Embryonale stamceller

Opdagelsen af embryonale stamceller opstod ikke ved en tilfældighed, men på den forberedte grund for videnskabelig forskning inden for udviklingsbiologi. Begrebet "stamcelle" blev introduceret i medicinen i 1908 på kongressen for det hæmatologiske selskab i Berlin af Alexander Maximov i forbindelse med hæmatologiske celler. Længe før isoleringen og produktionen af stabile linjer af pluripotente embryonale stamceller blev stamterato- (embryokarcinom) celler brugt i studier af tidlige udviklingsprocesser, hvorved ukendte mekanismer for embryogenese blev undersøgt, herunder ekspressionssekvensen af tidlige gener og proteinprodukter fra deres aktivitet.

Men går det menneskelige genoms totipotens uigenkaldeligt tabt i evolutionsprocessen? Nej, og embryogenesen er bevis på dette. Hvis dette er tilfældet, hvornår vil den anden evolutionære udviklingsvej så i princippet blive realiseret? Sandsynligvis når mennesket træder ind i rummet, hvor miljøforholdene vil være relativt konstante i tilstrækkelig lang tid. Tabet af knoglevæv (demineralisering af knogler i en vægtløs tilstand), som meget langsomt genstand for ombygning og regenerering, kan betragtes som det første skridt i menneskets tilpasningsproces som art til eksistens i rumforhold. Prisen for den anden evolutionære udviklingsvej vil dog være anderledes - prisen for tilbagevenden af totipotens og absolut plasticitet til alle celler vil være sterilitet. Så i denne verden af "evolutionære kamæleoner" bliver vi nødt til at reproducere os uden meiose ved knopskydning. Men vi vil leve længe. Telomerase-udødelighed er en amøbes udødelighed. I en flercellet organisme er stamceller substratet for kvantitativ og kvalitativ levetid.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ]

Kilder til embryonale stamceller

I dag er kilderne til embryonale stamceller til laboratorieforskning museteratocarcinomlinjer (129/sv, F19, F8, Zin 40, CGR 86, Rl, CCE, JM-1, E14TG2a, CGRSb) og humant teratocarcinom (NTERA-2, TERA-2, H-9 klon), samt Trauneon ESC-linjer. Tilgængeligheden af et detaljeret cellepas, der angiver immunfænotypen, resultater af kromosomanalyse, mRNA-ekspressionsprofiler, eksponerede receptorer og intracellulære signalproteiner, kompenserer dog ikke for de betydelige mangler ved teratocarcinom ESC-linjer - hurtigt tab af totipotens og umuligheden af at bruge dem i kliniske forsøg, mens blandet differentiering i kultur gør det meget vanskeligt at isolere en ren specialiseret linje fra en heterogen cellepopulation. Derfor er kilden til ESC-linjer, der er skabt til kliniske formål, normalt blastocystens indre cellemasse, individuelle blastomerer fra 8-celle-embryoner, morulaceller fra senere stadier samt primordiale kimceller.

Det skal bemærkes, at teratocarcinomceller, selvom de har pluripotens, er karakteriseret ved et signifikant lavere pluripotent potentiale sammenlignet med ESC'er. Deres integration med embryonale celler fører sjældent til dannelsen af kimærer, som desuden aldrig danner gameter med genotypen af teratocarcinomceller. Det menes, at dette skyldes den hyppige forekomst af kromosomale abnormiteter under dyrkning af teratocarcinomceller: tab af Y-kromosomet, forskellige trisomier, deletioner eller translokationer.

