaniske miljø påvirker metabolisme af chondrocytter, responsen af celler afhænger af intensiteten og frekvensen af kompressionsbelastningen. Forsøg med belastningen på intakte eksplantater af ledbrusk in vitro påvist et fald på syntese af proteiner og proteoglycaner under statisk belastning, dynamisk belastning mens stimulere disse processer. De præcise mekanismer for gennemførelse af de mekaniske belastning virkninger på brusk kompleks, og sandsynligvis relateret til stamme celler, det hydrostatiske tryk, osmotiske tryk, elektrisk potentiale og celleoverfladereceptorer til matrixmolekyler. For at studere effekten af hver af disse parametre er det nødvendigt at oprette et system, hvor en parameter kan varieres uafhængigt. Eksempelvis er en eksplanterende kultur ikke egnet til at studere celledeformation, men den kan bruges til at studere den samlede effekt af tryk på chondrocytes metaboliske aktivitet. Kompression af brusk fører til celle deformation, og også ledsaget af forekomsten af hydrostatisk trykgradient, elektrisk potentiale, og fluidstrømning ændring fysisk sådanne faktorer som vandindholdet i matrixen, tætheden af elektrisk ladning, omfanget af osmotisk tryk. Celledeformation kan studeres ved anvendelse af isolerede chondrocytter nedsænket i en agarose- eller collagengel.

Flere systemer er blevet udviklet for at studere effekten af mekanisk stimulering på kondrocytternes kultur. Nogle forskere bruger systemer til dette formål, hvor trykket påføres cellekulturen gennem gasfasen. For eksempel beskriver JP Veldhuijzen et al (1979) under anvendelse af et tryk over atmosfærisk tryk på 13 kPa ved en lav frekvens (0,3 Hz) i løbet af 15 minutter, observeret en stigning i cAMP-syntese og proteoglycaner og sænke DNA-syntese. R. Smith et al (1996) viste, at den intermitterende eksponering af primære kulturer af chondrocytter noget hydrostatisk tryk (10 MPa) ved 1 Hz i 4 timer forårsagede stigningen af syntesen af aggrecan og collagen type II, hvorimod det konstante tryk havde ingen virkning på disse processer. Under anvendelse af et lignende system M. Wright et al (1996) rapporterede, at den cykliske pres på cellekulturen er forbundet med hyperpolarisation af cellemembranen af chondrocytter og aktivering af Ca ²⁺ afhængige kaliumkanaler. Således medieres virkningerne af cyklisk tryk med ionkanaler, der aktiveres ved strækning i chondrocytemembranen. Responset af chondrocytter til hydrostatisk tryk afhænger af betingelserne for cellekultur og hyppigheden af den påførte belastning. Således, cyklisk hydrostatisk tryk (5 MPa) reducerer inkorporering af sulfat i chondrocyt monolag ved en frekvens på 0,05, 0,25 og 0,5 Hz, mens det for frekvenser over 0,5 Hz inklusion sulfat i brusk eksplantat stiger.

M. Bushmann et al. (1992) rapporterede, at chondrocytter i en agarosegel-alterbiosyntese som reaktion på en statisk og dynamisk mekanisk belastning på samme måde som et dyrket intakt organ. Forfatterne fandt, at den mekaniske belastning genererer en hyperosmotisk stimulus efterfulgt af et fald i pH i chondrocytterne.

Virkningen af mekanisk strækning kan studeres på en kultur af celler nedsænket i en gel. Strækkraften kan skabes ved hjælp af et computerstyret vakuum. Når systemet er i en vis grad af vakuum, er bunden af en petriskål med en kultur af celler forlænges med en kendt mængde, en maksimal deformation ved kanterne af bægerbunden og minimum i midten. Stretching overføres og dyrkes i en petriskål af chondrocytter. Med denne metode, Holm-vall K. Et al (1995) viste, at dyrkede i kollagen (II type) gel chondrosarcomceller forøgede ekspression af mRNA og ₂ -integrina. En ₂ p _r integrin kan binde til kollagen type II. Det betragtes som en mekanoreceptor, da den interagerer med actinbindende proteiner, hvorved ECM og cytoskelettet forbindes.

