Embryonale stamceller

Opdagelsen af embryonale stamceller - der var ingen ulykke, og optrådt på den forberedte jord forskning på området for udviklingsmæssige biologi forskning. Udtrykket "stamcelle" blev indført i medicin i 1908 ved Society of Hematology Congress i Berlin, Alexander Maximov anvendt på hæmatopoietiske celler. Længe før isoleringen og fremstillingen af stabile linjer af pluripotente embryonale stamceller i den tidlige udvikling af forskningsprocessen anvendte stamceller terato- (embryo-carcinomceller, som studerede de ukendte mekanismer embryogenese, herunder en sekvens af ekspressionen af tidlige gener og proteinholdige produkter af deres arbejde.

Men er totipotency af det menneskelige genom uopretteligt tabt i evolutionens proces? Nej, og embryogenese er bevis. Hvis dette er tilfældet, så når i princippet den anden vej for evolutionær udvikling vil blive realiseret? Sandsynligvis, når en person forlader kosmos, hvor miljøforholdene vil være relativt konstante i temmelig lang tid. Knogletab (knogledemineralisering i vægtløs tilstand) meget langsomt medgørlige remodellering og regenerering kan betragtes som det første skridt til human tilpasningsproces som en art af eksistens i rummet. Betalingen til den anden udviklingsveje vil dog være anderledes - sterilitet vil være prisen at betale tilbage til alle celler af totipotency og absolut plasticitet. Så mange gange i denne verden af "evolutionære kameleoner" vil ikke have nogen meiosis, otpochkovaniem. Men vi vil leve længe. Telomerase udødelighed er udødeligheden af amoeba. I en multicellulær organisme er stamceller substratet for kvantitativ og kvalitativ levetid.

[1], [2], [3], [4]

Kilder til embryonale stamceller

Dag kilder til embryonale stamceller til laboratorietest er Linje murine teratocarcinom (129 / sv, F19, F8, Zin 40, CGR 86, Rl, CCE, JM-1, E14TG2a, CGRSb) og human teratocarcinom (NTERA-2, TERA-2 , H-9 klon), såvel som linjerne af ESC Trauneone. Imidlertid er tilstedeværelsen detaljeret cellulære pas indikerer immun fænotype, kromosom Analyseresultaterne for mRNA ekspressionsprofiler eksponerede receptorer og protein intracellulær signalering ikke kompensere for betydelige ulemper teratokartsinomnyh linjer ESC - hurtigt tab af totipotens og umulighed for anvendelse i de kliniske forsøg, og blandet differentiering i kultur er meget vanskeligt at isolere ren specialiseret linje fra en heterogen population af celler. Derfor normalt en kilde ESC linier fremstilles til kliniske formål, tjener som den indre cellemasse af blastocysten, embryoner individuelle blastomerer af 8-celle udviklingstrin, celler morula senere stadier, og primære kim celle.

Det skal bemærkes, at teratocarcinomceller, selv om de har pluripotens egenskab, har et signifikant lavere pluripotent potential i forhold til ESC. Deres integration med embryonale celler fører sjældent til dannelsen af kimærer, hvorimod der aldrig dannes gameter med en genotype af teratocarcinomceller. Det antages, at dette skyldes det hyppige udseende af kromosomale abnormiteter ved dyrkning af teratocarcinceller: tab af y-kromosomet, forskellige trisomier, deletioner eller translokationer.

Forsøg på at skelne den menneskelige ESC-linje er blevet foretaget mange gange, men denne opgave kunne ikke løses, da normale humane blastocyster er vanskelige at få adgang til objekter. Hos mennesker er hyppigheden af kromosomale abnormiteter desuden højere end i dyrs embryogenese. Det overvejende flertal af tidlige humane embryoner opnået efter in vitro befrugtning udviser kaotisk kromosomal mosaikisme, og ofte er der numeriske og strukturelle aberrationer. Endnu mere, i blastocyststadiet består kun 20-25% af humane embryoner af celler med en normal karyotype. Det var næsten umuligt at bruge sådanne embryoner til at skabe et ESC, da zygoter sædvanligvis blev dyrket til stadierne af to eller fire blastomerer og derefter transplanteret i livmoderen. Kun relativt nylig var en pålidelig teknik udviklet til dyrkning af befrugtede humle ægsler til blastocystfasen. Indførelsen af denne teknik i praksis med in vitro befrugtning øgede ikke kun hyppigheden af et vellykket implantationsresultat, men gjorde også normale blastocyster en mere tilgængelig genstand.

En anden pluripotente stamceller kilde er de primære kønsceller, som i modsætning til de mere avancerede progenitorpopulationer germenativnogo epitel, kan ikke på overfladen af beta-integrin, men udtrykker høj aktivitet shelochnoy phosphatase. Det skal bemærkes, at i forsøget er stamcellerne, der er dannet fra primære kønsceller, blevet undersøgt siden 80'erne i det sidste århundrede. Samtidig blev der udviklet en teknik til isolering af primære kønsceller fra rudimentet af museembryongonaden. De første mislykkede resultater af dyrkning af primordiale kønsceller in vitro tyder det nytteløse i disse bestræbelser, som cellerne, men overlevede, men ikke formere sig og døde inden for den første dag. Senere blev det fundet, at primære murine kønsceller prolifererer in vitro i nærværelse af kun i dyrkningsmediet af opløselige og membranbundne specifik polypeptid vækstfaktorer. Talrige studier har indikeret, at det er nødvendigt tilstedeværelsen i dyrkningsmediet ikke kun LIF, men membrannosvyazannyh og Steel-opløselig faktor (SIF) for overlevelse og proliferation af primordiale kønsceller. Disse peptider fremstilles ved somatiske celle embryoer homozygote for mutationen af stål, og en af dem er en ligand af protoonkogenet ckit.

Primære kimceller af pattedyr og mennesker har ekstragonadal oprindelse og er kilden til den klonale udvikling af kønscellelinjen. Startlinien primordiale kønsceller samt alle væv i embryoet og ekstraembryone mesoderm giver epiblastcelle (primær ektoderm) tidlige embryoner med mosaik strukturelle organisering. Den mikrokirurgiske fjernelse af forskellige dele af det tidlige embryo etablerede en lokaliseringszone i epiblastet af en klon af engagerede forstadier til primære kimceller. Ved hjælp af rhodamin dextran, som blev anvendt som celle markør, blev det etableret, at forstadierne af de primære seksuelle celler er placeret i den proximale epiblast-region ved siden af den ekstra-embryonale ektoderm. Den primære seksuelle cellelinie kommer frem fra 45-celle klonen, hvis tildeling sker i begyndelsen af gastruleringen. Derefter forekommer klonsegregationen, og under gastrulation indtræder de primære kønceller det ekstraembryoniske mesoderm og findes i bunden af allantoisknoppen bag det primære bånd. Derefter migrerer de primære bakterieceller mod den ventrale ende af endocervix endodermen og bevæges derefter aktivt langs mesenteriet, idet de køber kønsrullerne ved afslutningen af migrationen. Under migrationsprocessen, såvel som i de første 2-3 dage efter lokalisering i gonadrudimentet, prolifererer de primære seksuelle celler aktivt og gennemgår otte replikative cyklusser. Hvis der i begyndelsen af migrationen er omkring 50 primære kønsceller, i reproduktionscysterne af museembryoner i en 12-dages udvikling, overstiger antallet af primære kønsceller 25.000.

Af den funktionelle lighed af økonomiske og sociale råd og primordiale kønsceller demonstrerer fuld integration af sidstnævnte i udskiftning blastocyst indre cellemasse og efterfølgende fuld udvikling af embryoet, væv, der kun består af efterkommere primordiale kønsceller. Ifølge andre karakteristika murine primære kimceller PGC'er var også identiske, hvilket viser evnen til at differentiere til forskellige retninger, til dannelse af embryoide legemer in vitro, en in vivo danner teratomer når injiceret subkutant i immundefekte mus ligner spontane teratomer testis mus linie 129 / ter.

Det blev fundet, at når LIF, membranbundet og opløseligt SIF tilsættes til de isolerede primære kønsceller, overlever og 8 dage gamle musembryoner i kultur i 4 dage, men dør derefter. Herudover bør den periode, når kulturen dødens observeret primordiale kønsceller falder sammen med udviklingsstadium musefostre (12,5-13,5 dage), når knopperne primære gonadale kvindelige kimceller træder meiose, og i de mandlige primordiale kønsceller blokeres mitotiske division. Men hvis du føjer til miljøet ikke kun vækstfaktorer LIF og SIF, men også af FGF2, de primære kønsceller fortsætte proliferirovat, og subkulturer dannes celle kolonier kan gengive selv efter at være fjernet fra miljøet af vækstfaktorer (SIF og FGF). Sådanne celler kan dyrkes i lang tid på det embryonale fibroblastsubstrat uden tilsætning af opløselig vækstfaktor LIF. Det er disse stabile cellelinier afledt af primære bakterieceller, der blev foreslået at blive kaldt embryonale bakterieceller. Dette udtryk kan ikke betragtes som vellykket, da det er umuligt at fremstille embryonale kimceller, når EG-celler dyrkes, hvilket kan udføre efterfølgende stadier af oogenese eller spermatogenese. Dette skyldes det faktum, at EG-cellelinjer, skønt afledt fra primordiale kønsceller, men i kulturen for at erhverve egenskaberne af embryonale pluripotente stamceller mister deres evne til at begå germenativnye linje. Med andre ord mister primære sexceller egenskaberne af gametets forstadier ved dyrkning og omdannes til ESC-lignende pluripotente celler.

Det bemærkes, at når immundefekt EG-mus administreres, opstår der ikke teratomer. Det antages, at tabet af humane EG-cellers evne til at initiere teratomer skyldes det faktum, at disse linjer ikke blev dannet direkte fra dyrkede primære bakterieceller, men blev opnået fra celler isoleret fra embryoidkroppe. Derfor er det muligt, at de er efterkommere af pluripotente, men allerede begåede celler.

Det skal bemærkes, at der er grundlæggende forskelle mellem EG-celler og primære bakterieceller. Sidstnævnte gør det ikke muligt at opnå kimære musembryoer, hvilket indikerer manglen på evne til primære kimceller til at integrere i den interne cellemasse eller trophektoderm. Karakteristika for populationen af primære sexceller ligner mere på de begavede linjer af somatiske celler af senere embryoner, hvis indføring i blastocysten fører heller ikke til dannelsen af kimære embryoner.

Modifikation dyrkning af embryoide legemer opnået med EG-aggregering af celler tilladt ved selektion på selektive medier for at modtage en anden population af pluripotente celler, kaldes "celler afledt fra embryoide legemer (embryoid body afledte celler - EBD-celler). EBD-cellers evne til at formere sig i lang tid i kulturen tillod at skabe stabile cellelinier af engagerede celler. Kloner af celler, der udtrykker et bredt spektrum af mRNA og proteinmarkører af specialiserede celler blev opnået. Denne fremgangsmåde som et resultat vist, at de primære sex humane pluripotente celler, og differentiere in vitro i forskellige celletyper: neuroner, glia, vaskulært endotel, hæmatopoietiske celler, muskel og endodermale celler.

Alternative kilder til embryonale stamceller

Alternativ kilde til humane ESC-linjer kan være hybridceller. Implantation i livmoderen af pseudogravide køer geterogenomnoy struktur opnået ved fletning via elektroporation fetusa humane somatiske celler med æg køer, som tidligere var blevet fjernet fra pronukleus, gør det muligt at modtage den indre cellemasse af præ-implantation embryo kunstige udviklingsstadier. Til dette opnås blastocysten fra koens æg med den transplanterede kerne i den humane celle i den første fase.