Der er gjort gentagne forsøg på at isolere en human ESC-linje, men denne opgave er ikke blevet løst, da normale humane blastocyster er vanskelige at få adgang til. Derudover er hyppigheden af kromosomafvigelser hos mennesker højere end i dyreembryogenese. Langt de fleste tidlige humane embryoner opnået efter in vitro-fertilisering udviser kaotisk kromosomal mosaicisme og har ofte numeriske og strukturelle afvigelser. Selv senere, på blastocyststadiet, består kun 20-25% af humane embryoner af celler med en normal karyotype. Det var praktisk talt umuligt at bruge sådanne embryoner til at skabe ESC'er, da zygoter normalt blev dyrket til to- eller fireblastomerstadiet og derefter transplanteret i livmoderen. Først relativt nylig er der blevet udviklet en pålidelig teknik til dyrkning af befrugtede humane æg til blastocyststadiet. Introduktionen af denne teknik i praksis med in vitro-fertilisering har ikke kun øget hyppigheden af succesfulde implantationsresultater, men har også gjort normale blastocyster til et mere tilgængeligt objekt.

En anden pluripotent stamcellekilde er de primordiale kimceller, som i modsætning til de mere avancerede progenitorpopulationer af germinalepitelet ikke har beta-integrin på deres overflade, men udtrykker høj aktivitet af alkalisk fosfatase. Det skal bemærkes, at populationer af stamceller, der er dannet fra primordiale kimceller, er blevet undersøgt eksperimentelt siden 1980'erne. På det tidspunkt blev der udviklet en teknik til at isolere primordiale kimceller fra rudimentet af museembryoets gonade. De første mislykkede resultater af dyrkning af primordiale kimceller in vitro antydede, at disse forsøg var nytteløse, da cellerne, selvom de overlevede, ikke prolifererede og døde inden for den første dag. Det blev senere fastslået, at muse-primordiale kimceller kun reproducerer sig in vitro i nærvær af opløselige og membranbundne specifikke polypeptidvækstfaktorer i dyrkningsmediet. Resultaterne af talrige undersøgelser har vist, at tilstedeværelsen af ikke kun LIF, men også membranbundne og opløselige stålfaktorer (SIF) i dyrkningsmediet er nødvendig for overlevelse og proliferation af primære kimceller. Disse peptider produceres af somatiske celler fra embryoner, der er homozygote for Steel-mutationen, og en af dem er en ligand af cKit-proto-onkogenet.

Primære kimceller hos pattedyr og mennesker har en ekstragonadal oprindelse og er kilden til klonal udvikling af kimcellelinjen. Oprindelsen til den primordiale kimcellelinje, såvel som alt embryonalt væv og den ekstraembryonale mesoderm, er epiblasten (primær ektoderm) fra tidlige embryoner, som har en mosaikstrukturel organisation. Ved hjælp af metoden med mikrokirurgisk fjernelse af forskellige dele af det tidlige embryo blev en lokaliseringszone i epiblasten af klonen af engagerede forstadier til primordiale kimceller etableret. Ved hjælp af rhodamindextran, der blev brugt som cellemarkør, blev det fastslået, at forstadierne til primordiale kimceller er lokaliseret i den proximale region af epiblasten, nær den ekstraembryonale ektoderm. Den primordiale kimcellelinje stammer fra en 45-cellet klon, hvis allokering sker i begyndelsen af gastrulationen. Derefter segregerer klonen, og under gastrulationen trænger de primære kimceller ind i den ekstraembryonale mesoderm og findes ved bunden af allantois-rudimentet, bag den primære stribe. Derfra migrerer de primære kimceller mod den ventrale del af bagtarmendodermen og bevæger sig derefter aktivt langs mesenteriet, hvor de fylder kønskanterne ved afslutningen af migrationen. Under migrationen, såvel som i de første 2-3 dage efter lokalisering i gonadens rudiment, prolifererer de primære kimceller aktivt og gennemgår otte replikationscyklusser. Hvis der ved begyndelsen af migrationen er omkring 50 primære kimceller, overstiger antallet af primære kimceller 25.000 i kønskanterne hos musefostre med tolv dages udvikling.

