Stamceller og regenerativ plastikmedicin

I dag er der få praktiserende læger, der ikke kender til udviklingen af en ny retning i behandlingen af de mest alvorlige sygdomme, som tidligere ikke kunne uhelbredes med traditionel og alternativ medicin. Vi taler om regenerativ-plastisk medicin, baseret på udnyttelsen af stamcellers regenerative potentiale. En hidtil uset videnskabelig diskussion og pseudovidenskabelig hype er opstået omkring denne udviklingsretning, i høj grad skabt takket være informationshyperbolerne på internettet. På meget kort tid er laboratorieundersøgelser af stamcellers terapeutiske evner gået ud over eksperimentet og er begyndt at blive aktivt introduceret i praktisk medicin, hvilket har givet anledning til en række problemer af videnskabelig, etisk, religiøs, juridisk og lovgivningsmæssig karakter. Statslige og offentlige institutioner har tydeligvis vist sig at være uforberedte på den hastighed, hvormed stamceller går fra petriskåle til systemer til intravenøs administration, hvilket ikke er gavnligt for hverken samfundet som helhed eller en specifik lidende person. Det er ikke let at forstå den ufattelige mængde information om stamcellers evner, både i mængde og kvalitet, selv for specialister (som der ikke findes nogen af, da alle forsøger at mestre den nye videnskabelige tendens på egen hånd), for ikke at nævne læger, der ikke er direkte involveret i regenerativ plastisk medicin.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ]

Hvorfor er sådanne eksperimenter nødvendige, og er de overhovedet nødvendige?

Ved første øjekast er skabelsen af cellulære interspecies-kimærer frugten af en fanatisk videnskabsmands uhæmmede fantasi, der har glemt bioetik. Det er imidlertid denne tilgang, der har udvidet vores grundlæggende viden om embryogenese betydeligt, da den har gjort det muligt at beregne antallet af celler, der er nødvendige for organogenese (dannelsen af lever, hjerne, hud og organer i immunsystemet). Derudover (måske er dette det vigtigste i ESC-biologi) har genetikere fået et unikt værktøj til deres rådighed, ved hjælp af hvilket genernes funktionelle formål kan fastslås under kimæriseringen af embryoner. Først anvendes en speciel dobbelt knockout-teknik til at "slukke" det undersøgte genpar i ESC'er. Derefter introduceres sådanne ESC'er i en blastocyst, og de ændringer, der sker i kroppen af det udviklende kimære embryo, overvåges. På denne måde blev funktionerne af generne sf-1 (udvikling af binyrerne og kønsorganerne), urt-l (nyre-anlage), muoD (udvikling af skeletmuskulaturen) og gata-l-4 (anlage af erythropoiese og lymfopoiese) fastlagt. Derudover kan humane gener, der endnu ikke er blevet undersøgt, introduceres (transficeres) i ESC'er hos forsøgsdyr for at bestemme deres funktion ved hjælp af et kimært embryo.

Men som regel finder retfærdiggørelse af et eksperiment ved at opnå ny grundlæggende viden ikke støtte fra et bredt publikum. Lad os give et eksempel på den anvendte betydning af kimærisering ved hjælp af ESC'er. Først og fremmest er dette xenotransplantation, det vil sige transplantation af dyreorganer til mennesker. Teoretisk set giver skabelsen af kimærer fra menneske-svineceller os mulighed for at opnå et dyr, der er meget tættere på ESC-donorens antigene egenskaber, hvilket i forskellige kliniske situationer (diabetes mellitus, levercirrose) kan redde en syg persons liv. Sandt nok skal vi først lære, hvordan man returnerer totipotensegenskaben til genomet af en moden somatisk celle, hvorefter den kan introduceres i et udviklende svineembryo.

I dag bruges ESC'ers evne til at dele sig næsten uendeligt under særlige dyrkningsbetingelser til at producere totipotent cellemasse med efterfølgende differentiering til specialiserede celler, såsom dopaminerge neuroner, som derefter transplanteres til en patient med Parkinsons sygdom. I dette tilfælde forudgås transplantationen nødvendigvis af målrettet differentiering af den opnåede cellemasse til specialiserede celler, der er nødvendige til behandling og oprensning af sidstnævnte fra udifferentierede cellulære elementer.

Som det senere viste sig, var truslen om kræftudvikling langt fra den eneste hindring for celletransplantation. Spontant differentierer ESC'er i embryoide legemer heterogent, dvs. de danner derivater af en bred vifte af cellelinjer (neuroner, keratinocytter, fibroblaster, endotelocytter). I mikroskopets synsfelt skiller kardiomyocytter sig i dette tilfælde ud blandt celler af forskellige fænotyper, som hver især trækker sig sammen i sin egen rytme. For at behandle en patient er det dog nødvendigt at have rene cellepopulationer: neuroner - i tilfælde af slagtilfælde, kardiomyocytter - i tilfælde af myokardieinfarkt, β-celler i bugspytkirtlen - i tilfælde af diabetes mellitus, keratinocytter - i tilfælde af forbrændinger osv.