Virkning af pH på chondrocyt metabolisme

PH i den interstitiale væske af ECM i det bruskvæv er mere sure end i andre væv. A. Maroudas (1980) fastslog leddbruskets pH ved 6,9. W. Diamant og medforfattere (1966) fandt en pH på 5,5 i patologiske tilstande. Det er kendt, at chondrocytter lever ved lav PO2, hvilket angiver den vigtige rolle glycolyse (95% af den totale glukosemetabolismen) i metabolisme af disse celler; glycolyse ledsages af produktion af en stor mængde mælkesyre.

Ud over forsuring af miljøet med produkterne af glycolyse er matrixkomponenterne selv af stor betydning. Et stort antal faste negative ladning på de ekstracellulære proteoglycaner modificerer den ioniske sammensætning: der er en høj koncentration af frie kationer (fx H ⁺, Na ⁺, K ⁺ ) og lav koncentration af anioner (fx O2, NPHS). Derudover udsættes der under påvirkning af en mekanisk belastning vand fra ECM, hvilket fører til en stigning i koncentrationen af faste negative ladninger og tiltrækningen af flere kationer til matrixen. Dette ledsages af et fald i pH-værdien i det ekstracellulære medium, der påvirker den intracellulære pH, og derved ændrer metabolismen af chondrocytter. R. Wilkin og A. Hall (1995) undersøgte virkningen af pH i det ekstracellulære og intracellulære medium på biosyntesen af matrixen ved hjælp af isolerede tyrchondrocytter. De observerede en dobbelt modifikation af matrixsyntese med et fald i pH. Et lille fald i pH (7,4 35 S0 ₄ og ³ H-prolin til chondrocytter, mens dybere forsuring (pH <7,1) hæmmer syntesen med 75% sammenlignet med kontrol. Oprettelse af den samme lave pH (6,65) med ammoniumioner forårsagede et fald i matrixsyntese med kun 20%. De opnåede resultater indikerer, at modifikationen af pH-værdien i det ekstracellulære matrixsyntesemedium ikke kan forklares kun ved ændringer i det intracellulære mediums pH. Endvidere chondrocytter besidder evnen til at regulere intracellulære pH ved Na ⁺, H ⁺ varmeveksler, Ca ⁺ -afhængig C1 ^_ -NSOZ -CONVEYORS og H ⁺ / ATPase.

[34], [35], [36], [37], [38], [39], [40]

Virkning af sammensætningen af mediet til dyrkning af chondrocytternes metabolisme

Mediet til dyrkning af chondrocytterne skal svare til forsøgsbetingelserne. I de senere år er kalveserum blevet anvendt til at optimere kulturbetingelserne. Men når der anvendes serum, skal flere vigtige punkter overvejes:

• ekstern vækst af celler fra vævets periferi i orgelkulturer,
• variabiliteten af sammensætningen af sera af forskellige serier,
• tilstedeværelse af ukendte komponenter i dem,
• øget risiko for interferens, artefakter i undersøgelsen af indflydelsen af forskellige biologiske faktorer på den metaboliske aktivitet af celler.

Et eksempel på sidstnævnte er undersøgelsen af virkningen af EGF på bruskchondrocytter hos rotter. EGF stimulerede inkorporering af ³ H-thymidin og øge DNA-indholdet i kulturen. Denne effekt var mere udtalt ved lave serumkoncentrationer (<1%), men i høje koncentrationer (> 7,5%) forsvandt effekten.

Det er velkendt, at niveauer af syntese og nedbrydning i DMEM beriget med kalveserum er signifikant øget sammenlignet med in vivo betingelser. Forskelle mellem in vivo og in vitro metabolisme kan skyldes forskelle mellem synovialvæsken og det miljø, hvori cellerne dyrkes. D. Lee et al (1997) var dyrkede chondrocytter ungtyre agarose anvender et næringsmedium indeholdende DMEM beriget med 20% kalveserum og et stort antal allogene normal synovialvæske. Tilstedeværelsen af synovialvæske i mediet inducerede stigning i mængden af proteoglycaner, op til 80% af ledvæske. Disse resultater indikerer, at synovialvæske i kultur inducerer metaboliske sats, der svarer til den in vivo, med høje niveauer af syntese af glycosaminoglycaner og lave niveauer af celledeling.