Den funktionelle lighed mellem ESC'er og primordiale kimceller fremgår af sidstnævntes fuldstændige integration i blastocysten med udskiftning af den interne cellemasse og efterfølgende fuldgyldig udvikling af embryoet, hvis væv kun består af efterkommere af de primordiale kimceller. I andre egenskaber viste musens primordiale kimceller sig også at være identiske med ESC'er, hvilket demonstrerer evnen til at differentiere i en række forskellige retninger, til at danne embryoide legemer in vitro og til at danne teratomer in vivo, når de administreres subkutant til immundefekte mus, hvilket ligner spontane testikelteratomer hos 129/ter-mus.

Det blev konstateret, at når LIF, membranbundet og opløselig SIF tilsættes mediet, overlever og reproducerer isolerede primære kimceller fra 8 dage gamle musefostre sig i kulturen i 4 dage, men dør derefter. Desuden falder den periode, hvor primære kimcellers død observeres i kulturen, sammen med udviklingsstadiet af musefostre (12,5-13,5 dage), hvor hunlige primære kimceller går ind i meiose i kønskirtlernes rudimenter, og mitotiske deling blokeres i hanlige primære kimceller. Men hvis ikke kun vækstfaktorerne LIF og SIF, men også FGF2 tilsættes mediet, fortsætter de primære kimceller med at proliferere, og kolonier af celler, der er i stand til at formere sig, selv efter fjernelse af vækstfaktorer (SIF og FGF) fra mediet, dannes i subkulturerne. Sådanne celler kan dyrkes i lang tid på et substrat af embryonale fibroblaster uden at tilsætte den opløselige vækstfaktor LIF. Det blev foreslået at kalde disse stabile cellelinjer opnået fra primordiale kimceller for embryonale kimceller. Dette udtryk er slet ikke vellykket, da det er umuligt at opnå embryonale kimceller, der er i stand til at udføre efterfølgende stadier af oogenese eller spermatogenese, når man dyrker EG-celler. Dette skyldes, at EG-cellelinjer, selvom de stammer fra primordiale kimceller, mister evnen til at binde sig til kimlinjer, når de erhverver egenskaberne af embryonale pluripotente stamceller i kultur. Med andre ord mister primordiale kimceller, når de dyrkes, egenskaberne af gametforløbere og transformeres til ESC-lignende pluripotente celler.

Det er blevet bemærket, at teratomer ikke opstår, når EG-celler introduceres i immundefekte mus. Det antages, at tabet af humane EG-cellers evne til at give anledning til teratomer skyldes, at disse linjer ikke blev skabt direkte fra dyrkede primære kimceller, men blev opnået fra celler isoleret fra embryoide legemer. Det er derfor muligt, at de er efterkommere af pluripotente, men allerede dedikerede celler.

Det skal bemærkes, at der er fundamentale forskelle mellem EG-celler og primordiale kimceller. Sidstnævnte tillader ikke at opnå kimære museembryoner, hvilket indikerer primordiale kimcellers manglende evne til at integrere sig i den indre cellemasse eller trofektoderm. Karakteristikaene for den primordiale kimcellepopulation ligner mere dedikerede linjer af somatiske celler fra senere embryoner, hvis introduktion i blastocysten heller ikke fører til dannelsen af kimære embryoner.

Modifikation af teknikken til dyrkning af embryoide legemer opnået ved aggregering af EG-celler gjorde det muligt at opnå en anden population af pluripotente celler, kaldet "embryoide kropsafledte celler" (EBD-celler), ved hjælp af selektion på selektive medier. EBD-cellers evne til at proliferere i kultur over lang tid gjorde det muligt at skabe stabile cellelinjer af engagerede celler. Kloner af celler, der udtrykker en bred vifte af mRNA- og proteinmarkører fra specialiserede celler, blev opnået. Denne tilgang beviste i sidste ende, at humane primære kimceller er pluripotente og differentierer in vitro til forskellige celletyper: neuroner, neuroglia, vaskulært endotel, hæmatopoietiske celler, muskel- og endodermale celler.