Det næste trin i udviklingen af celletransplantation var forbundet med udviklingen af teknologier til at opnå et tilstrækkeligt antal (millioner af celler) af sådanne rene cellepopulationer. Søgningen efter faktorer, der forårsager den målrettede differentiering af ESC'er, var empirisk, da rækkefølgen af deres syntese under embryogenesen forblev ukendt. Først blev det fastslået, at dannelsen af blommesækken induceres ved at tilsætte cAMP og retinsyre til ESC-kulturen. Hæmatopoietiske cellelinjer blev dannet i nærvær af 1L-3, SCF, fibroblastvækstfaktor (FGH), insulinlignende vækstfaktor (IGF-1), 1L-6 og granulocytkolonistimulerende faktor (G-СSF) i dyrkningsmediet. Nervesystemceller blev dannet fra ESC'er efter fjernelse af LIF og fibroblastlaget, der fungerede som fødekilde. Efter behandling med retinsyre i nærvær af føtalt serum begyndte ESC'er at differentiere til neuroner, og kardiomyocytter blev opnået ved at tilsætte dimethylsulfoxid (DMSO), som giver målrettet levering af hydrofobe signalmolekyler til cellekernen. I dette tilfælde bidrog akkumuleringen af aktive iltarter i dyrkningsmediet, såvel som elektrisk stimulering, til dannelsen af modne kontraktile kardiomyocytter.

Enorme kræfter og ressourcer blev brugt på at finde betingelser for differentiering af ESC'er til insulinproducerende celler i bugspytkirtlen. Det blev dog hurtigt klart, at en række specialiserede cellelinjer (pankreatiske β-celler, immun- og endokrine celler, adipocytter) ikke opstår fra ESC'er, når de stimuleres i henhold til princippet om "én stimulerende faktor - én cellelinje". Dette princip viste sig kun at være gyldigt for et begrænset antal cellelinjer. Især kan dannelsen af neuroner induceres af retinsyre, muskelcellelinjer - af transformerende vækstfaktor-β (TCP-β), erytroide linjer - 1L-6, monocytisk-myeloid linje - 1L-3. Desuden viste virkningerne af disse faktorer på differentieringen af ESC'er sig at være strengt dosisafhængige.

Fasen med at søge efter kombinationer af vækstfaktorer, der ville fremme ESC'er til senere stadier af embryogenesen med dannelsen af mesoderm (kilden til kardiomyocytter, skeletmuskulatur, renaltubuliepitel, myeloerythropoiesis og glatte muskelceller), ektoderm (epidermis, neuroner, nethinde) og endoderm (tyndtarmens epitel og sekretoriske kirtler, pneumocytter) begyndte. Naturen syntes at tvinge forskere til at bevæge sig fremad ad embryogenesens vej og gentage dens stadier i en petriskål uden at give mulighed for øjeblikkeligt og nemt at opnå det ønskede resultat. Og sådanne kombinationer af vækstfaktorer blev fundet. Activin A i kombination med TGF-β viste sig at være en kraftig stimulator for dannelsen af mesodermale celler fra ESC'er, samtidig med at den blokerer udviklingen af endoderm og ektoderm. Retinsyre og en kombination af knoglemarvsmorfogenetisk protein (BMP-4) og epidermal vækstfaktor (EGF) signaler aktiverer dannelsen af ekto- og mesodermceller og stopper udviklingen af endoderm. Intensiv cellevækst i alle tre kimlag observeres med samtidig effekt af to faktorer på ESC'er - hepatocytvækstfaktor (HGF) og nervecellevækstfaktor.

For at opnå de nødvendige cellelinjer er det derfor nødvendigt først at overføre embryonale stamceller til dannelsesstadiet af celler i et eller andet kimlag og derefter udvælge en ny kombination af vækstfaktorer, der er i stand til at inducere den målrettede differentiering af ekto-, meso- og endoderm til specialiserede celler, der er nødvendige for transplantation til patienten. Antallet af kombinationer af vækstfaktorer er i dag i tusindvis, de fleste af dem er patenterede, nogle er slet ikke offentliggjort af biotekvirksomheder.

Det var tid til at rense de opnåede celler fra udifferentierede cellulære urenheder. De celler, der var differentieret i kulturen, blev mærket med markører fra modne cellelinjer og ført gennem en højhastighedslaserimmunofænotypisk sorterer. Laserstrålen fandt dem i den generelle cellulære strøm og dirigerede dem langs en separat bane. Forsøgsdyr var de første til at modtage det opnåede rensede cellulære materiale. Det var tid til at evaluere effektiviteten af at bruge ESC-derivater på modeller af sygdomme og patologiske processer. En af sådanne modeller var eksperimentel Parkinsons sygdom, som er velreproduceret hos dyr ved hjælp af kemiske forbindelser, der ødelægger dopaminerge neuroner. Da sygdommen hos mennesker er baseret på en erhvervet mangel på dopaminerge neuroner, var brugen af erstatningscelleterapi i dette tilfælde patogenetisk berettiget. Hos dyr med eksperimentel hemiparkinsonisme slog omkring halvdelen af de dopaminerge neuroner, der blev opnået fra ESC'er og introduceret i hjernestrukturerne, rod. Dette var tilstrækkeligt til at reducere sygdommens kliniske manifestationer betydeligt. Forsøg på at genoprette funktionen af beskadigede CNS-strukturer i eksperimentelle slagtilfælde, skader og endda rygmarvsrupturer har vist sig ret succesfulde.

Det skal dog bemærkes, at næsten alle tilfælde af vellykket brug af differentierede ESC-derivater til korrektion af eksperimentel patologi blev udført i den akutte periode af den simulerede patologiske situation. Resultaterne af fjernbehandling var ikke så betryggende: efter 8-16 måneder forsvandt den positive effekt af celletransplantation eller faldt kraftigt. Årsagerne til dette er ret klare. Differentiering af transplanterede celler in vitro eller in loco morbi fører uundgåeligt til ekspression af cellulære markører for genetisk fremmedhed, hvilket fremkalder et immunangreb fra recipientens krop. For at løse problemet med immunologisk inkompatibilitet blev traditionel immunsuppression anvendt, parallelt med hvilken kliniske forsøg begyndte at realisere potentialet for transdifferentiering og genetisk korrektion af autologe hæmatopoietiske og mesenkymale stamceller, der ikke forårsager en immunkonflikt.