I anden fase ekstraheres embryoblastet fra blastocysten og fra det - ESC ifølge Thomson-metoden. Det er bemærkelsesværdigt, at de bedste resultater i separations- ESC linjer af denne metode blev opnået ved anvendelse af kerner af follikelceller eller primordiale kønsceller der fortsat findes i den menneskelige krop i en tilstand af dvale. Dette skyldes det faktum, at en ko æg transplanterede humane celler kerne neukorochennye bør have høj aktivitet og telomer telomeazy der undgår for tidlig aldring ESC-kloner, der stammer fra hybrid æg (Repin, 2001). Det er kendt, at de vigtigste intracellulære markør EGF proteiner er Oct3, Oct4, Tcf, Groucho, som tilhører de såkaldte chromatin-lyddæmperproteiner. Silencers giver særlig kompakt pakning af heterochromatin, som forhindrer dannelsen af lukninger af euchromatin. Kromatinpakningen medieret af disse proteiner korrelerer med totipotency af ESC-genomet. Hidtil er det blevet fastslået, at modne ægfrugter af kvæg og mennesker er den eneste type specialiserede celler, der indeholder høje koncentrationer af lyddæmperproteiner i cytoplasmaet. På denne baggrund blev der udviklet en metode til produktion af hybrid-ESC'er ved at overføre somatiske cellekerner til ikke-nukleare ægløsninger af køer. Preliminære in vitro-undersøgelser har vist at cytoplasmaet hos ægcellerne hos køer genopretter totipotency af det humane somatiske cellekernegenom på 12-24 timers dyrkning.

Af særlig interesse er data om træk ved præimplantationsudvikling af humane embryoner, hvilket indikerer en senere udskiftning af totipotente celler af en population af pluripotente celler end hos mus. Undersøgelsen af celletransformationer viste, at celler fra den interne cellemasse af den humane blastocyst, udover ESC'er, også genererer trofoblastceller, hvilket indikerer deres samlede styrke.

Det er kendt, at der i blastocystens stadium er der to forskelligartede cellepopulationer. En af dem er det ydre lag af blastocystet, trofektoderm, der er afledt af trofoblastceller og andre embryonale placenta komponenter. Den anden population af celler er grupperet i en tæt masse, der kommer i kontakt med trophektodermens indre overflade. Cellepopulationen af den indre cellemasse er afledt af alle væv og bakterier i embryoorganerne. På scenen af den sen blastocyst dannes et ekstra-embryonalt endoderm ud fra den interne celle masse, og der dannes en epiblast (den primære ektoderm). Samtidig opretholder epiblastceller pluripotens, mens muligheden for at differentiere celler i det ekstrakiminale endoderm er begrænset.

[5], [6], [7], [8], [9], [10], [11]

Indhentning af menneskelige embryonale stamceller

Indtil for nylig blev det antaget, at det var umuligt at opnå et ESC fra trophoblast. Dog diploide linje trophectoderm stamceller isoleret fra blastocyst i et medium, som indeholder, i stedet for LIF og FGF2 heparin, prolifererer og transformeres til stamceller. Hvis du fjerner fra midt i FGF2, de trophectoderm cellerne stopper avl, begynder de endoreduplikation af kromosomer og cellulære elementer trofektodermalnye efterhånden forvandlet til en kæmpe trofoblastceller. Sandsynligvis, er LIF ikke stimulere proliferation af trophectoderm celler på grund af det faktum, at FGF2 udløser en mekanisme transsignalizatsii som FGF2, binding til cytoplasmatisk receptor (FGFR2), aktiverer MAP-kinase i cytoplasmaet - ERK1 og ERK2. Følgelig ved inkorporering i cellerne af blastocyst af en signalvej (LIF - gpl30 - JAK-kinase - STAT3) indre cellemasse celler transformeres ind pluripotente hESCs, mens aktivering af anden mekanisme af transmembransignallering (FGF2 - FGFR2 - MAP kinaser ERK1 / ERK2) I blastocysten dannes stamceller fra trophektodermen. Valget af signalvejen afhænger igen af aktiviteten af oct4-genet. Dette gen, der tilhører POU-domæne, som ligger i locuset t 17 autosomer og udtrykkes under oogenesen knuse periode samt i celler af den indre cellemasse af blastocysten, og i primordiale kønsceller. Funktionel rolle Oct4 genet koder for en transkriptionsfaktor nødvendig for forekomsten af pluripotente celler, deres differentiering og dedifferentiering.

Udtrykket af oct4-genet i ESC varierer afhængigt af interaktionen af denne transkriptionsfaktor med cofaktorerne. En retningsbestemt regulering af oct4-ekspression i blastocyster viste, at når dets aktivitet falder, danner halvdelen af cellerne en trophektoderm, medens der med en stigning i induceret ekspression af oct4 forekommer overvejende ESC.

I eksperimentet kan ESC ikke omdannes til en linje, når man dyrker totipotente blastomerer på knusningsstadiet, såvel som i stadiet af gastrulering og senere stadier af embryonisk udvikling. Muse ØSR sædvanligvis afsætte 3,5-4,5 dage drægtighed, hvilket svarer til den sjette (enkelt lag af blastocyst) og syvende etape (to-lags af blastocyst - en tidlig æg cylinder) normal embryogenese. Det er klart, at musens embryoner kun indebærer cellepopulationer, der kan omdannes til ESC, kun i preimplantationsperioden. Følgelig er isoleringen af ESC-linier kun mulig i visse faser af embryogenese. Totitipotent, ud fra muligheden for at udvikle et levedygtigt embryo med embryonale membraner og placenta, er zygot og de blastomerer, der opstår under knusning. Tabet af den samlede styrke af de germinale celler begynder i det sene morula stadium, når yderligere blastomere comminution afhænger af deres placering. Tidlige Morula blaetomere bevarer totipotency, fordi eksperimentelle manipulationer med ændringer i deres placering, fx inversion af deres placering, forhindrer ikke udviklingen af et fuldt embryo.

Det blev konstateret, at effektiviteten af frigivelsen af ESC i linjen påvirkes af blastocysternes tilstand på tidspunktet for deres eksplantering. Anvendelsen af blastocyster efter en syv-dages simulering af diapause i kønsvejene af mus, ovariektomerede ved 3,5 dages drægtighed og behandlet med progesteron, bidrager til en mere vellykket adskillelse af linjer af embryonale stamceller. Det antages, at antallet af blastomerer der danner den indre cellemasse under sådanne betingelser stiger. Det er også muligt, at cellecyklussen strækker sig, og de fleste blastomerer går ind i G0-fasen.

Desuden skabelse af stabile pluripotente hESC linjer afhænger af genotype embryoner: ganske let skelnes fra økonomiske og sociale råd Murine blastocyster linje 129, er betydeligt vanskeligere at opnå dem under anvendelse af mus CS7BL / 6 og næsten umuligt at isolere linje fra hESCs blastocyster CBA / Ca-mus. Selvfølgelig har tidlige embryoner nogle genetiske egenskaber, der påvirker udviklingen af den pluripotente ESC-linje. Men når de dyrkes epiblastcelle isolerede, såvel som ved selektiv udvælgelse differentierende hESCs cellelinie fra tidlige embryoner var stadig tildelt, CBA / Ca-mus.

En gennemprøvet standardteknik til opnåelse af ESK-linjer fra blastocyster er givet i laboratoriemanualer om eksperimentet med tidlige embryoner. Eksperimentelle ESK-linier kan også opnås ved dyrkning af en isoleret epiblast (primær ektoderm) af 4,5-dages museembryoner med en ret kompleks mikrokirurgisk teknik og modificerede dyrkningsbetingelser. Kompleksiteten af denne procedure er berettiget, da hyppigheden af dannelse af ESC-linjer var meget højere end i arbejde med blastocystens interne cellemasse.

For at isolere ESC-linjerne, overføres hver klon til en mikrobrønd, et aggregat på 40-60 celler dyrkes, det bliver igen dispergeret. Multiple gentagelser af denne procedure muligt at opnå udødeliggjort ESK linje med maksimal proliferation rate normokariotipnyh celler fastgjort til plasten, som gennem passager 50-100 fastholde totipotens og høj telomeraseaktivitet. I processen med at støtte linjer Esc den største fare er forureningen eller serum bakterielle endotoksiner - selv spor af koncentrationen endotoksin i dyrkningsmediet forårsaget massedød af umodne kimceller. Med omhyggelig kontrol af lineær vækst og rettidig dispersion sådanne organer i kultur er i stand til symmetrisk fission, hvor begge datterceller forbliver pluripotent og i stand til at udføre et ubegrænset antal celle-cyklus'er, at opretholde en diploid karyotype og den totale potens.

Udvælgelse af en ren population af humane ESC'er kan udføres efter transfektion i deres genom af rekombinante DNA-molekyler indeholdende et gen, som koder for syntesen af et grønt fluorescerende protein (GFP). GFP-ekspression øges med vækst af ESC under betingelser, der understøtter deres proliferation, medens der med begyndelsen af differentiering reduceres ekspressionsniveauet for dette gen, hvilket muliggør udvælgelse af rene stabile pluripotente cellelinjer på et selektivt medium. Når dyrket med GFP udvælgelse af ESC'er, øges hyppigheden af kolonier kraftigt, da de kraftige antiproliferative virkninger af differentierede celler under betingelserne for selektionsafgrøder elimineres.

Oversættelse af humane embryonale stamceller i linje ved hjælp af deres fremgangsmåde til isolering af præimplanteringsembryoer (trin 80-120 celler), som foreligger efter in vitro-befrugtning procedure. Til dette bliver de kunstigt opnåede "overskydende" embryoner mekanisk dispergeret i Delbecco-Needle-miljøet. Når cellerne er mærket med selektive monoklonale antistoffer med en fluorescerende label, isoleres cellerne i embryoblastet. Embryoblastet dispergeres i individuelle celler under anvendelse af en blanding af disaspase-collagenase. Dissocierede celler blev dyrket i et særligt medium (80% Delbekko medium + 20% føtalt kalveserum i nærvær af 500 pg / ml IL-6, LIF og SCF) på monolag af embryonale fibroblaster feeder 3 første passager. I dette tilfælde understøttes overlevelse og proliferation af stamceller og stamceller ved udsættelse for IL-6, LIF og SCF. I dette miljø, ophængningselementerne hESCs vokse kloner osharennyh ikke-bundne celler, der skal dissocieres ved forsigtig multipel pipettering. Nye kloner forekommer i den suspenderede kultur den 5.-7. Dag. Den maksimale væksthastighed for ESC opnås ved gentagen dissociering af kloner i et trin på 10-15 celler. Derefter overføres hver klon til en mikrocell og dyrkes til et aggregat på 40-50 celler. Proceduren gentages mange gange i passager, hvilket øger mængden af kultur til en tæthed på 5-10 millioner celler pr. 6 centimeter kop. Ved at bruge en sådan Thomson passage blev isoleret 10 kloner udødelige humane økonomiske og sociale råd som gennem passager 100 bibeholder høj telomeraseaktivitet, evnen til intens proliferation og fænotypiske egenskaber mindste samlede styrke, med differentiering i nogen af de 350 specialiserede cellelinier, som er afledt ekto-, meso- - og endoderm. Differentiering af human ESC startet (ved skift af medium, addition og fjernelse af serum LIF) med cellebinding til substratet, hvilket indikerer udviklingen af cytoskelettet og ekspression af adhæsionsreceptorer. Det er vigtigt, at der med ubegrænset proliferation af humane ESC'er blev en normal karyotype bevaret.