Alternative kilder til embryonale stamceller

En alternativ kilde til humane ESC-linjer kan være hybridceller. Implantation i livmoderen hos pseudo-drægtige køer af en heterogen konstruktion opnået ved fusion ved elektroporation af somatiske celler fra det menneskelige foster med et koæg, hvorfra pronukleusen tidligere er fjernet, gør det muligt at opnå en intern cellemasse fra et kunstigt embryo i præimplantationsstadier. Til dette formål opnås i det første trin en blastocyst fra et koæg med en transplanteret human cellekerne.

I andet trin isoleres en embryoblast fra blastocysten, og derfra isoleres ESC'er ved hjælp af Thomson-metoden. Det er bemærkelsesværdigt, at de bedste resultater i isoleringen af ESC-linjer ved hjælp af denne metode blev opnået ved hjælp af kerner af follikulære celler eller primære kønsceller, der forbliver i den menneskelige krop i dvaletilstand. Dette skyldes, at kernerne i humane celler transplanteret i et koæg skal have ikke-forkortede telomerer og høj telomeaseaktivitet, hvilket hjælper med at undgå for tidlig ældning af ESC-kloner opnået fra et hybridæg (Repin, 2001). Det er kendt, at de vigtigste intracellulære markørproteiner for ESC'er er Oct3, Oct4, Tcf, Groucho, som tilhører de såkaldte kromatin-silencerproteiner. Silencers giver en særlig kompakt pakke af heterochromatin, som forhindrer dannelsen af eukromatin-løkker. Kromatinpakning medieret af disse proteiner korrelerer med ESC-genomets totipotens. Det er hidtil blevet fastslået, at modne bovine og humane oocytter er den eneste type specialiserede celler, der indeholder høje koncentrationer af silencerproteiner i cytoplasmaet. På dette grundlag blev der udviklet en metode til at opnå hybride ESC'er ved at overføre somatiske cellekerner til enukleerede bovine oocytter. Foreløbige in vitro-studier har vist, at cytoplasmaet i bovine oocytter genopretter totipotensen af det humane somatiske cellekernegenom efter 12-24 timers dyrkning.

Af særlig interesse er data om de særlige forhold ved præimplantationsudviklingen af humane embryoner, hvilket indikerer en senere erstatning af totipotente celler med en population af pluripotente celler end hos mus. En undersøgelse af cellulære transformationer viste, at trofoblastceller også opstår fra cellerne i den indre cellemasse af humane blastocyster, udover ESC'er, hvilket indikerer deres samlede potens.

Det er kendt, at der i blastocyststadiet opstår to forskelligt engagerede cellepopulationer. En af dem danner blastocystens ydre lag - trophectodermen, hvis derivater er trofoblastcellerne og andre embryonale komponenter i placenta. Den anden population af celler grupperes i en tæt masse, der er i kontakt med trophectodermens indre overflade. Derivaterne af populationen af celler i den indre cellemasse er alle væv og rudimenter af embryonets organer. I det sene blastocyststadium dannes den ekstraembryonale endoderm fra den indre cellemasse, og epiblasten (primær ektoderm) dannes. I dette tilfælde bevarer epiblastcellerne pluripotens, mens evnen til at differentiere celler i den ekstraembryonale endoderm er begrænset.

[ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ], [ 11 ]