Hvad er regenerativ plastikmedicin?

Evolutionen har fastlagt to hovedmuligheder for afslutningen af en celles levetid - nekrose og apoptose, som på vævsniveau svarer til processerne for proliferation og regeneration. Proliferation kan betragtes som en slags offer, når udfyldningen af defekten i det beskadigede væv sker på grund af dets erstatning med bindevævselementer: mens kroppen opretholder den strukturelle integritet, mister den delvist funktionen af det berørte organ, hvilket bestemmer den efterfølgende udvikling af kompenserende reaktioner med hypertrofi eller hyperplasi af de strukturelle og funktionelle elementer, der forbliver intakte. Varigheden af kompensationsperioden afhænger af mængden af strukturelle læsioner forårsaget af faktorer som primær og sekundær ændring, hvorefter der i langt de fleste tilfælde opstår dekompensation, en kraftig forringelse af kvaliteten og en reduktion i menneskets levetid. Fysiologisk regenerering sikrer remodelleringsprocesser, det vil sige erstatning af aldrende og døende celler ved hjælp af mekanismerne for naturlig celledød (apoptose) med nye, der stammer fra menneskekroppens stamcellereserver. Processerne med reparativ regenerering involverer også stamcellernes cellulære ressourcer, som imidlertid mobiliseres under patologiske forhold forbundet med sygdom eller vævsskade, hvilket initierer celledød gennem nekrosemekanismer.

Forskernes, lægers, pressens, fjernsynets og offentlighedens store opmærksomhed på problemet med at studere embryonale stamcellers (ESC) biologi skyldes først og fremmest det store potentiale i cellulær eller, som vi kalder det, regenerativ-plastisk terapi. Udviklingen af metoder til behandling af de mest alvorlige menneskelige sygdomme (degenerativ patologi i centralnervesystemet, rygmarvs- og hjerneskader, Alzheimers og Parkinsons sygdomme, multipel sklerose, myokardieinfarkt, arteriel hypertension, diabetes mellitus, autoimmune sygdomme og leukæmi, brandsår og neoplastiske processer udgør en langt fra komplet liste) er baseret på stamcellernes unikke egenskaber, som muliggør skabelsen af nyt væv til at erstatte, som man tidligere troede, irreversibelt beskadigede vævsområder i en syg organisme.

Fremskridtene inden for teoretisk forskning i stamcellebiologi i løbet af de sidste 10 år er blevet realiseret af spontant fremvoksende områder inden for den nye regenerative-plastiske medicin, hvis metode ikke kun er ret modtagelig for systematisering, men også kræver det. Det første og hurtigst udviklende område for praktisk anvendelse af stamcellers regenerative potentiale er blevet erstatningsterapi for regenerativ-plastisk behandling. Dens vej er ret let at spore i den videnskabelige litteratur - fra dyreforsøg med myokardienekrose til de seneste års arbejde med at genoprette postinfarktmangelen i kardiomyocytter eller genopbygge tabet af β-celler i bugspytkirtlen og dopaminerge neuroner i centralnervesystemet.

Celletransplantation

Grundlaget for substitutiv regenerativ-plastisk medicin er celletransplantation. Sidstnævnte bør defineres som et kompleks af medicinske foranstaltninger, hvor patientens krop er i direkte kontakt med levedygtige celler af auto-, allo-, iso- eller xenogen oprindelse i en kort eller længere periode. Middelet til celletransplantation er en suspension af stamceller eller deres derivater, standardiseret efter antallet af transplantationsenheder. En transplantationsenhed er forholdet mellem antallet af kolonidannende enheder i kulturen og det samlede antal transplanterede celler. Metoder til celletransplantation: intravenøs, intraperitoneal, subkutan administration af en suspension af stamceller eller deres derivater; administration af en suspension af stamceller eller deres derivater i hjernens ventrikler, lymfekar eller cerebrospinalvæske.

Allo- og autolog celletransplantation anvender to fundamentalt forskellige metodologiske tilgange til implementering af stamcellers pluri-, multi- eller polypotente potentiale - in vivo eller in vitro. I det første tilfælde udføres introduktionen af stamceller i patientens krop uden deres forudgående differentiering, i det andet - efter reproduktion i kultur, målrettet differentiering og oprensning fra udifferentierede elementer. Blandt de mange metodologiske teknikker til erstatningscelleterapi skelnes der tydeligt mellem tre grupper af metoder: erstatning af knoglemarv og blodceller, erstatning af organ- og bløddelsceller, erstatning af stive og faste elementer i kroppen (brusk, knogle, sener, hjerteklapper og kapacitive kar). Sidstnævnte retning bør defineres som rekonstruktiv og regenerativ medicin, da stamcellers differentieringspotentiale realiseres på en matrix - en biologisk inert eller absorberbar struktur formet som det erstattede område af kroppen.

En anden måde at øge intensiteten af regenerativ-plastiske processer i beskadiget væv er at mobilisere patientens egne stamcellers ressourcer ved hjælp af eksogene vækstfaktorer, såsom granulocyt- og granulocyt-makrofag-kolonistimulerende faktorer. I dette tilfælde fører brud på stromale forbindelser til en øget frigivelse af hæmatopoietiske stamceller i den generelle blodbane, som i området med vævsskader på grund af deres iboende plasticitet sørger for regenereringsprocesser.