Den anden metode til isolering af humane ESC-linjer er baseret på anvendelsen af primære sexceller. Eksperimentelle undersøgelser har vist, at Eu-cellelinier kan opnås fra de genital plaques af 12,5-dages gamle embryoner af mus. Imidlertid var hyppigheden af dannelsen af stamceller i disse tilfælde signifikant lavere end i forsøg med tidligere embryoner. Samtidig er primære sexceller fra gonader af musembryoner med 13,5-dages gestationsalder generelt ikke i stand til at transformere til linjer.

De første stabile linjer af pluripotente humane EG-celler blev opnået fra primære gonocytter isoleret fra genitalknopperne fra 5-9 ugers gamle embryoner. Isolerede celler blev dyrket på et substrat af inaktiveret muse embryonale fibroblaster i DMEM-medium med føtalt serum, hvortil der blev tilsat mercaptoethanol, forskolin, samt rekombinante humane vækstfaktorer (FGF og LIF). Efter 7-12 dage optrådte multicellulære kolonier i kultur ifølge morfologiske træk og molekylære markører svarende til humane EG-celler. Efter aggregering dannede disse celler embryoidkroppe, med den videre udvikling af hvilke specialiserede celler syntes, karakteristiske for derivaterne af alle tre embryonale blade. I løbet af 10-20 passager bevarede EG-cellelinier normal karyotype og tabte ikke pluripotens.

Det er også vist, at den kombinerede virkning af LIF, membranbundne og opløselige Stålfaktorer, såvel som TGF-b, ændrer programmet til udvikling af primære kønsceller. I stedet for at stoppe de mitotiske divisioner og begynder at differentiere mod oogenese eller spermatogenese, fortsætter de primære sexceller med at proliferere. Efter flere yderligere mitotiske cyklusser bliver de ligner epiblastceller, og ved at miste egenskaberne af forstadier af kimceller transformeres de til pluripotente embryonale stamceller EG-celler.

Således blev i 1998 først immortaliserede linjer af primære seksuelle celler isoleret fra det seksuelle rudiment af humant føtal obduktionsvæv. Den embryogenese af humane primære kønsceller vises i blommesækken i den tredje uge af udvikling, og om de 4-5th uger, disse celler vandrer ind i området for seksuel tuberkel, hvor de danner en population af primære dormantnye gonocytes. I inaktiv tilstand forbliver primære bakterieceller i knoppen indtil fødslen. Primære kim cellelinier blev ekstraheret fra de føtale genital tuberkelbakterier 5-9 uger gamle embryoner hentede ex tempore stof, som behandles med en blanding af collagenase type IV-V, hyaluronidase og DNase til kvantitativ og kvalitativ forøgelse celleudbytte. Primære kimceller i vævene i det føtal-genitale tuberkel er omgivet af Sertoli stromal (mesenkymale) celler. Funktionelle formål af Sertoli-celler er produktionen af anti-apoptotiske faktorer (Fas-ligand), mitogener og immunsuppressive midler, der beskytter seksuelle stamceller fra immunangreb af kroppen. Derudover spiller den stromale mikromiljø af genitalt tuberkul en vigtig rolle i modningen af gameter. De isolerede primære kimceller plantes i kulturen over føderstromallaget bestående af de føtal fibroblaster fra de første tre passager. Den mest effektive kombination af mitogener er et kompleks bestående af LIF, FGF og forskolin (et stimulerende middel til dannelse af cAMP). Spredning primordiale kønsceller in vitro kræver tilsætning af føtalt serum, i nærvær af en primær reproduktion gonocytes i kultur kloner ledsaget af dannelsen af kugleformede, ikke-adhærente celler til substratet.

De amerikanske National Institutes of Health på grundlag af sammenfatte eksisterende oplysninger om de metoder til fordeling af de menneskelige ESC linjer fra blastocyster blev lavet en foreløbig konklusion, at en vellykket fordeling af ESC er mest sandsynligt, når kulturperler blastocyster med velformet indre cellemasse (Stamceller: videnskabelige fremskridt og fremtidige forskningsretninger Nat. Inst, of Health USA). Ud fra dette synspunkt, at den bedste kilde til økonomiske og sociale råd skabe linjer er menneskelige blastocyst 5. Dag af udvikling, hvoraf fordelingen af den indre cellemasse bør fjern forsigtigt trophectoderms. Isoleret indre cellemasse består på nuværende tidspunkt af 30-35 celler skal dyrkes på et substrat murine embryonale fibroblaster, hvilket er en afgørende betingelse for dannelsen af kolonier i kultur hESCs.

Analysen af fænotypiske træk ved embryonale stamceller

Af særlig interesse er den interspecifikke sammenlignende analyse af fænotypiske træk ved ESC. Det blev fundet, at humane ESC kolonier - en tæt klynger af affladede epitelceller-celler, mens mus embryoid kalv består af løs konglomerat af afrundede celler. I human ESC er indekset for atom-plasma-forholdet lavere end i ESK-musen. Embryonale stamceller af aber danner mere flade cellekolonier med ujævne kanter. I tidlige kloner af ESC-primater ses enkeltceller let. Det spredende ESC af alle de undersøgte dyrearter udtrykker ikke MHC-molekyler i den første og anden klasse. Samtidig, humane ØSR giver en positiv reaktion på antistoffer TERA 1-60 og GCTM-2, hvilket indikerer tilstedeværelsen på deres overflade keratin / chondroitinsulfatfilm proteoglycaner karakteristisk for embryoniske (teratomer) -kartsinomnyh stamceller. Ekspression i hESCs alle slags dyr Oct4 gen tyder på, at på trods af de fænotypiske forskelle i humane og murine økonomiske og sociale råd, tilsyneladende aktiveres af det samme sæt af gener, der er ansvarlige for opretholdelse af pluripotens (Peru, 2001). Desuden ESC linier afledt af embryonale rotter, svin, kaniner, primater og kvæg, har lignende morfologiske karakteristika, en lignende sæt af molekylær identifikation af markører og en næsten identisk molekylær mekanisme for gennemførelsen af embryogenese program, der gør det muligt at tage et nyt kig på xenotransplantation spørgsmålet .

Modsætning normal embryogenese in vivo, er in vitro proliferation af hESCs ikke ledsaget af dannelsen af germinale lag og fortsætter til blok homeotiske Nohgenov baggrund, dvs. Uden organogenese. Eftersom segmentering gener ikke fungere i kultur hESCs umuligt at gengive sådanne perioder embryogenese som fane somite segmentering af kernen, dannelsen af blommesækken, allantois provisoriske og andre organer og væv. Kultur-ESC'erne blev frosset ved begyndelsen af dannelsen af 350 restriktionslinjer af specialiserede celler. Således klon subsidiære progenitorceller og centralt lokaliserede PGC'er er kun model embryo under udvikling, hvor forskellige regioner væv dannes i et trin er forskellige fra specialiserede celler afledt imidlertid af fælles prækursorer. Selvom det minimum af receptorer på overfladen af hESCs, de bevarer evnen til at udføre primitive morfogenetiske processer simulerer hovedparten af tidlige embryon struktur: gyllevogne hESCs i kultur og aggregater danner en struktur, som ligner blastocyst eller endog senere embryoner (æg cylindre). Sådanne suspensionsaggregater blev passende navngivet enkle og komplekse embryoidkroppe.

Når de blandes differentiere i forskellige celler i embryoid legeme samtidigt udtrykkes af tidlig gener ektoderm (oct3, FGF-5, nodal), endoderm (gata-4), mesoderm (Brachyury), kardiogent mesoderm (PKH-2,5), neuralrøret (msx3 ) og hæmatopoiesis (elkf). Ved hjælp af forskellige kombinationer af cytokiner og vækstfaktorer til målretning dannelsen af kim lagceller in vitro i en række tilfælde var det muligt at opnå embryoide legemer, som fortrinsvis blev udtrykte gener ectoderm eller mesoderm, der åbner vejen til modellering af gastrulation og tidlig organogenesefasen.

Klonal vækst af hESCs er tegn på asymmetrisk celledeling, hvor kun en af ESC i centrum klon bevarer ikke-begrænsende reproduktion kapacitet, mens den anden datter celle giver anledning til dannelse af progenitorceller, er differentieringen allerede kommer. Derfor er graden af multiplikation af klonen ved periferien af det embryoide legeme højere end i midten. De voksende kloners marginalceller undergår spontan uordnet differentiering, migrere eller dø af apoptosemekanismerne. Disse begivenheder afgøre skæbnen af klonen hvis proliferationshastigheden overstiger hastigheden af migration og apoptotisk celledød, klon størrelser fortsætte med at stige, stabilisering forekommer med lige apoptose og hastigheden for dannelse af ny celle hastighed, regression - den omvendte forhold af disse processer. Progenitorceller opdeles symmetrisk, det vil sige, at begge datterceller differentieres yderligere i modne specialiserede cellelinier. Forholdet mellem ESC / stamceller varierer, men altid er mængden af ESC kun en brøkdel af en procent af progenitorcellepopulationen. Derfor kan kun omhyggelig pipettering og rettidig disaggregering af kloner øge antallet af ESC'er i kultur. For at opnå det maksimale udbytte af ESC var den mest effektive disaggregeringen af klonerne i trinnet på 10-12 celler. Retningen og graden af differentiering af celler i den embryoide krop afhænger af deres placering. Udvendige embryoide kropsceller ikke udtrykke genet og Oct4 undergår differentiering i primære endoderm celler, hvorfra efterfølgende dannede epithelioide celler og parietale ekstraembryone visceral endoderm. De indre celler i den embryoide krop udtrykker oct4 genet og bevarer pluripotency i 48 timers kultur. Imidlertid finder en morfologisk omlejring af kulturen sted i det epitheliale monolag, og ekspression af generne der styrer udviklingen af den primære ektoderm begynder. Derefter begynder processen med total uordnet cytodifferentiering med udseendet af forskellige celletyper, der er derivaterne af alle tre germinale ark. I processen med spontan differentiering af celler i den embryoide krop forekommer aggregater med endoderm markører i form af fragmenter (cyster) af æggeblomme sagen først. Endvidere forekommer angioblaster og endotelceller af voksende kapillærer i disse strukturer. I de sidste faser af spontan differentiering af de indre celler i embryoid kroppen udvikler forskellige terminalt differentierede celler, herunder neuroner, gliale elementer, cardiomyocytter, makrofager og erythrocytter. I vis tilnærmelse (overvejer den rumlige inversion af folier, der danner det embryoniske væv) via embryoide legemer in vitro kan udforske morfogenetiske processer og analysere de molekylære mekanismer i embryonale cytodifferentiation indledende periode, og etablere rollen af specifikke gener i gennemførelsen af disse processer.

Således er der i klonen celler, hvor forskellige genetiske udviklingsprogrammer opdages - ESC'er, tidlige forfædre og differentierende forfædrepopulationer. Dyrkning af ESC ved hjælp af metoderne til en hængende dråbe eller massekultur uden et fødelag og uden tilsætning af LIF i mediet fører uundgåeligt til dannelsen af embryoidlegemer. Morfologien af cellerne i de ydre og indre lag af de embryoide legemer er forskellig. Det ydre lag består af store procesceller. Deres overflade, der vender mod miljøet, er dækket af mange mikrovilli. Det ydre lag af celler er adskilt fra den indre basale membran, der ligner Reichert-membranen, medens cellerne i det indre lag af de embryoide legemer er et cylindrisk epitel. Morfologisk minder det indre lag, selvom det indeholder mange delende celler, mere om udifferentierede ESC kolonier.

Funktioner af menneskelige embryonale stamceller

Fravær af parenkymale-mesenchymal vekselvirkninger i baggrunden signalblokerende gener homeosis forårsager uorganiseret vækst af PGC'er i kultur, da denne fane brydes og dannelsen infrastruktur provisoriske organer. Unorganized vækst og uordnet spontan differentiering af hESCs i kultur på grund af manglende mesenkymale mærkning stromale ramme kommende organer: In vitro er det muligt dannelsen af millioner af hepatocytter, men man kan ikke få nogen segmenter af leveren, herunder sådanne strukturelle og funktionelle elementer, såsom bihulerne, Disses rum og Kupffer-celler.