Indhentning af humane embryonale stamceller

Indtil for nylig troede man, at det var umuligt at udvinde ESC'er fra trofoblast. Imidlertid prolifererer en linje af diploide trophectoderm-stamceller isoleret fra en blastocyst og transformerer sig til stamceller i et medium, der indeholder FGF2 og heparin i stedet for LIF. Hvis FGF2 fjernes fra mediet, stopper trophectoderm-cellerne med at formere sig, kromosom-endoreduplikation begynder i dem, og trophectoderm-cellulære elementer transformerer sig gradvist til kæmpetrofoblastceller. LIF stimulerer sandsynligvis ikke trophectoderm-celleproliferation på grund af det faktum, at FGF2 udløser en anden transsignalmekanisme, da FGF2, der binder sig til plasmareceptoren (FGFR2), aktiverer MAP-kinaser i cytoplasmaet - ERK1 og ERK2. Når en signalvej (LIF - gpl30 - JAK kinase - STAT3) aktiveres i blastocystceller, transformeres cellerne i den indre cellemasse til pluripotente ESC'er, og når den anden mekanisme for transmembran signaltransduktion (FGF2 - FGFR2 - MAP kinase ERK1/ERK2) aktiveres, dannes trofektoderme stamceller i blastocysten. Valget af signalvej afhænger igen af aktiviteten af oct4-genet. Dette gen, som tilhører POU-domænet, er placeret i t-locus af autosom 17 og udtrykkes under oogenese, under spaltningsperioden, såvel som i cellerne i blastocystens indre cellemasse og i de primære kønsceller. oct4-genets funktionelle rolle er at kode for en transkriptionsfaktor, der er nødvendig for fremkomsten af pluripotente celler, deres differentiering og dedifferentiering.

Ekspressionen af oct4-genet i ESC'er varierer afhængigt af denne transkriptionsfaktors interaktion med cofaktorer. Målrettet regulering af oct4-ekspression i blastocyster viste, at når dens aktivitet reduceres, danner halvdelen af cellerne trofektoderm, hvorimod når den inducerede ekspression af oct4 øges, opstår der overvejende ESC'er.

I eksperimentet kan ESC'er ikke overføres til en linje under dyrkning af totipotente blastomerer i kløvningsstadiet, såvel som i gastrulationsstadiet og senere stadier af embryonal udvikling. Muse-ESC'er isoleres normalt på 3,5-4,5 dage af graviditeten, hvilket svarer til det sjette stadie (enkeltlagsblastocyst) og syvende stadie (tolagsblastocyst - tidlig ægcylinder) af normal embryogenese. Det er klart, at musefostre kun indeholder cellepopulationer, der er i stand til at transformere til ESC'er. Følgelig er isolering af ESC-linjer kun mulig på visse stadier af embryogenesen. Zygoten og blastomererne, der opstår under kløvningen, er totipotente, set fra muligheden for at udvikle et levedygtigt embryo med embryonale membraner og placenta. Tabet af kønscellernes samlede potens begynder i det sene morulastadium, hvor yderligere engagement af blastomerer afhænger af deres placering. Tidlige morula-blastomerer bevarer totipotens, da eksperimentelle manipulationer med ændringer i deres lokalisering, såsom inversion af deres placering, ikke forhindrer udviklingen af et fuldgyldigt embryo.

Det er blevet fastslået, at effektiviteten af at isolere ESC'er i en linje påvirkes af blastocysternes tilstand på tidspunktet for deres eksplantation. Brugen af blastocyster efter modellering af en syv-dages diapause i reproduktionskanalen hos mus, der er ovariektomiseret på den 3,5. drægtighedsdag og givet progesteron, letter en mere vellykket isolering af embryonale stamcellelinjer. Det antages, at antallet af blastomerer, der danner den indre cellemasse, stiger under sådanne forhold. Det er også muligt, at cellecyklussen forlænges, og at de fleste blastomerer går ind i G0-fasen.

Derudover afhænger skabelsen af stabile pluripotente ESC-linjer af embryonernes genotype: ESC'er isoleres forholdsvis let fra blastocyster fra 129-muselinjen, de er meget vanskeligere at opnå ved hjælp af CS7BL/6-mus, og det er praktisk talt umuligt at isolere en ESC-linje fra blastocyster fra CBA/Ca-mus. Tidlige embryoner har naturligvis nogle genetiske træk, der påvirker udviklingen af en pluripotent ESC-linje. Ikke desto mindre blev ESC-linjer isoleret fra tidlige embryoner af CBA/Ca-mus ved dyrkning af isolerede epiblaster, såvel som ved selektiv selektion af differentierende celler.