Metoderne inden for regenerativ medicin sigter således mod at stimulere processerne for genoprettelse af tabt funktion - enten ved mobilisering af patientens egne stamreserver eller ved at introducere allogent cellulært materiale.

Et vigtigt praktisk resultat af opdagelsen af embryonale stamceller er terapeutisk kloning baseret på forståelse af udløserne for embryogenese. Hvis det indledende signal for embryogenesens begyndelse er præ-mRNA-komplekset placeret i oocyttens cytoplasma, bør introduktionen af kernen fra en hvilken som helst somatisk celle i det enukleerede æg udløse embryoudviklingsprogrammet. I dag ved vi allerede, at omkring 15.000 gener deltager i implementeringen af embryogeneseprogrammet. Hvad sker der med dem senere, efter fødslen, i perioderne med vækst, modenhed og aldring? Svaret på dette spørgsmål blev givet af fåret Dolly: de er bevaret. Ved hjælp af de mest moderne forskningsmetoder er det blevet bevist, at kernerne i voksne celler bevarer alle de koder, der er nødvendige for dannelsen af embryonale stamceller, kimlag, organogenese og restriktionsmodning (udgang til differentiering og specialisering) af cellelinjer af mesenkymal, ekto-, endo- og mesodermal oprindelse. Terapeutisk kloning som retning blev dannet allerede i de tidligste stadier af udviklingen af celletransplantation og sørger for tilbagevenden af totipotens til patientens egne somatiske celler for at opnå genetisk identisk transplantationsmateriale.

Opdagelsen af stamceller begyndte "fra enden", da udtrykket, der blev introduceret i biologi og medicin af A. Maksimov, refererede til knoglemarvsstamceller, som giver anledning til alle modne cellulære elementer i perifert blod. Imidlertid har hæmatopoietiske stamceller, ligesom celler i alt væv i en voksen organisme, også deres egen, mindre differentierede forgænger. Den fælles kilde for absolut alle somatiske celler er den embryonale stamcelle. Det skal bemærkes, at begreberne "embryonale stamceller" og "embryonale stamceller" på ingen måde er identiske. Embryonale stamceller blev isoleret af J. Thomson fra blastocystens indre cellemasse og overført til langlivede cellelinjer. Kun disse celler har en faksimile af "ESC". Leroy Stevens, der opdagede embryonale stamceller i eksperimenter på mus, kaldte dem "embryonale pluripotente stamceller" med henvisning til ESC'ers evne til at differentiere til derivater af alle tre kimlag (ekto-, meso- og endoderm). Imidlertid er alle celler i embryoet på senere udviklingsstadier også stamceller, da de giver anledning til et stort antal celler, der danner en voksens krop. For at definere dem foreslår vi udtrykket "embryonale pluripotente progenitorceller".

[ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ]

Typer af stamceller

Den moderne klassificering af stamceller er baseret på princippet om deres opdeling efter deres evne (potens) til at give anledning til cellelinjer, hvilket defineres som toti-, pluri-, multi-, poly-, bi- og unipotens. Totipotens, det vil sige evnen til at genskabe en genetisk programmeret organisme som helhed, besiddes af zygoteceller, blastomerer og embryonale stamceller (celler i blastocystens indre masse). En anden gruppe af totipotente celler, som dannes i senere stadier af embryonal udvikling, er repræsenteret af primære germinalceller i den embryonale genitalzone (genital tuberkler). Pluripotens, som er evnen til at differentiere til celler i ethvert organ eller væv, er iboende i embryonale celler i de tre kimlag - ekto-, meso- og endoderm. Det menes, at multipotentitet, dvs. evnen til at danne celler inden for en specialiseret linje, kun er karakteristisk for to celletyper: de såkaldte mesenkymale stamceller, som dannes i neuralkammen og er forløbere for alle celler i kroppens bindevævsbase, inklusive neurogliaceller, samt hæmatopoietiske hæmatopoietiske stamceller, som giver anledning til alle blodcellelinjer. Derudover skelnes der mellem bi- og unipotente stamceller, især forløbercellerne for de myeloide, lymfoide, monocytiske og megakaryocytiske hæmatopoietiske spirer. Eksistensen af unipotente stamceller er blevet tydeligt bevist ved hjælp af eksemplet med leverceller - tabet af en betydelig del af levervævet kompenseres af den intensive deling af differentierede polyploide hepatocytter.

Under udviklingen dannes alle organer og væv som følge af proliferation og differentiering af blastocystens indre cellemasse, hvis celler i streng forstand er totipotente embryonale stamceller. Det første arbejde med isolering af embryonale stamceller blev udført af Evans, som viste, at blastocyster implanteret i musehjernen giver anledning til teratocarcinomer, hvis celler, når de klones, danner linjer af pluripotente embryonale stamceller (det oprindelige navn på disse celler - embryonale karcinomceller eller i forkortelsen ECС - bruges i øjeblikket ikke). Disse data blev bekræftet i en række andre undersøgelser, hvor embryonale stamceller blev opnået ved at dyrke blastocystceller fra mus og andre dyrearter, såvel som mennesker.

I de senere år har litteraturen i stigende grad rapporteret om stamcellers plasticitet, hvilket ikke kun betragtes som sidstnævntes evne til at differentiere til forskellige celletyper på forskellige udviklingsstadier, men også til at undergå dedifferentiering (transdifferentiering, retrodifferentiering). Det vil sige, at den grundlæggende mulighed for at bringe en somatisk differentieret celle tilbage til stadiet af embryonal udvikling med rekapitulering (tilbagevenden) af pluripotens og dens implementering i gentagen differentiering med dannelse af celler af en anden type anerkendes. Især rapporteres det, at hæmatopoietiske stamceller er i stand til transdifferentiering med dannelse af hepatocytter, kardiomyoblaster og endotelocytter.