Det antages, at pluripotensen sådanne organer udelukkende realiseret i embryogenese til dannelse væv og organer i embryonet, mens navlestrengen og placenta er afledt trophoblast. Indesluttet i en skal trofektodermalnuyu ESK konsekvent generere cellekloner provisoriske realisere udviklingsprogram ved kombinatoriske mRNA hovedparten Nohteyaov topografisk matrix, som forudbestemmer det rumlige arrangement, form, dimensioner, antallet af midlertidige og endelige organceller og parenchyma samling i strukturel og funktionel enhed. Samtidig ESC er den eneste celletype, i hvilken den molekylære mekanisme for realisering af deres potentialer fuldstændigt dissocieret fra det genetiske program for udvikling og ESCOs selv frataget muligheden for interaktion med andre celler som følge af blokering af begge receptortyper opfattelser og transsignalizatsii systemer. Imidlertid er tilstrækkelige aktivering økonomiske og sociale råd resulterer i en gradvis implementering embryogenese program slutter fødsel helt dannet og klar til at ekstrautrin liv af en organisme, der består af milliarder af celler. I denne korte tid, men ufattelig gæld i det cellulære rum sti uundgåelig forekomst af fejl i de molekylære mekanismer, der giver vitale funktioner i celler, og i de programmer, der styrer deres proliferation, differentiering og specialisering. Derfor, i moderne farmakogenomik behandles særskilt sygdom molekylære enheder og sygdom celle programmering. Og virkningen af de fleste nye lægemidler rettet mod at korrigere navnet på programmet for differentiering, proliferation og organogenese, samt regenerering af organer og væv. I den voksne organisme via ØSR bliver det muligt at styre adfærden af stamceller / progenitor celler transplanteret ind i hjernen, lever, milt, knoglemarv og andre organer i den menneskelige at reparere en beskadiget recipient parenchymale organer som følge af differentierings- og specialisering donor mesenchymalceller konserveret matrix. Væsentlige, er totipotens program lancerer en anden oocyt genomplan, zygoter og blastomerer, men disse celler er endnu ikke muligt at klone og passeret i de mængder, der er nødvendige til brug for experiental og praktisk medicin. Derfor, ESC er en unik kilde til genetisk information, der indeholder det tredimensionale lineære restriktionskort for embryoet og koder af specialiserede cellelinier under gastrulation.

Stort set ubegrænsede muligheder for regenerativ ESC grund af det faktum, at deres genom, i modsætning til den genetiske apparat af differentierede somatiske celler, opretholder pluripotens. En manifestation af sovende tilstand rodfæstet i sektorrådene genetiske information er den såkaldte minimum fænotype - på overfladen af ESC til at udtrykke et begrænset antal receptorer, og derfor indsat meget få programmer til at interagere transsignalizatsii nukleare apparat af cellen med dens mikromiljø. På baggrund af dvale gener er ansvarlige for begrænsning af specialiserede cellelinjer og differentiering af celler, aktiveret kun omkring 30 af de 500 gener, hvis produkter giver kommunikationsceller med det omgivende mikromiljø. Anvendelse af fremgangsmåden ifølge seriel analyse af genekspression viste, at den generelle betydning af de vigtigste funktionelle genom kasser regulerer energi og metabolisme i somatiske celler og økonomiske og sociale råd i seneste bestemmes ekstremt lav mængde mRNA af receptorer, G-proteiner, second messengers, transkriptaser, cofaktorer ekspression og repression dvs. Hele systemet transmembrane regulatorisk signal i cellen. Dette skyldes manglen eller meget lavt udtryk for transsanaliseringsgener. Under differentieringen induceres i genomet af ESC 18 operation standses synkront fungerende gener for baggrundsaktivering transsignalizatsii 61 gen styrer syntesen af celleadhæsionsreceptorer, ekstracellulære matrixkomponenter, restriktion transkriptaser messendzhernyh elementer og signaltransmissionssystem for en nuklear enhed med plasma cellemembranreceptorer. Samtidigt blokeret ekspression af gener, der er ansvarlige for syntesen af proteiner lyddæmpere, samt genekspression koingibitorov tilvejebringe totipotens genom hESCs.

Genetiske markører blev fundet for cellerne i alle tre embryoniske folder. Identifikation ektodermal cellelag båret på ekspressionen af gener nodal, oct3 og FGF-5, mesodermale celler - gen Brachyury, zeta-globin, endoderm - ved gata-4-genekspression. I normal embryogenese under gastrulation observeret en aktiv vandring af umodne populationer af stamceller og progenitorceller, lokalt designeret områder af ansigtets knoglerne i kraniet, nogle dele af hjernen, det perifere nervesystem, hjerteledningssystemet og thymusvævet som dannes fra kloner forskydes celler. Mærkning celle tidlige gener kimlag gør det lettere for topografisk analyse af migration af progenitorceller i udviklende embryo. Det konstateres især, at cellerne i aggregater embryocarcinoma P19 ekspression af det første gen mesoderm Brachyury starter under reduktionen af genekspression af vævsplasminogenaktivator, a-fetoprotein keratin 8 og keratin 19, som er markører for tidlig mesoderm befolkningsmigrationer. Følgelig dannelsen af væv af mesodermal oprindelse begynder først efter processen med migration og bundfældning punkt mesodermal progenitorceller.

Med ekstremt begrænsede fænotypiske træk og fraværet af de fleste af blokkene transsignalizatsii ESC alligevel udtrykker nogle receptormolekyler, der kan anvendes til at identificere dem. Det er bemærkelsesværdigt, at antigenerne er markører for ESC i mennesker og primater var almindelige. Oftest bruges til mærkning hESCs mærkede antistoffer til antigener membrannosvyazannym SSEA-3, SSEA-4 (unikke lipid-antigener, der repræsenterer kompleks glycolipid GL7 med sialinsyre), samt høj polymer glycoproteiner TRA-1-81, TRA-1-60. Endvidere hESCs udtrykker specifikke embryonisk antigen SSEA-1 og endogen alkalisk phosphatase, såvel som en specifik transkriptionsfaktor Oct4. Sidstnævnte er nødvendig for at opretholde hESCs sprednings-mekanismer - transkriptionsfaktor Oct4 genet aktiverer ekspressionen af fibroblastvækstfaktor 4 genekspression og stabiliserer boksning ansvarlig for ikke-begrænsende DNA reduplikation i umodne celler. De vigtigste intracellulære markørproteiner er Oct3, Oct4, Tcf og Groucho, relateret til proteiner af kromatin-lyddæmpere.

Næsten umiddelbart efter de langsigtede dyrkede ØSR forsøg mislykkes, og organismen blev først fremstillet ved dyrkning af stamceller isoleret fra museblastocyster og primær kim cellekultur, begyndte studieperiode ESC pluripotensmarkører kapacitet, når de indgives i de tidlige stadier af fosterudvikling. Det blev vist, at ved morula og blastocyst PGC'er er i stand til at danne kimære embryoer, hvori donor- PGC efterkommere påvises i alle somatiske væv og selv i kønsceller. Således i Developmental Biology hjælp ESC scripting "bro" mellem de eksperimentelle undersøgelser in vivo og in vitro, som væsentlig større mulighed for at studere processer bogmærker primære væv og organer, deres differentiering og embryonale organogenese.

Det er klart fastslået, at ESC'er in vivo i embryogeneseprocessen er integreret i den tidlige bakteriecellemasse, og deres derivater findes i alle organer og væv. PGC'er koloniserer kimlinie en kimære kimceller, efterkommere af som danner fuld æg og sperm. Embryonale stamceller er klonogene - single PGC'er kan skabe genetisk identisk med en koloni af celler med molekylære markører, som omfatter Oct4 genekspression og alkalisk phosphatase, høj telomeraseaktivitet, samt ekspression af specifikke embryonale antigener.

For at undersøge mekanismerne ved embryogenese under anvendelse af teknikken ifølge hESCs kimærisering morula ved at skabe en biologisk struktur, som er beliggende uden for lag tetraploide blastomerer modtager- og donor PGC'er administreres i. Således trofoblast dannet af efterkommere tetraploid blastomererne modtager, der muliggør implantation og placentation, og donor PGC'er fungerer som den indre cellemasse, der er dannet af en levedygtig kimlinie af de primære organ og progenitor kønsceller. Undersøgelse ESC værdi ligger ikke kun i, at der ved manipulation in vitro med deres genom bibeholdt pluripotens, men også i det faktum, at mens bevare evnen til at deltage i dannelse af hESCs primordiale kønsceller af det kimære embryo. Det er vist, at kun én afkom af genetisk modificerede PGC'er kolonisere alle primære og bakterier, der danner stof kimært embryo opnået ved aggregering eller cokultur af cellerne med 8 celler embryo. Når de transplanteres i mus morula økonomiske og sociale råd transficeret med grønt fluorescerende protein-gen, blev fluorescerende efterkommere af cellerne fundet i alle undersøgte væv i udviklende embryo (Shimada, 1999). Transplantation af ESC i morula kan skabe levedygtige mus, kroppen som udelukkende består af efterkommere doneret ESC, som åbner mulighed for en række terapeutiske kloning muligheder. Nu sådan en metodisk tilgang er blevet anvendt med succes til at studere problemerne med udviklingsmæssige biologi, i særdeleshed, kan det analysere de genetiske mekanismer inaktivering af X-kromosomet eller epigenetisk ustabilitet af hESCs. Transplantation af ESC til det tidlige embryo anvendes også i bioteknologi inden for landbruget såvel som i genterapiforsøg.

Transplantationer af genetisk modificerede ESC'er anvendes til at teste målcellerne af mutantgener. In vitro dyrkede ESC'er anvendes i bioteknologi til at skabe knockout-mus. Til dette formål ved homolog rekombination, der skal fjernes fra ØSR undersøgelse gen (knockout) og selektive medier udskiller celler, der mangler dette gen. Derefter injiceres ESC'er i blastocysten eller aggregeres med blastomerer af morula. De således opnåede kimære tidlige embryoner transplanteres i en recipient hun og nyfødte mus udvalgt blandt personer med mælke nullizigotnymi af dette gen. Ifølge denne teknologi skabt mange linjer af knockout-mus, der er almindeligt anvendt i eksperimentel biologi og eksperimentel medicin. Ved disse biologiske modeller undersøgt værdien af visse gener i embryonisk udvikling samt deres rolle i de mekanismer sygdomme og patologiske tilstande hos mennesker. Derudover knockout dyr linje anvendes i den fase, præklinisk afprøvning af nye fremgangsmåder til genterapi. For eksempel ved anvendelse af genet transfektion i ESK normal allel af mutantgenet styre effektivt korrigeret mutation, rammer hæmopoietiske system. Indførelsen af fremmede gener i ØSR tillader hurtigt oprette linjer homozygote transgene forsøgsdyr. Dog skal det bemærkes, at teknikken rettet rekombination gendeletion pålideligt udarbejdet som endnu kun relativt ESC mus. Anvendelse af murine økonomiske og sociale råd dobbelt knockout installeret funktionel rolle område klynge af gener på kromosom 7 (kopi genomiske region 19 minutter humant kromosom), og den proximale del af det 11. Kromosom (kopiere humant 5d kromosom) - deletion af disse gener i ESK-mus fik lov til at evaluere funktionen af deres analoger hos mennesker.