G. Verbruggen et al (1995) viste, at syntesen af ³⁵ S-arrpeKaHa humane chondrocytter dyrket i agarose i DMEM uden serum var 20-30% af niveauet for syntese observeret i DMEM suppleret med 10% kalveserum. Forfatterne bestemme omfang, hvor IGF-1, IGF-2, TGF-P eller reduceret insulinproduktion aggrecan i medium uden serum. Forfatterne konkluderede, at 100 ng / ml insulin, IGF-1 eller IGF-2 delvis reduceret syntese af aggrecan til 39-53% af kontrolniveauer. Med en kombination af disse faktorer er der ikke identificeret nogen synergistiske eller kumulative fænomener. Samtidig, 10 ng / ml TGF-P i nærvær af 100 ng / ml insulin stimulerede syntese af aggrecan til 90% eller mere af referenceniveauet. Endelig påvirker serumtransferrin, alene eller i kombination med insulin, ikke syntesen af aggrecan. Når kalveserum blev erstattet med bovinserumalbumin, blev aggregatindholdet af aggrecan signifikant reduceret. Berigelse dyrkningsmedium med insulin, IGF, eller TGF-P er delvist gendannet cellers evne til at producere aggrecan aggregater. I dette tilfælde er IGF-1 og insulin i stand til at opretholde homeostase i cellekulturer. Efter 40 dages dyrkning i medium suppleret med 10-20 ng / ml IGF-1 blev proteoglycansyntese holdt på samme niveau eller endda højere sammenlignet med medium indeholdende 20% kalveserum. Kataboliske processer gået langsomt i medium suppleret med IGF-1 end i mediet suppleret med 0,1% albumin opløsning, men noget hurtigere i medium suppleret med 20% serum. I levende kulturer opretholder 20 ng / ml IGF-1 en stabil tilstand af celler.

D. Lee et al (1993) sammenlignede virkningen af præparatet dyrkningsmedium (DMEM, DMEM + 20% kalveserum, DMEM + 20 ng / ml IGF-1) på DNA-syntese i en kultur af eksplantat brusk, monolagskultur og i suspension i agarose . Når de dyrkes i agarose i nærværelse af serum, observerede forfatterne en tendens til at gruppere chondrocytter i store klynger. Celler dyrket uden serum eller med IGF-1 blev opbevaret i en rundformet agarose, samlet i små grupper, men dannede ikke store aggregater. I monolaget var syntesen af DNA signifikant højere i serumholdige medier end i mediet beriget med IGF-1; Syntesen af DNA i sidstnævnte var meget højere end i det uberørte miljø. Ved dyrkning af chondrocytter i en suspension i agarose i et ikke-beriget medium og i medier med IGF-1 blev der ikke observeret forskelle i DNA-syntese. Samtidig opslæmningen dyrkning chondrocytter i agarose i medium suppleret med serum, blev ledsaget af en øget inkorporering af radionukleotid ³ H-thymidin i forhold til andre miljøer.

C-vitamin er nødvendigt for aktivering af enzymer involveret i dannelsen af en stabil spiralstruktur af collagenfibriller. Chondrocytter, mangelfulde med hensyn til ascorbinsyre, syntetiserer underhydroxylerede ikke-spiralformede precursorer af collagen, der langsomt udskilles. Indførelsen af ascorbinsyre (50 μg / ml) forårsager hydroxylering af kollagen typer II og IX og deres sekretion i normale mængder. Tilsætningen af C-vitamin påvirker ikke syntesens niveau for proteoglycaner. Følgelig reguleres sekretionen af collagen uafhængigt af sekretionen af proteoglycaner.

[41], [42], [43], [44], [45], [46], [47]