Videnskabelige debatter om opdeling af stamceller i henhold til deres plasticitet fortsætter, det vil sige, at terminologien og ordlisten for celletransplantation er under dannelse, hvilket har direkte praktisk betydning, da de fleste metoder inden for regenerativ plastisk medicin er baseret på brugen af plastiske egenskaber og stamcellers evne til at differentiere til forskellige cellelinjer.

Antallet af publikationer inden for grundlæggende og anvendte problemer inden for regenerativ-plastisk medicin stiger hastigt. En række forskellige metodologiske tilgange, der sigter mod den mest optimale udnyttelse af stamcellers regenerativ-plastiske potentiale, er allerede blevet skitseret. Kardiologer og endokrinologer, neurologer og neurokirurger, transplantologer og hæmatologer har identificeret deres områder af presserende interesse. Øjenlæger, føtalogologer, pulmonologer, nefrologer, onkologer, genetikere, børnelæger, gastroenterologer, terapeuter og børnelæger, kirurger og obstetrikere-gynækologer leder efter en løsning på presserende problemer i stamcellers plastiske evner - alle repræsentanter for moderne medicin håber at få mulighed for at helbrede sygdomme, der tidligere blev betragtet som fatale.

Er celletransplantation den næste "universalmiddel"?

Dette spørgsmål opstår med rette hos alle tænksomme læger og videnskabsmænd, der analyserer den nuværende tilstand inden for lægevidenskaben. Situationen kompliceres af, at der på den ene side af den videnskabelige konfrontation står "raske konservative", på den anden side "syge fanatikere" inden for celletransplantation. Sandheden ligger naturligvis, som altid, imellem dem – i "ingenmandsland". Uden at berøre spørgsmålene om jura, etik, religion og moral, lad os overveje fordele og ulemper ved de udpegede områder inden for regenerativ-plastisk medicin. Den "lette brise" fra de første videnskabelige rapporter om de terapeutiske muligheder for embryonale stamceller (ESC'er) blev til en "vindvind" et år efter deres opdagelse, som i 2003 hvirvlede ind i en "informationstornado". Den første serie af publikationer omhandlede spørgsmålene om dyrkning af embryonale stamceller, deres reproduktion og målrettet differentiering in vitro.

Det viste sig, at det for ubegrænset reproduktion af embryonale stamceller i kultur er nødvendigt nøje at overholde en række betingelser. Tre faktorer skal være til stede i det konditionerede medium: interleukin-6 (IL-6), stamcellefaktor (SCF) og leukaseinhiberende faktor (LIF). Derudover skal embryonale stamceller dyrkes på et substrat (fødelag af celler) af embryonale fibroblaster og i nærvær af føtalt kalveserum. Hvis disse betingelser er opfyldt, vokser ESC'er i kultur som kloner og danner embryoide legemer - aggregater af suspensionskloner af sfæriske celler. Det vigtigste træk ved ESC-klonen er, at embryoidet i kultur stopper med at vokse, når 50-60, maksimalt 100 celler akkumuleres i aggregatet. I denne periode opstår en ligevægtstilstand - celledelingshastigheden inde i klonen er lig med hastigheden af apoptose (programmeret celledød) i dens periferi. Efter at have opnået en sådan dynamisk ligevægt, gennemgår de perifere celler i den embryoide krop spontan differentiering (normalt med dannelsen af endodermale fragmenter af blommesækken, angioblaster og endotelocytter) med tab af totipotens. For at opnå en tilstrækkelig mængde totipotent cellemasse skal den embryoide krop derfor opdeles ugentligt med transplantation af individuelle embryonale stamceller til et nyt næringsmedium - en ret arbejdskrævende proces.

Opdagelsen af embryonale stamceller besvarede ikke spørgsmålet om, præcis hvad og hvordan udløser de embryogeneseprogrammer, der er krypteret i zygotens DNA. Det er fortsat uklart, hvordan genomprogrammet udfolder sig i løbet af menneskelivet. Samtidig har studiet af embryonale stamceller gjort det muligt at udvikle et koncept for mekanismerne til at opretholde stamcellernes toti-, pluri- og multipotens under deres deling. Det vigtigste kendetegn ved en stamcelle er dens evne til at selvreproducere sig. Det betyder, at en stamcelle, i modsætning til en differentieret celle, deler sig asymmetrisk: en af dattercellerne giver anledning til en specialiseret cellelinje, og den anden bevarer genomets toti-, pluri- eller multipotens. Det forblev uklart, hvorfor og hvordan denne proces finder sted i de tidligste stadier af embryogenesen, når blastocystens delende indre cellemasse er fuldstændig totipotent, og ESC-genomet er i en sovende (sovende, hæmmet) tilstand. Hvis duplikeringsprocessen under delingen af en almindelig celle nødvendigvis forudgås af aktivering og ekspression af et helt kompleks af gener, så sker dette ikke under delingen af ESC. Svaret på spørgsmålet "hvorfor" blev opnået efter opdagelsen af præeksisterende mRNA (præ-mRNA) i ESC'er, hvoraf nogle dannes i follikulære celler og opbevares i cytoplasmaet i ægget og zygoten. Den anden opdagelse besvarede spørgsmålet "hvordan": specielle enzymer kaldet "editaser" blev fundet i ESC'er. Editaser udfører tre vigtige funktioner. For det første giver de alternativ epigenetisk (uden deltagelse af genomet) aflæsning og duplikering af præ-mRNA. For det andet implementerer de processen med præ-mRNA-aktivering (splejsning - udskæring af introner, dvs. inaktive sektioner af RNA, der hæmmer processen med proteinsyntese på mRNA), hvorefter samlingen af proteinmolekyler begynder i cellen. For det tredje fremmer editaser dannelsen af sekundære mRNA'er, som er repressorer af genekspressionsmekanismer, hvilket opretholder den tætte pakning af kromatin og genernes inaktive tilstand. Proteinprodukter syntetiseret på sådanne sekundære mRNA'er og kaldet silencerproteiner eller genomvogtere er til stede i humane ægceller.