De kapacitet funktionsstudier af humane embryonale gener, transfektion i genet, som forsøgsdyr tilladt hESCs især krypto præcisere rolle af genet i fligen og danner kardiogent mesoderm, pax-6-gen - i embryogenese øjet. Udgør den første ekspression af gener i umodne prolifererende kort ESC teratocarcinom og blastocyst mus bekræftede overvældende undertrykkelse i ESK transsignalizatsii gener. Kombinationen af mutante ØSR 60-80 og 20-30 celler fra normale forud for implantationer museembryoer fører til udvikling af kimære embryoner hvori Foretrukne organer er sammensat af donor- og recipientceller, der giver os mulighed for at bestemme rollen af ukendte gener i gastrulation og organogenese. Funktionelle kort over gen udvikle musefostre forstørrede detaljer om den rolle gen sf-1 tab i binyrerne og genital primordia, wt-1-genet - i nyrer fanen MyoD familie gener - i tappen på skeletmuskel-genfamilien gata-1-4 - i begrænsningen modning Rødimenter af erytro- og lymfopoisis.

Instrueret ud af mødrene og fædrene alleler af gener i hESCs hjælp vektor rekombinase tjente til at klarlægge funktionerne af forskellige gener under tidlig embryogenese og teknologi målretning af menneskelige ukendte gener i mus økonomiske og sociale råd bidrager til opdagelsen af nye mutant gener, der er ansvarlige for udviklingen af alvorlige arvelige sygdomme. Anvendelse knockout definerede fremgangsmåde obligat betydning for visse gener til udlægning embryonale væv: gata-4 - for infarkt, gata-1 - erythroid- hæmatopoietisk væv, MyoD - skeletmuskel, Brachyury - for mesoderm begrænsning transkriptaser hnf3 og HNF4 - for leverstamceller, rag-2 - bogmærker for kloner af T og B-lymfocytter (Repin, 2001). Dobbelt sletning af gener i hESCs har åbnet adgang til studiet af den funktionelle rolle af gener af den germinale lag, segmentering og homeosis og ESC transplantation givet muligheden for at opnå levedygtige artshybrid embryoner. Med forbedrede fremgangsmåder til transplantation af donor-PGC'er i en enkelt 8-celle embryon bevist, at kimærisering på celleniveau af mange organer i modtagerens embryo. Bemærk, at celle-spirer findes i humane væv recipientmus organer efter indgivelse af humane hæmatopoietiske stamceller i en blastocyst. Det konstateredes, at i museembryoer under dannelsen af blod organer cirkulerende pluripotente hESCs. Det er muligt, at deres biologiske funktion er i den embryonale organisation af det fremtidige immunsystem. Med ESC in vitro gengivet passende modeller af human genetisk sygdom: dobbelt knockout modeller dystrophingenet i mus af Duchenne muskeldystrofi, shutdown atm genet (styresignal syntese kinase chromatin) - ataksi-teleangektaziyu. I dette tilfælde en fatal arvelig sygdom hos børn på grund af defekter i DNA-reparation udvikler degenerering af Purkinje-celler i cerebellum, som er ledsaget af en involution af thymus på grund af dødsfald af de prolifererende celler. Klinik, patofysiologi og patomorfologija ataksi-teleangek- tazii gengives via indføring i ESC unormal genetisk information fra mus kimærer svarer til dem i mennesker. Endvidere ataksi-teleangektazii anvendelse PGC'er og knockout-mus udviklet forsøgsmodel, nogle arvelige homozygote humane sygdomme forbundet med lidelser i kulhydrat og lipid metabolisme, katabolisme af aminosyrer, fjernelse af kobber og bilirubin, som i væsentlig grad øget muligheden for eksperimentel medicin til præklinisk afprøvning af nye metoder til behandling af relevante sygdomme person.

[12], [13], [14], [15]

Anvendelsen af stamcellet cytohybrid

De hybride celler opnået ved fusionering af somatiske celler fra hESCs, er tilstrækkelige og lovende model til undersøgelse af stamceller pluripotens og omprogrammering af differentierede cellekromosomer. Tsitogibridy opnået ved fusion af ESC med differentierede celler af det voksne dyr, giver mulighed for at undersøge forholdet mellem genomerne af forskellige "aldre": udvikler en unik situation, hvor de homologe kromosomer er afledt fra celler af forskellige stadier af differentiering og varierende grader af modenhed, er på den samme kerne, hvor de kan nemt transdeystvuyuschimi deler regulatoriske signaler. Det er svært at forudse, hvordan vil reagere tsisregulyatornye epigenetiske system for homologe kromosomer eksisterende under yn dividuelle udvikling, som reaktion på indvirkningen transdeystvuyuschih signaler fra embryonale beslægtede genomer. Desuden er der i de hybride celler forekommer adskillelse af forældrenes kromosom gør det muligt at studere interaktionen af genomerne ved særskilt kromosomniveau, dvs. Potentielt identificere den del af specifikke kromosomer i opretholdelsen af pluripotens, eller tværtimod et output i differentiering.

Som den første eksperimentelle model til undersøgelse af interaktionen mellem genomer af forskellige "langvarig udvikling" anvendes tsitogibridy opnået ved at fusionere teratokartsinomnyh pluripotente og differentierede somatiske celler. I nogle tilfælde beholdt sådanne hybridceller pluripotente egenskaber på et tilstrækkeligt højt niveau. Især blev in vivo somatiske hybrid teratokartsinomno-celler induceret udvikling af sande teratomer indeholdende derivater af alle tre kimlag, en in vitro i suspensionskulturer dannede embryoide legemer. Selv i denne type interspecies tsitogibridov konstateret tilstedeværelsen af føtale antigener i tilfælde, hvor somatisk partner i fusionen med teratocarcinomaceller celler blev lymfocytter eller thymocyter. Det er bemærkelsesværdigt, at tsitogibridy af fusionen teratokartsinomnyh celler med fibroblaster, i overensstemmelse med fænotypen af fibroblaster.

Det vigtigste er, at en etableret kendsgerning, at i-teratokartsinomno somatiske hybridceller optrådte tegn genom omprogrammering af differentierede celler, kendetegnet ved en reaktivering af individuelle gener eller inaktive X-kromosom somatisk partner. Således resultaterne af forskning på typen tsitogibridah teratokartsinomno-somatiske celler indikerer, at hybride celler ofte bevaret pluripotens og omprogrammering af genomet, der er tegn på somatisk partner.

I forsøgene til opnåelse af embryonale intraspecifikke hybridceller ved at fusionere splenocyter med muse ØSR voksne dyr undersøgte karakteristika såsom tsitogibridov, adskillelse analyse af parentale kromosomer og vurderet pluripotens hybrid genom. For artshybrid celler produceret ved fusion teratocarcinomceller med somatiske celler, generelt er kendetegnet ved lav segregering af kromosomer med tetraploid eller næsten tetraploide karyotype. En lignende kromosomal sammensætning blev observeret i cytohybriden ved fusion af primære sexceller med lymfocytter. Samtidig er de artshybrid celler opnået som resultat af en fusion mellem musen lymfocyt celle teratokartsinomnyh mink, der var intens adskillelse af kromosomer somatisk partner.

Et kvalitativt nyt trin i studiet af segregering af parentale kromosomer i artshybrider kom efter udviklingen af mikrosatellit analysemetode under anvendelse af polymerasekædereaktionen, hvorved hver musekromosom fundet et par hundrede markører, så pålideligt diskriminere mellem ethvert par af homologe kromosomer i de hybride celler.

Ved at fusionere ESK (under anvendelse HM-1-celler deficiente i gipoksantinfosforiboziltransferazy aktivitet, 2n = 40, XY, isoleret fra blastocyster musestamme 129 / 01a) med splenocytter fra mus congen linien DD / c undladt at modtage sættet af hybridkloner morfologisk havde lighed med hESCs. Alle kloner blev isoleret på selektivt medium, hvori vækst er kun muligt med den aktive celle gipoksantinfosforiboziltransferazoy. Elektroforetisk analyse afslørede tilstedeværelsen af alle kloner allelvariant gipoksantinfosforiboziltransferazy karakteristisk mus DD / c. Ved hjælp af cytogenetisk analyse, blev det konstateret, at fire havde tre hybrid kloner okolodiploidny sæt af kromosomer. En nær-tetraploid klon indeholdt to populationer af hybridceller, hvoraf den ene var tetraploid, og den anden, mindre - diploid.

Analyse af mikrosatellit gør det muligt at diskriminere helst par af homologe kromosomer mus 129 / 01A og DD / c, i de hybride kloner med okolodiploidnym sæt viste at kloner forekom i to forskellige præferentielle eliminering autosomer somatisk partner. De fleste autosomale kloner HESS2 og HESS3 havde markører linje 129 / 01a, dvs. Pluripotente partner. Undtagelsen var kromosom 1 og I: kloner HESS2 og HESS3, sammen med markører for HM-1-celler, et lille antal markører til stede somatisk partner. Disse resultater kan afspejle ufuldstændig adskillelse af kromosom 1 og og somatisk partner og er i overensstemmelse med cytogenetiske data, som trisomi af kromosomer, der opstår i 30-40% HESS2 og HESS3 celle kloner. HESS4 klon afveg markant i kromosomal sammensætning: mange autosomer Denne klon stammer fra genomet ESK (kromosomer 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 13, 14 og 17), men kromosomer 1, 9, 11, 12, 15, 16, 18 og 19 blev repræsenteret af begge forældres homologer. Mængdeforholdet mellem mikrosatellitmarkører disse homologe kromosomer svarede ca. 1: 1. Dette tilladt forfatterne til at foreslå, at en homolog er afledt fra genomet af ESC og den anden - fra differentierede celler. I nogle subkloner af klon observeret HESS4 kun symbolsk tilstedeværelse af kromosomer 18 og 19 somatiske partner. Resultaterne indikerer, at cellerne klone HESS4, foruden adskillelse af kromosomer somatisk partner, der var fjernelse af den ene eller begge homologer af ovennævnte kromosom pluripotente genomet, dvs. Der var et tosidet adskillelse af kromosomer fra begge forældre - fænomenet er helt usædvanligt, fordi tsitogibridov karakteristisk segregation af kromosomer kun en af forældrene.

Derudover efter den 20. Passage, alle kloner af hybridceller kun indeholde de X kromosommarkører af den somatiske partner, dvs. I klonerne blev erstattet X-kromosom ESC på X-kromosomet af den somatiske partner. Dette bekræftes ved in situ hybridiseringsdata ved anvendelse af en FITC-mærket probe specifik for muse-X-kromosomet: et positivt signal blev kun påvist på et kromosom. Det skal bemærkes, at i tidligere dyrkningsstadier (op til 15. Passage) var der ifølge cytogenetiske data i mange celler to X-kromosomer. Anvendelsen af selektive medier gør det således muligt at manipulere den chromosomale sammensætning af hybridceller og selektivt målrette kloner, der bærer enkeltkromosomer fra den somatiske partner på baggrund af ESC-genomet.

Som en unik funktion af genomet tsitogibridov er lokaliseringen af parentale genomer i en enkelt kerne, selvfølgelig, rejser spørgsmålet om at opretholde egenskaberne af pluripotente embryonale genom ESC-somatiske cellehybrider i betingelserne for tæt kontakt med genomet af differentierede celler. Morfologisk tsitogibridy PGC'er og somatiske celler lignede den parentale linje hESCs. Kvalifikation pluripotency viste, at alle kloner okolodiploidnym sæt kromosomer kunne dannes i suspensionskulturer af embryoide legemer, i hvilke foreliggende derivaterne af de tre kimlag.