Sådan præsenteres mekanismen for dannelsen af udødelige cellelinjer af embryonale stamceller i dag. Kort sagt kommer signalet til at starte embryogeneseprogrammet, hvis indledende stadier består af dannelsen af totipotent cellemasse, fra æggets cytoplasma. Hvis blastocystens indre cellemasse, dvs. ESC, på dette stadie isoleres fra yderligere regulatoriske signaler, foregår processen med cellernes selvreproduktion i en lukket cyklus uden deltagelse af cellekernens gener (epigenetisk). Hvis en sådan celle forsynes med næringsmateriale og isoleres fra eksterne signaler, der fremmer differentiering af cellemassen, vil den dele sig og reproducere sin egen art på ubestemt tid.

De første resultater af eksperimentelle forsøg på at bruge totipotente celler til transplantation var ret imponerende: introduktionen af embryonale stamceller i vævet hos mus med et immunforsvar svækket af immunsuppressive midler førte til udvikling af tumorer i 100% af tilfældene. Blandt cellerne i neoplasmen, hvis kilde var ESC'er, var der differentierede derivater af det totipotente eksogene cellulære materiale, især neuroner, men væksten af teratocarcinomer reducerede værdien af de opnåede resultater til ingenting. Samtidig dannede ESC'er introduceret i bughulen i L. Stevens' værker store aggregater, hvor embryonale muskler, hjerte, hår, hud, knogler, muskler og nervevæv blev dannet fragmenteret. (Kirurger, der åbnede dermoidcyster, bør være bekendt med dette billede). Interessant nok opfører suspenderede museembryoblastceller sig på præcis samme måde: deres introduktion i vævet hos voksne immunkompromitterede dyr forårsager altid dannelsen af teratocarcinomer. Men hvis en ren linje af ESC'er isoleres fra en sådan tumor og introduceres i bughulen, dannes der igen specialiserede somatiske derivater af alle tre kimlag uden tegn på kræftudvikling.

Det næste problem, der skulle løses, var således at rense cellematerialet fra urenheder fra udifferentierede celler. Men selv med en meget høj effektivitet af målrettet celledifferentiering bevarer op til 20% af cellerne i kulturen deres totipotente potentiale, hvilket in vivo desværre realiseres i tumorvækst. Endnu et "slangebøsse" af naturen - på skalaen af medicinsk risiko balancerer garantien for patientens helbredelse med garantien for hans død.

Forholdet mellem tumorceller og embryonale pluripotente progenitorceller (EPPC'er), som er mere udviklede end ESC'er, er ret tvetydigt. Resultaterne af vores studier har vist, at introduktion af EPPC'er i forskellige transplanterbare tumorer hos rotter kan føre til opløsning af tumorvæv (G), en hurtig stigning i tumormasse (D), dens reduktion (E-3) eller ikke påvirker størrelsen af spontan central fokal nekrose af neoplastisk væv (I, K). Det er indlysende, at resultatet af interaktionen mellem EPPC'er og tumorceller bestemmes af det samlede sæt af cytokiner og vækstfaktorer, som de producerer in vivo.

Det er bemærkelsesværdigt, at embryonale stamceller, der reagerer med kræftfremkaldende processer på kontakt med voksent væv, assimileres perfekt med embryonets cellemasse og integreres i alle embryonets organer. Sådanne kimærer, der består af embryonets egne celler og donor-ESC'er, kaldes allofene dyr, selvom de faktisk ikke er fænotypiske kimærer. Det hæmatopoietiske system, hud, nervevæv, lever og tyndtarm undergår maksimal cellulær kimærisering, når ESC'er introduceres i et tidligt embryon. Tilfælde af kimærisering af kønsorganerne er blevet beskrevet. Den eneste zone, der er ukrænkelig for ESC'er, er primære kønsceller.

Det vil sige, at embryoet bevarer sine forældres genetiske information, hvilket beskytter renheden og fortsættelsen af både slægten og arten.

Under betingelser med blokering af celledeling i det tidlige embryo ved hjælp af cytoclazin fører introduktionen af embryonale stamceller i blastocysten til udviklingen af et embryo, hvis primære kønsceller, ligesom alle andre, blev dannet fra donorembryonale stamceller. Men i dette tilfælde er selve embryoet fuldstændig donor, genetisk fremmed for rugemorens krop. Mekanismerne bag en sådan naturlig blokering af potentialet for at blande ens egen og fremmed arvelig information er endnu ikke afklaret. Det kan antages, at apoptoseprogrammet i dette tilfælde realiseres, hvis determinanter endnu ikke er kendte for os.

Det skal bemærkes, at embryogenesen hos dyr af forskellige arter aldrig koordineres: Når donorprogrammet for organogenese implementeres i modtagerembryoets krop af xenogene embryonale stamceller, dør embryoet i livmoderen og resorberes. Derfor bør eksistensen af kimærer som "rotte-mus", "gris-ko", "menneske-rotte" forstås som cellulær, men ikke morfologisk mosaik. Med andre ord, når ESC'er fra en pattedyrart introduceres i blastocysten hos en anden art, udvikles der altid afkom af moderarten, hvori der blandt deres egne celler fra næsten alle organer findes inklusioner, og nogle gange klynger af strukturelle og funktionelle enheder bestående af genetisk fremmed materiale af ESC-derivater. Udtrykket "humaniseret gris" kan ikke opfattes som en betegnelse for en slags monster udstyret med intelligens eller ydre egenskaber hos et menneske. Dette er blot et dyr, hvis en del af kroppens celler stammer fra menneskelige ESC'er introduceret i blastocysten hos en gris.

Udsigter for brugen af stamceller

Det har længe været kendt, at sygdomme forbundet med genotatologi af hæmatopoietiske og lymfoide celler ofte elimineres efter allogen knoglemarvstransplantation. Udskiftning af eget hæmatopoietisk væv med genetisk normale celler fra en beslægtet donor fører til delvis og undertiden fuldstændig helbredelse af patienten. Blandt de genetiske sygdomme, der behandles med allogen knoglemarvstransplantation, er det værd at bemærke kombineret immundefektsyndrom, X-bundet agammaglobulinæmi, kronisk granulomatose, Wiskott-Aldrich syndrom, Gauchers og Hurlers sygdomme, adrenoleukodystrofi, metakromatisk leukodystrofi, seglcelleanæmi, thalassæmi, Fanconis anæmi og AIDS. Hovedproblemet ved brugen af allogen knoglemarvstransplantation i behandlingen af disse sygdomme er forbundet med udvælgelsen af en HbA1c-kompatibel beslægtet donor, for hvilken en vellykket søgning er nødvendig i gennemsnit 100.000 prøver af typebestemt donor hæmatopoietisk væv.

Genterapi muliggør korrigering af en genetisk defekt direkte i patientens hæmatopoietiske stamceller. Teoretisk set giver genterapi de samme fordele i behandlingen af genetiske sygdomme i det hæmatopoietiske system som allogen knoglemarvstransplantation, men uden alle de mulige immunologiske komplikationer. Dette kræver dog en teknik, der muliggør effektiv overførsel af et fuldgyldigt gen til hæmatopoietiske stamceller og opretholdelse af det nødvendige niveau af dets ekspression, hvilket i visse typer arvelig patologi muligvis ikke er særlig højt. I dette tilfælde giver selv en lille genopfyldning af proteinproduktet fra det defekte gen en positiv klinisk effekt. Især ved hæmofili B er 10-20% af det normale niveau af faktor IX helt tilstrækkeligt til at genoprette den interne mekanisme for blodstørkning. Genetisk modifikation af autologt cellemateriale har vist sig at være succesfuld i eksperimentel hemiparkinsonisme (ensidig destruktion af dopaminerge neuroner). Transfektion af rotteembryonale fibroblaster med en retroviral vektor indeholdende tyrosinhydroxylase-genet sikrede syntesen af dopamin i centralnervesystemet: intracerebral administration af transficerede fibroblaster reducerede kraftigt intensiteten af kliniske manifestationer af en eksperimentel model af Parkinsons sygdom hos forsøgsdyr.

Udsigten til at bruge stamceller til genterapi af menneskelige sygdomme har skabt mange nye udfordringer for klinikere og forsøgspersoner. De problematiske aspekter ved genterapi er forbundet med udviklingen af et sikkert og effektivt system til gentransport ind i målcellen. I øjeblikket er effektiviteten af genoverførsel til store pattedyrceller meget lav (1%). Metodisk løses dette problem på forskellige måder. In vitro-genoverførsel involverer transfektion af genetisk materiale ind i patientens celler i kultur med efterfølgende tilbagevenden til patientens krop. Denne tilgang bør anerkendes som optimal, når man bruger gener introduceret i knoglemarvsstamceller, da metoderne til at overføre hæmatopoietiske celler fra kroppen til kultur og tilbage er veletablerede. Retrovirus anvendes oftest til genoverførsel til hæmatopoietiske celler in vitro. Imidlertid er størstedelen af hæmatopoietiske stamceller i en sovende tilstand, hvilket komplicerer transporten af genetisk information ved hjælp af retrovirus og kræver en søgning efter nye måder til effektiv gentransport ind i sovende stamceller. I øjeblikket anvendes genoverførselsmetoder såsom transfektion, direkte mikroinjektion af DNA i celler, lipofektion, elektroporation, "genpistol", mekanisk kobling ved hjælp af glasperler, transfektion af hepatocytter med receptorafhængig DNA-kobling til asialoglykoprotein og aerosolindføring af transgenet i cellerne i lungernes alveolære epitel. Effektiviteten af DNA-overførsel ved disse metoder er 10,0-0,01%. Med andre ord, afhængigt af metoden til introduktion af genetisk information, kan man forvente succes hos 10 patienter ud af 100 eller hos 1 patient ud af 10.000 patienter. Det er indlysende, at en effektiv og samtidig sikker metode til overførsel af terapeutiske gener endnu ikke er udviklet.