De fleste hybridceller indeholdt ECMA-7 antigenet, en markørkarakteristik af tidlige musembryoer, og havde også en høj aktivitet af alkalisk phosphatase. De mest overbevisende data om hybridcellernes høje pluripotente egenskaber blev opnået i eksperimenter for at opnå en række injektionschimerer involverende hybridceller af klonen HESS2. En analyse af biokemiske markører viste, at efterkommere af donorhybridceller blev fundet i de fleste kimærvæv. Som følge heraf opretholder hybridceller opnået ved fusion af ESC og somatiske differentierede celler pluripotens på et højt niveau, herunder evnen til at danne kimærer, når de indsættes i blastocystkaviteten.

Kloner HESS2 og HESS4 varierede signifikant i sammensætningen af de overordnede kromosomer, men de havde lignende pluripotente egenskaber. Man ville antage, at plyuripotentnostv 'i den hybride genom manifesterer sig som en dominerende tegn, men det er muligt, at ikke alle de embryonale genomkromosomer er involveret i vedligeholdelse af pluripotens. Hvis denne antagelse er sand, kan det forventes, at elimineringen af nogle kromosomer pluripotente partner fra genomet af hybride celler ikke ledsages af en ændring i deres pluripotente status. I dette tilfælde ville analyse om adskillelse af forældrenes kromosom i embryonale hybride celler tillader at komme tæt på at identificere kromosomer der er ansvarlige for at kontrollere pluripotens af embryonale celler.

Serov O. Et al (2001) findes blandt de 50 afkom opnået fra krydsninger af kimærerne med normale mus, dem, der ville have genotypen mus 129 / 01a, og som bærer X-kromosomet DD mus. Forfatterne ser årsagen til dette i reduktionen af pluripotency i hybridceller under påvirkning af det somatiske genom. En alternativ forklaring kan være den negative virkning af trisomi for nogle ubalance af autosomer og kønskromosomer (XXY observeret i celler op til den 15. Passage) i de hybride celler ved passage af meiosen. Det er kendt, at celler i XXY ikke kan passere gennem meioser og danne gameter. Trisomy er også i stand til at forårsage et fald i proliferative aktivitet hos hybridceller, hvilket resulterer i en selektiv fordel i udviklingen af kimærer kan tilhøre cellerne i recipienten embryo. Det følger heraf, at det er nødvendigt at opnå hybridkloner med et normalt diploid sæt af kromosomer for tilstrækkeligt at vurdere hybridcellens pluripotente potentiale.

I eksperimenter Serova O. Et al (2001) demonstrerede først muligheden for at omprogrammere X kromosomet i genomet af en somatisk celle hybridcelle. Denne konklusion følger af forfatterne analysere ekspressionen af kimærer hprt gen (X-kromosom markør): tilstedeværelsen af allele varianter hprt DD / c-mus blev påvist i alle analyserede væv kimære. Det skal understreges, at efter indførelsen af hybridceller i blastocyst hulrum tsitogibridy falder i ikke-selektive betingelser og bevarelse af X-kromosomet i genomet af de hybride celler betyder, at det er blevet en obligat bestanddel af dets genom og ikke diskriminerer det fra Y-kromosomet pluripotent partner.

Sammenfattende resultaterne af analysen af interaktionen mellem somatiske og pluripotente genomer i hybridfosterceller, konkluderer forfatterne, at i nogle cytohybrider manifesterer pluripotency sig som et dominerende træk. Et hybridgenom er i stand til at omprogrammere individuelle kromosomer af differentierede celler, som dog ikke udelukker muligheden for det asiatiske genoms omvendte virkning på pluripotencen af det embryonale genom. Ved dyrkning af hybridceller forekommer induktion af differentiering meget oftere end i ESC NM-1's oprindelige moderlinie. En lignende virkning observeres i dannelsen af primære kolonier: mange primære kolonier af embryoniske hybridceller differentierer i de tidlige stadier af dannelse med store tab af kloner under deres udvælgelse og multiplikation.

Således tsitogibridy ved fusion af ESC med somatiske celler på trods af den tætte kontakt med genomet af differentierede celler bevarer pluripotens som en unik funktion af den embryoniske genom. Desuden er det i sådanne hybridceller muligt at omprogrammere de individuelle kromosomer, der stammer fra de diffunderede celler. Det er fortsat uklart, hvor velbevarede plyu- ripotentnye egenskaber af embryonale genom i hybride celler, især deres evne til at deltage i dannelsen af kim-line kimærer. Til dette er det nødvendigt at opnå embryonale hybridceller med en normal karyotype. Under alle omstændigheder kan de pluripotente embryonale hybride celler være en reel model for genetisk identifikation af kromosomer, der er involveret i opretholdelsen af pluripotens eller hendes kontrol som bilateral segregering af forældrenes kromosomer potentielt giver en sådan mulighed.

Ikke mindre attraktiv er fænomenet undersøgelsen, som Serov G. Et al (2001) defineret som "kromosomal hukommelse." I den hybride genom homologe kromosomer er to alternative konfigurationer: homologe somatisk partner engang gennemgået differentiering, mens homologer pluripotente partner, er denne proces lige begyndt. Derfor opretholde høje pluripotente egenskaber af hybridceller viser, at "pluripotente" konfiguration homologer ESC relativt stabile i hybride genomer, til trods for virkningerne af transdeystvuyuschih faktorer udgår fra somatiske partner. De ovenfor beskrevne træk ved omprogrammering differentieret homolog genomkromosomerne under udviklingen af kimærer ikke udelukke, at de første faser af dannelse in vitro og dyrkning tsitogibridov de bevarer deres status erhvervet under differentiering in vivo. Ifølge nylige data, når overføre de embryonale hybridceller i ikke-selektivt medium, hvori der er en intensiv kun eliminering kromosomer somatisk partner, dvs. Genomet af hybridceller nemt diskriminerer homologer efter in vitro-dyrkning i 10-15 passager. Således embryonale hybride celler repræsenterer en lovende eksperimentel model for undersøgelsen ikke blot af de grundlæggende egenskaber af embryonale genom som pluripotens, men også alternativerne - embryonale differentiering.

Terapeutisk virkning af embryonal stamceltransplantation

Før vi analyserer den terapeutiske virkning af ESC-transplantation og deres derivater opsummerer vi ovenstående materiale. ® ESC i form af en fuldstændig gennemførelse af embryogenese in vitro er utilstrækkelige på grund af defekter i dette tilfælde på grund af fraværet af mesenkymale stamceller, som opstår i kroppen selvstændigt og uafhængigt af hESCs. Den genetiske styrke af ESC er mindre end zygotets genetiske potentiale, derfor er den ikke direkte brugt til kloning af embryoner. ESC's unikke biologiske potentiale som de eneste celler, hvor udviklingsprogrammer udnyttes i fuld succession, findes i undersøgelser om generernes funktion. Med ESC's hjælp er de første kombinationer af signaler, som aktiverer ekspressionen af tidlige og sene gener, som koder for udvikling af tre embryonale ark, dechifreret. Bevarelse genom pluripotens af økonomiske og sociale råd in vitro gør dem unikke værktøj til reparation regenerering, der automatisk kan kompensere for tab celle beskadigede organer og væv. I en ideel hypotetisk udførelsesform kan antage, at "... I transplantation af donor PGC'er i recipientorganismen overføres kompakt pakkede programmer, der under gunstige betingelser er realiseret i konstruktionen af nye tkani'7 stand" ... Integreres effektivt i modtagerens krop som morfologiske, både funktionelle og funktionelle. "

Naturligvis efterfulgt af udviklingen af metoder til monodifferentiering af ESC, begyndte in vivo-studiet af den funktionelle aktivitet af celler opnået in vitro fra en enkelt specialiseret klon. Den proliferative ESO-klon genererer populationer af migrerende stamceller, som virkelig er i stand til aktivt at integrere i modtagerens vævsskadezoner, som anvendes i regenerativ plastikmedicin. Det er blevet fastslået, at transplantation af Dopa-neuroner i substantia nigra reducerer kliniske manifestationer i eksperimentel hæmarkarkinsonisme. Regionale transplantationer af donor-neurale stamceller reducerer graden af motoriske lidelser forårsaget af traumer eller kontusion af rygmarv og hjerne. Modtaget og de første positive resultater af stamcelletransplantation i demyeliniserende sygdomme. Det ser ud til, at ESC'ernes regenerative plastikpotentialer åbner ubegrænsede muligheder for at anvende cellulær transplantation i praktisk medicin. Ved transplantation i ektopiske zoner omdannes ESC uundgåeligt til tumorer. Når der dannes subkutan injektion af ESC i immunodeficiente mus-teratomer. Når ESK-suspensionen transplanteres under testisens kapsel i syngene mus, dannes der også et teratom bestående af forskellige væv, hvis celler er afledt af alle tre embryoniske folder. I sådanne teratomer er processerne med reduceret organogenese ekstremt sjældne.

En række værker giver information om de positive resultater af transplantation af tidlige derivater af ESCO'er til dyr med ex-perimental patologi. Celle neurotransplantation anvendelse af derivater af PGC'er er yderligere udviklet i forsøget og de første kliniske forsøg med korrektion af funktionelle lidelser i hjernen og rygmarvstrauma, behandling af syringomyeli og dissemineret sklerose (Repin, 2001). Med fremkomsten af teknologi neyronogeneza økonomiske og sociale råd in vitro, i stedet for at anvende embryonale hjerne vævstransplantation teknikker udviklet derivater af neurosfærer, opnået fra kulturer af embryonisk nervevæv. Sådanne transplantationssuspensioner er langt mere homogene og indeholder tilsatte neuronale og neurogliaprecursorer.

Ud over den regulært dyrkningsmedium med retinsyre i en dosis på 10 ug / ml i 6 uger i embryonale linjer (teratomer) NTERA-2 human -kartsinomy dannet over 80% af post-mitotiske neuroner. Den komplette homogenitet neuronal befolkning opnås ved flow sortering mærket immunfænotypiske markører for modne neuroner, der kan slippe af resterne teratokartsinomnyh og umodne celler. Efter transplantation i forskellige regioner i hjernen af forsøgsdyr overlever sådanne neuroner ikke kun, men er også indbygget i regionale neurale netværk. Hos dyr med eksperimentelle modeller for lokale defekter CNS neurotransplantation reducerer kliniske manifestationer af human patologi såsom virkningerne af craniocerebral trauma, slagtilfælde, demyelinisationssygdomme, arvelige cerebellar udvikling defekter, sygdomme aflejring af lipider og polysaccharider.

For at optimere regenereringsprocesserne i degenerative sygdomme i centralnervesystemet udvikles teknologier til fremstilling af myelinproducerende oligodendrocytter fra ESK. Den første fase involverer traditionelt spredning af ESC'er med multiplikationen af antallet af celler, der er nødvendige til transplantation. I anden fase udføres rettet differentiering af celler ind i en population af myelinproducerende oligodendrocyt-precursorer, der styres af selektive markørantigener.

Nogle perspektiver åbnes for brug derivater ESC'er at udvikle metoder til korrektion af immundefekt forårsaget af genetiske defekter i modningen af thymus. I undersøgelser i knockout (rag 1) mus med induceret gendefekt - overtrædelse rekombinationsmekanisme V (D) J gen loci TCR, der fører til tab af funktion af T-lymfocytter, transplantationsantigener tidlige derivater af PGC'er i thymus dyr genvinder modning af normale populationer af immune kloner ansvarlige for cellulær immunitet. Kliniske forsøg med transplantation præformerede in vitro hESCs til behandling fatal arvelig anæmi hos børn.