En fundamentalt anderledes løsning på problemet med afstødning af allogent cellemateriale i celletransplantation er brugen af høje doser af embryonale pluripotente progenitorceller for at opnå effekten af at geninstallere antigenhomeostase-kontrolsystemet i en voksen organisme (Kukharchuk-Radchenko-Sirman-effekten), hvis essens ligger i induktionen af immunologisk tolerance ved at skabe en ny base af immunkompetente celler med samtidig omprogrammering af antigenhomeostase-kontrolsystemet. Efter introduktion af høje doser af EPPC fikseres sidstnævnte i vævene i thymus og knoglemarv. I thymus differentierer EPPC, under påvirkning af et specifikt mikromiljø, til dendritiske, interdigitate celler og epitel-stromale elementer. Under differentieringen af EPPC'er i recipientens thymus, sammen med recipientens egne molekyler fra det store histokompatibilitetskompleks (MHC), udtrykkes MHC-molekyler, der er genetisk bestemte i donorceller, det vil sige, at der etableres en dobbeltstandard af MHC-molekyler, ifølge hvilken positiv og negativ selektion af T-lymfocytter realiseres.

Således sker fornyelsen af effektorforbindelsen i modtagerens immunsystem gennem de kendte mekanismer for positiv og negativ selektion af T-lymfocytter, men gennem dobbeltstandarden af MHC-molekyler - modtager- og donor-EPPC'erne.

Omprogrammering af immunsystemet ved hjælp af EPPC muliggør ikke kun celletransplantation uden efterfølgende langvarig brug af immunsuppressive midler, men åbner også helt nye perspektiver i behandlingen af autoimmune sygdomme og giver fodfæste for udviklingen af nye ideer om den menneskelige aldringsproces. For at forstå aldringsmekanismerne har vi foreslået en teori om udtømning af kroppens stamceller. Ifølge hovedbestemmelsen i denne teori er aldring en permanent reduktion i størrelsen af kroppens stamceller, hvilket forstås som en pulje af regionale ("voksne") stamceller (mesenkymale, neuronale, hæmatopoietiske stamceller, progenitorceller i huden, fordøjelseskanalen, det endokrine epitel, pigmentceller i ciliære folder osv.), der genopfylder de cellulære tab af det tilsvarende væv i processen med kropsombygning. Kropsombygning er fornyelsen af den cellulære sammensætning af alle væv og organer på grund af stamceller, som fortsætter gennem hele en flercellet organismes levetid. Antallet af celler i stamcellerne bestemmes genetisk, hvilket bestemmer den begrænsede størrelse (proliferativt potentiale) af hvert stamcellerum. Størrelsen af stamcellerne bestemmer til gengæld aldringshastigheden for individuelle organer, væv og kropssystemer. Efter udtømningen af stamcellernes cellulære reserver bestemmes intensiteten og aldringshastigheden for en flercellet organisme af aldringsmekanismerne for somatiske differentierede celler inden for Hayflick-grænsen.

Derfor kan udvidelsen af stamcellerne i den postnatale ontogenese ikke blot øge levetiden betydeligt, men også forbedre livskvaliteten ved at genoprette kroppens remodelleringspotentiale. Udvidelsen af stamcellerne kan opnås ved at introducere store doser af allogene embryonale pluripotente progenitorceller, forudsat at recipientens immunsystem samtidig omprogrammeres, hvilket øger levetiden for gamle mus i eksperimentet betydeligt.

Teorien om udtømning af stamceller kan ændre de eksisterende ideer ikke kun om aldringsmekanismerne, men også om sygdommen, såvel som konsekvenserne af dens lægemiddelinducerede behandling. Især kan sygdommen udvikle sig som følge af patologi i stamceller (onkopatologi). Udtømning af den mesenkymale stamcellereserve forstyrrer processerne for bindevævsombygning, hvilket fører til forekomsten af ydre tegn på aldring (rynker, slap hud, cellulite). Udtømning af stamcellereserven i endotelceller forårsager udvikling af arteriel hypertension og åreforkalkning. Den initialt lille størrelse af thymus-stamrummet bestemmer dets tidlige permanente aldersrelaterede involution. For tidlig aldring er en konsekvens af det indledende patologiske fald i størrelsen af alle kroppens stamcellerum. Lægemiddel- og ikke-lægemiddelstimulering af stamcellereserver forbedrer livskvaliteten ved at reducere dets varighed, da det reducerer størrelsen af stamcellerummene. Den lave effektivitet af moderne geroprotektorer skyldes deres beskyttende effekt på aldrende differentierede somatiske celler og ikke på kroppens stamcellerum.

Afslutningsvis vil vi gerne endnu en gang bemærke, at regenerativ-plastisk medicin er en ny retning i behandlingen af menneskelige sygdomme baseret på brugen af stamcellers regenerativ-plastiske potentiale. I dette tilfælde forstås plasticitet som eksogene eller endogene stamcellers evne til at blive implanteret og give anledning til nye specialiserede cellespirer i beskadigede vævsområder i en syg organisme. Formålet med regenerativ-plastisk medicin er dødelige menneskelige sygdomme, der i øjeblikket er uhelbredelige, arvelig patologi, sygdomme, hvor traditionelle medicinske metoder kun opnår en symptomatisk effekt, samt anatomiske defekter i kroppen, hvis genoprettelse er målet med rekonstruktiv-plastisk regenerativ kirurgi. Efter vores mening er det for tidligt at betragte de første forsøg på at genskabe hele og funktionelt komplette organer fra stamceller som et separat område inden for praktisk medicin. Emnet for regenerativ-plastisk medicin er stamceller, som, afhængigt af deres modtagelseskilde, har forskelligt regenerativt-plastisk potentiale. Metoden for regenerativ plastisk medicin er baseret på transplantation af stamceller eller deres derivater.