Indvendinger mod hurtig introduktion af stamcelletransplantation til klinikken er begrundet i et begrænset antal stabile linjer af humane embryonale stamceller og behovet for deres standardisering. For at øge renheden af standardiserede ESC-linjer såvel som voksne stamceller foreslås en metode til linjevalg baseret på molekylærgenetisk analyse af korte tandemreceptater af DNA. Nødvendig er også markeret ESC linjer for tilstedeværelsen af små kromosomafvigelser og genetiske mutationer, potentialet for forekomsten af hvilke i celle dyrkningsbetingelser er ganske stor. Afhandling strækker obligatorisk teste egenskaberne for alle typer af PGC'er og regionale pluripotente stamceller, da deres formering in vitro, kan give anledning til nye karakteristika ikke iboende i embryoniske stamceller til definitiv eller væv. Især antages det, at langvarig dyrkning i medier med cytokiner Hess tættere til tumorcellerne, da de forekommer lignende ændring pathways, der regulerer cellecyklus med erhvervelsen af evnen til at gennemføre et ubegrænset antal celledelinger. Nogle forfattere vurderer på grundlag af potentialet for udviklingen af tumorer menneskelig transplantation af tidlige derivater af embryonale stamceller som hensynsløshed. Efter deres mening er det meget sikrere at bruge ESC's begavede efterkommere, det vil sige linjerne for forfædrene til differentierede celler. Imidlertid er en pålidelig teknik til opnåelse af stabile humane cellelinjer, som adskiller sig i den rigtige retning, endnu ikke udviklet.

Således er der i litteraturen flere og flere data om den positive terapeutiske virkning af transplantation af humane embryonale stamcellederivater. Imidlertid er mange af disse værker underlagt revision og kritik. Nogle forskere mener, at resultaterne af tidlige kliniske forsøg er foreløbige og foreslår kun, at stamceller kan have en gavnlig effekt på den kliniske forløb af en sygdom. Derfor er det nødvendigt at indhente data om de langsigtede resultater af celletransplantation. Som et argument er stadierne af udvikling af klinisk neurotransplantologi givet. Faktisk, i litteraturen, oprindeligt domineret af offentliggørelsen af den høje effektivitet af hjernen transplantationer fragmenter af embryoner i Parkinsons sygdom, men derefter begyndte at dukke rapporter benægte terapeutiske effekt af embryonale eller føtalt neuralt væv transplanteret ind i hjernen på patienter.

Gennemført de første kliniske forsøg til vurdering af sikkerheden ved transplantation neuroblast - derivater af PGC'er NTERA-2 teratocarcinom blev umodne celler, som prolifererer i kultur underkastet opbevaring nummer 100 million cellemasse. En del af de således opnåede celler blev anvendt til at bestemme de karakteristiske træk cellefænotype og urenheder, samt at teste potentielle kontaminering med vira og bakterier. Fra dyrkningsmediet fjernet LIF og fødelag af stromaceller og føtale skabt betingelserne for dirigeret differentiering af hESCs i neuroblaster med en kombination af cytokiner og vækstfaktorer. Derefter blev neuroblasterne oprenset fra umodne teratocarcinomceller på en flowburssorter. Efter den anden oprensning og karakterisering af fænotypen af transplanterede celler neuroblaster (10-12 millioner) suspension med en speciel sprøjte og microcannulas stereotaxy og under kontrol af CT injiceret i nucleus basalis af hjernen af patienterne (den syvende måned efter hæmorrhagisk slagtilfælde). Efter transplantation et års screening af virkningerne af neuronal transplantation i slagzonen viste ingen bivirkninger og uønskede virkninger. Halvdelen af patienterne oplevede en forbedring i motorfunktionen i perioden fra 6 til 12 måneder efter transplantation. Positive kliniske ændringer blev ledsaget af en stigning i blodtilførsel slagtilfælde zone efter transplantation af celler: gennemsnitsabsorptionstiden forøgelse af det fluorescensmærkede 2-deoxyglucose, ifølge positronemissionstomografi nåede 18%, og hos nogle patienter - 35%.

Det amerikanske National Institute of Health gennemførte dog en uafhængig undersøgelse af den kliniske effekt af neurotransplantation hos patienter med Parkinsonisme. Patienter i den første gruppe blev transplanteret med embryonalt nervevæv, der producerede dopamin, mens den anden gruppe af patienter blev underkastet en falsk operation. Resultaterne viser nul kliniske effektivitet af en sådan neurotransplantation, til trods for at dofaminprodutsiruyuschie embryonale neuroner overlevede i recipienterne hjernen. Desuden efter 2 år efter transplantation af føtalt neuralt væv i 15% af patienterne udviklede persisterende dyskinesi, som er fraværende i patienter i placebogruppen (Stamceller: videnskabelige fremskridt og fremtidige forskningsretninger Nat Inst, of Health USA ...). Observationer af den videre udvikling af sygdommen hos disse patienter fortsætter.

Nogle forfattere tilskriver modstridende litteratur om evaluering af kliniske virkningsfuldhed neurotransplantation data med en anden tilgang til udvælgelsen af patientforeninger, utilstrækkelig valg af objektive metoder til vurdering af deres tilstand og, vigtigst, forskellige angår udviklingen af fostrets nervevæv og i forskellige dele af hjernen, hvorfra stoffet blev produceret i forskellige størrelser transplantation og metodiske træk ved kirurgi.

Det skal bemærkes, at forsøg på at dirigere transplantation af pluripotente embryonale stamceller i striatale område af hjernen hos rotter med eksperimentel krop gemiparkinsonizmom ledsaget ESC proliferation og deres differentiering til dopaminerge neuroner. Det må antages, at de nyligt dannede neuroner effektivt indbygget i neuronale netværk som økonomiske og sociale råd efter transplantation blev observeret korrektion af unormal adfærd og motorisk asymmetri i apomorphintesten. På samme tid døde nogle af dyrene på grund af transformation af transplanteret ESK i hjernetumoren.

Eksperter fra US National og Medical Academy, specialister i National Institutes of Health mener, at det kliniske potentiale hESCs fortjener seriøs opmærksomhed, dog insistere på behovet for en detaljeret undersøgelse af deres egenskaber, sandsynligheden for komplikationer og langtidseffekter i eksperimenter med passende biologiske modeller for humane sygdomme (Stamceller og fremtidig regenerativ medicin National Academy Press, stamceller og fremtidige forskningsvejledninger., Nat. Inst, of Health USA).

Ud fra dette synspunkt er det vigtigt, at den sammenlignende histologisk analyse af eksperimentel teratom opnået ved transplantation i testis gyllevogne PGC'er med teratomer, der har udviklet på grund af transplantation tidlige embryon, som omfattede også til stede ESC viste, at ESK uanset deres oprindelse eller interaktion med af de eller andre omgivende celler på samme måde realiserer deres tumorigeniske potenser. Det viste sig, at sådanne teratomer har en klonal oprindelse, som fra en tumor økonomiske og sociale råd kan forekomme, bestående af derivater af alle tre kimlag (.Rega, 2001). Det er bemærkelsesværdigt, at når de transplanteres ind i immundefekte mus klonede PGC'er med normal karyotype og dannede teratomer bestående af en række forskellige typer af differentierede somatiske celler. Disse eksperimentelle data er det perfekte bevis på teratomens klonale oprindelse. Fra perspektivet af udviklingsmæssige biologi, antyder de, at det ikke er multiplum af engagerede progenitorceller og pluripotente stamcelle identitet er kilden af differentierede derivater af alle tre kimlag, teratoma komponenter. Men i de praktiske celletransplantationstjenester Resultaterne af disse undersøgelser er, om ikke uoverkommelige, så en advarselstegn om potentielle fare, eftersom podning ESC eller primordiale kimceller i forskellige væv fra voksne immundefekte mus uundgåeligt forårsager udvikling af tumorer fra de transplanterede stamceller. Neoplastisk degeneration ektopisk transplanteret ESC ledsaget af fremkomsten af satellit populationer af differentierede celler - ved delvist differentiere er helt sikkert økonomiske og sociale råd og progenitor kloner dedikerede linjer. Det er interessant, at de transplanterede hESCs i skeletmuskelceller nær teratokartsinomnymi neuroner danner oftere. Men i administrerer PGC'er Mace æg eller blastocyst ledsaget af fuld integration i kimceller uden dannelse af neoplastiske celler. Samtidig ESC indlejret i næsten alle organer og væv i fosteret, herunder seksuel rudiment. Sådanne allofennye dyr blev først fremstillet ved at underkaste teratocarcinom celle 129 i de tidlige stadier af embryoner på 8-100 celler. I allofennyh mus populationer introduceres geterogenomnyh celleafledte donor PGC'er i knoglemarv, tarm, hud, lever og kønsorganer, der gør det muligt at oprette i eksperimentet endda interspecies celle kimærer. Jo mindre tid for tidlige embryon, jo højere procentdel af celle kimærisering, den højeste grad kimærisering observeret i det hæmatopoietiske system, huden, nervesystemet, lever og tyndtarm allofennogo embryo. I den voksne organisme vævet medgørlige kimærisering beskyttet mod udsættelse for immunsystemet af recipienten gistogematicalkie barrierer: transplanterede primordiale kønsceller i testes parenchyma ledsaget af indsættelse af donor stamceller til recipienten væv germenativny lag. Imidlertid ESC transplantation i en blastocyst formation kimære primordium kønsorganer med generation donor primordiale kønsceller ikke forekomme. ESC pluripotens når giver særlige betingelser og kan anvendes til kloning: ESC transplantationssystemerne mus 8-16-celle museembryo, cellemitose hvori tsitokalazinom blokeret, bidrager til normal embryogenese med udviklingen af embryo donor PGC'er.

Følgelig et alternativ er transplantation af allogen ESC terapeutisk kloning baseret på somatiske cellekerner transplantation i en udkernet oocyt at skabe en blastocyst indre cellemasse fra der herefter bliver tildelt linje af genetisk identiske donor PGC'er somatisk nucleus. Teknisk set denne idé er muligt, da muligheden for oprettelse af hESC linjer fra blastocyster opnået efter transplantation af somatiske cellekerner i tømte ægcelle gentagne gange vist i forsøg med laboratoriedyr (Nagy, 1990; Munsie, 2000). Navnlig i mus homozygote for mutationen rag2, fibroblaster opnås ved dyrkning subepidermal vævsceller blev anvendt som donornuclei transplanteres ind udtagne oocyter. Efter aktivering oocytter "zygote" dyrket indtil blastocyst-dannelse, fra den indre cellemasse er isolerede PGC'er og lade dem passere ind i en linje for de mutante gen nullizigotnyh celler (rag2 ~ / ~). Ved homolog rekombination i sådanne ESC'er blev mutationen af et allel gen korrigeret. I den første serie eksperimenter fra hESCs udvundet rekombinant gen embryoide legemer blev fremstillet, transficerede celler deraf med en rekombinant retrovirus (HoxB4i / GFP) og efter opformering i mus injiceret vene rag2 ~ / ~. I den anden serie blev tetraploidblastomerer aggregeret med genetisk modificerede ESC'er og transplanteret til deres kvindelige modtagere. De fødte immunokompetente mus fungerede som knoglemarvdonorer til transplantation til mutantmus rag2 ~ / ~. I begge serier var resultatet positivt: i løbet af 3-4 uger viste alle modne mus at have normale normale myeloid- og lymfoide celler i stand til at producere immunoglobuliner. Således kan transplantation i oocytten kerner af somatiske celler anvendes ikke kun til at producere hESC linjer, men også for tsitogenoterapii - Korrektion af arvelige abnormiteter under anvendelse ESC som en vektor til transport korrigere genetisk information. Men i denne retning af celletransplantation er der foruden bioetiske problemer begrænsninger. Det er ikke klart hvor sikkert transplantation ville være terapeutisk klonede celler med en genotype identisk genotype en bestemt patient, fordi sådanne celler kan introducere mutationer, der skaber en prædisposition for visse sygdomme. Normale humane æg forbliver utilgængelig objekt, mens selv når transplantere somatiske kerner i udskrællet dyr oocyt kun 15-25% manipuleret "zygote" udvikler til blastocyststadiet. Det er ikke bestemt, hvor meget blastocyst der kræves for at opnå en enkelt linje af pluripotente klonede ESC'er. Det skal bemærkes og høje finansielle omkostninger forbundet med kompleksiteten af den terapeutiske kloningsmetode.

Afslutningsvis i ESC pluripotens genomet hypomethyleres DNA kombineret med høj telomeraseaktivitet og korte C ^ cellecyklusfase, hvilket sikrer en intensiv og potentielt uendelig multiplikation, hvorunder PGC'er fastholde diploide kromosomer og "unge" sæt af fænotypiske karakteristika. Klonal vækst af PGC'er i kultur udelukker ikke dem differentiere til enhver specialiseret celle af organismen på et stop linje proliferation og tilsætte passende regulerende signaler. Begrænsning differentiering af hESCs på linje in vitro somatisk celle realiseres uden deltagelse af mesenchymet, uden Nohteyaov, er organogenese og uden dannelse af embryoet. Ektopisk in vivo indgivelse PGC'er uundgåeligt fører til dannelsen teratocarcinom. ESC transplantation i en blastocyst eller tidlig embryo ledsaget af deres integration med væv fra embryonet og dets stabile kimæriseringsprocedurer organer.

Regenerative og plast teknologier baseret på celle transplantation er skæringspunktet af interesserne for medlemmer af cellebiologi, udviklingsmæssige biologi, eksperimentelle genetik, immunologi, neurologi, kardiologi, hæmatologi, og mange andre områder af eksperimenterende og praktisk medicin. De vigtigste eksperimentelle resultater viser muligheden for at omprogrammere stamcellerne med retningen af ændring af deres egenskaber, som åbner op udsigter til styring cytodifferentiation processer med vækstfaktorer - for myocardial regeneration, restaurering af CNS læsioner og normalisering af funktion af ø apparat i bugspytkirtlen. Imidlertid er den udbredte introduktion transplantationssystemerne derivater ESC i medicinsk praksis, nødvendigt at undersøge egenskaberne af humane stamceller i flere detaljer og yderligere forsøg med PGC'er i eksperimentelle modeller af sygdomme.

Bioetiske spørgsmål og problemet med afvisning af allogen celle transplantation kunne løse den observerede plasticitet af genomet af regionale voksne stamceller. Den oprindelige information er imidlertid, at når transplantere leveren isolerede og grundigt karakteriseret autologe hæmatopoietiske celler, hvoraf der er nye hepatocytter, der inkorporerer i de hepatiske lobules, bliver nu revideret og kritiseret. Imidlertid offentliggjorte data, at transplantation af neurale stamceller i thymus er dannelsen af nye skud af donor-T-og B-lymfocytter, og transplantation af neurale stamceller i hjernen i knoglemarven fører til dannelsen af hæmatopoietisk kim vedvarende donor myeloide og erythropoiese . Følgelig i voksne organer kan bevares pluripotente stamceller i stand til genom omprogrammering af ESC til kapacitet.

Kilde til økonomiske og sociale råd til medicinske anvendelser forbliver menneskefoster, som forudbestemmer uundgåelighed en ny krydsning af de moralske, etiske, moralske, juridiske og religiøse spørgsmål på oprindelsen af menneskeliv. Opdagelsen af ESC'er gav en kraftig impuls til genoptagelsen af hårde diskussioner om hvor linjen mellem levende celler og materie, substans og personlighed ligger. Samtidig er der ingen universelle normer, regler og love om anvendelse af ESC i medicin, på trods af gentagne forsøg på at skabe og acceptere dem. Hver stat i sin lovgivning løser dette problem alene. For deres vedkommende fortsætter læger fra hele verden med at forsøge at udvikle regenerativ plastikmedicin ud over sådanne diskussioner, primært ved brug af ikke-embryonale stamceller og stamcellernes reserver hos en voksen organisme.

Nogle af historien om embryonisk stamcelleisolation

Terato- (embryo) -celler blev isoleret fra -kartsinomnye spontant forekommende testikulær teratomer musestamme 129 / ter-Sv, spontane ovarie teratomer muselinier Lt / Sv, og fra teratomer, ektopichno kilde blev transplanterede celler eller fostervæv. Blandt de således opnåede terato- stabile muselinjer (embryo) -kartsinomnyh nogle celler er pluripotente, andre blev udsat for differentiering kun i celler af en bestemt type, og nogle har været generelt ude af stand cytodifferentiation.

På det tidspunkt var fokus forskning, der viste en mulig tilbagevenden terato- (embryo) -kartsinomnyh celler til normal fænotype efter deres indførsel i udviklende embryo væv, samt arbejde for at skabe in vitro genetisk modificeret terato- (embryo) -kartsinomnyh celler, ved hjælp af hvilke mutante mus blev opnået til biologisk modellering af arvelig patologi fra mennesker.

Konditioneret suspensionskultivering blev anvendt til at isolere linierne af terato-embryo-carcinomceller. I kultur terato- (embryo) -kartsinomnye celler, ligesom økonomiske og sociale råd, vokse til dannelse af embryoide legemer og kræver at blive omsat til en linje bindende dissociation opretholde pluripotens på et fødelag af embryonale fibroblaster eller suspension dyrkning i konditionerede medier. Terato- pluripotente celler (embryo) - carcinomlinier store, kugleformede, har en høj aktivitet af alkalisk phosphatase, danner aggregater og er i stand til flerstrenget differentiering. Når den indføres i en blastocyst aggregeres med morulae, hvilket resulterer i dannelsen af kimære embryoer, i de forskellige organer og væv som derivater er fundet terato- (embryo) -kartsinomnyh celler. Men langt de fleste af sådanne kimære embryoner dør i livmoderen, og i organer overlevende kimærer nyfødte fremmede celler og sjældent påvises med en lav densitet. Samtidig indtræder forekomsten af tumorer (fibrosarcoma, rhabdomyosarcoma, og andre typer af maligne hævelse og adenom Pancreas) stiger skarpt, og neoplastisk degeneration ofte selv i utero kimære embryoer.

De fleste af terato-embryo-carcinomcellerne i mikromiljøet af normale embryonale celler erhverver næsten naturligt maligne neoplastiske egenskaber. Det antages, at irreversibel malignitet skyldes aktiveringen af proto-onkogener i processen med strukturelle omlejringer. En undtagelse er cellelinierne embriokartsinomnoy sst3, teratom afledt fra murin testis (line 129 / Sv-ter), der udviser en høj evne til at integrere ind i væv og organer fra fosteret uden efterfølgende dannelse af tumorer i kimære mus. Derivater af terato-embryo-carcinomcellelinier i chimera-muser deltager næsten ikke i dannelsen af primære gonocytter. Naturligvis er det forbundet med en høj frekvens af kromosomafvigelser fælles for de fleste terato- (embryo) -kartsinomnyh linier, hvor celler observeret som aneuploidi eller kromosomal anomali.

I laboratoriet blev der opnået flere stabile linjer af humane terato-embryo-carcinomer, karakteriseret ved pluripotens, høj proliferativ aktivitet og evnen til at differentiere med vækst i kulturer. Især blev linjen af humane terato-embryo-carcinomceller NTERA-2 anvendt til at studere mekanismerne for neural cytodifferentiering. Efter transplantation af celler af denne linje ind i subventrikulærregionen af forræderen af nyfødte rotter blev deres migrering og neuronogenese observeret. Der har været endnu forsøg på at transplantere neuronal terato- opnået ved dyrkning af celler (embryo) -kartsinomnoy linje NTERA-2, til patienter med slagtilfælde, som ifølge forfatterne, der fører til klinisk forbedring af sygdommen. På samme tid blev tilfælde af maligne transplanterede celler i terato-embryo-carcinomlinjen NTERA-2 ikke observeret hos patienter med slagtilfælde.

Den første linje af udifferentierede pluripotente embryonale stamceller fra mus i de tidlige 80-erne af det sidste århundrede fik Evans og Martin, ved at vælge dem fra den indre cellemasse af en blastocyst - embryoblast. De isolerede ESC-linjer har i lang tid bevaret pluripotency og evnen til at differentiere i forskellige typer celler under påvirkning af faktorer i et specielt kulturmedium.

Udtrykket "embryonale pluripotente stamcelle" tilhører Leroy Stevens, at undersøgelsen af tobak tjære indvirkning på hyppigheden af tumorudvikling gjorde opmærksom på spontane testikel teratocarcinom af lineær (129 / v) af mus i kontrolgruppen. Testikulære teratocarcinomaceller blev karakteriseret ved en høj proliferationshastighed, og i nærvær af væske tilbage i bughulen med dannelsen af spontan differentiering af neuroner, keratinocytter, chondrocytter, cardiomyocytter, samt hår og knoglefragmenter, men uden nogen angivelse af en ordnet cytoarchitectonics passende væv. Ved plantning i teratocarcinom cellekultur dyrkes ikke fastgjort til substratet pluripotente kloner og dannede embryoide legemer blev derefter standset og underkastet spontan fission uordnet differentiere til neuroner, glia, muskelceller og cardiomyocytter. Stevens fandt, at teratocarcinom mus 129 / v indeholder mindre end 1% af celler, som kan differentiere til en række af specialiserede somatisk linje, og selv differentiering afhænger af faktorer, der påvirker dem (sammensætning peritonealvæske, produkterne tilsættes til kulturen i modne celler eller væv). Leroy Stevenson antagelse om tilstedeværelsen blandt teratocarcinomaceller embryonale progenitor seksuel kimceller blev bekræftet: suspension embryoblast præimplanteringsembryoer celler i voksne musevæv dannet teratocarcinoma, og adskilt fra dem rene cellelinier efter intraperitoneal administration til recipientdyr havde differentieret til neuroner, cardiomyocytter og andre somatiske kletki derivater af alle tre kimlag. I eksperimenter in vivo transplantation ESK (opnået fra embryoblast men ikke trofoblasten) i museembryoer ved forskellige stadier linier 8-32 blastomer sluttede fødsel af det kimære dyr (ingen tumordannelse) i organer, som detekterer spirer donorvævet. Kimæredannelse blev observeret selv i rækken af kønsceller.

Primære progenitor kønsceller isoleret fra museembryo kim sex, morfologi, immunologiske fænotype og funktionelle egenskaber i overensstemmelse med hESCs afledt teratocarcinom Stevenson og embryoblast. På kimærer født efter indgivelse af hESCs i en blastocyst, allofenny orgel morfogenese kendetegnet mosaik vekslende donor og modtager strukturelle og funktionelle enheder i lever, lunge og nyre. I en række tilfælde observeredes dannelsen af tarmkrypter eller lobuler i leveren, der bestod samtidigt af modtager og donorceller. Imidlertid forekom altid realiseringen af morfogenese ifølge det genetiske program for den art, hvortil modtageren tilhørte, og chimerisme var begrænset udelukkende til det cellulære niveau.

Derefter blev det konstateret, at spredning af hESCs uden cytodifferentiation på et fødelag-afledte mesenchymal-celler (føtale fibroblaster) sker i nærværelse af LIF bindende i selektive næringsmedier, som selektivt giver kun overlevelse af stam- og progenitorceller, mens det store flertal af de specialiserede cellulære elementer dør. Ved hjælp af disse teknikker i 1998 af James Thomson blev tildelt fem udødeliggjort linjer af embryonale stamceller fra den indre cellemasse af en blastocyst person. Samme år, har John Gerhart udviklet en metode til at isolere de udødelige ESC linjer fra seksuel pust på fire-fem-ugers menneskelige embryoner. På grund af sine unikke egenskaber, kun to år senere embryonale stamceller og stamceller endelige væv er begyndt at blive anvendt ved udøvelsen af regenerativ medicin og genterapi.