En dokumenteret standardteknik til at opnå ESC-linjer fra blastocyster findes i laboratoriemanualer om teknikken til eksperimenter med tidlige embryoner. Eksperimentelle ESC-linjer kan også opnås ved at dyrke isoleret epiblast (primær ektoderm) fra 4,5 dage gamle museembryoner ved hjælp af en ret kompleks mikrokirurgisk teknik og modificerede dyrkningsbetingelser. Arbejdsintensiteten ved denne procedure er berettiget, da hyppigheden af ESC-linjedannelse i dette tilfælde viste sig at være betydeligt højere end i arbejde med blastocystens indre cellemasse.

For at isolere ESC-linjer overføres hver klon til en mikrobrønd, et aggregat på 40-60 celler dyrkes og dispergeres derefter igen. Flere gentagelser af denne procedure giver os mulighed for at opnå en immortaliseret ESC-linje med den maksimale proliferationshastighed for normokaryotypiske celler bundet til plastik, som bevarer totipotens og høj telomeraseaktivitet efter 50-100 passager. I processen med at opretholde ESC-linjer er den største fare kontaminering af mediet eller serumet med bakterielle endotoksiner - selv sporkoncentrationer af endotoksin i dyrkningsmediet forårsager massedød af umodne kimceller. Med omhyggelig overvågning af lineær vækst og rettidig dispersion er ESC'er i kultur i stand til symmetrisk deling, hvor begge datterceller forbliver pluripotente og i stand til at udføre et ubegrænset antal cellecyklusser, samtidig med at de opretholder en diploid karyotype og total potens.

Selektion af en ren population af humane ESC'er kan udføres efter transfektion af deres genom med rekombinante DNA-molekyler, der indeholder genet, der koder for syntesen af grønt fluorescerende protein (GFP). GFP-ekspression øges, når ESC'er dyrkes under betingelser, der understøtter deres proliferation, hvorimod ekspressionsniveauet af dette gen falder med differentieringens begyndelse, hvilket muliggør selektion af rene stabile pluripotente cellelinjer på et selektivt medium. Ved dyrkning af ESC'er isoleret ved hjælp af GFP-selektion øges hyppigheden af kolonidannelse mange gange, da den kraftige antiproliferative effekt af differentierede celler elimineres under betingelserne for selektionskulturer.

Translationen af humane embryonale stamceller til en linje udføres ved hjælp af metoden med deres isolering fra præimplantationsembryoner (på stadiet 80-120 celler), som er tilbage efter in vitro-fertiliseringsproceduren. Til dette formål dispergeres kunstigt opnåede "overskydende" embryoner mekanisk i Delbecco-Eagle-mediet. Efter mærkning af cellerne med selektive monoklonale antistoffer med et fluorescerende mærke isoleres embryoblastcellerne. Embryoblasten dispergeres i individuelle celler ved hjælp af en dispase-kollagenase-blanding. De dissocierede celler dyrkes i et specielt medium (80% Delbeccos medium + 20% føtalt kalveserum i nærvær af 500 μg/ml IL-6, LIF og SCF) over et feeder-monolag af embryonale fibroblaster fra de første 3 passager. I dette tilfælde opretholdes overlevelsen og proliferationen af stam- og progenitorceller på grund af effekten af IL-6, LIF og SCF. I et sådant medium vokser ESC'er som suspensionskloner af ikke-fastgjorte, sammenknyttede celler, som skal dissocieres ved blød, gentagen pipettering. Nye kloner fremkommer i den suspenderede kultur på 5.-7. dag. Den maksimale vækstrate for ESC'er opnås ved gentagen dissociation af kloner i stadiet med 10-15 celler. Derefter overføres hver klon til en mikrobrønd og dyrkes til et aggregat på 40-50 celler. Proceduren gentages mange gange i passager, hvilket øger kulturens volumen til en tæthed på 5-10 millioner celler pr. 6 cm skål. Ved hjælp af sådan passagering isolerede Thomson 10 udødelige kloner af humane ESC'er, som efter 100 passager bevarede høj telomeraseaktivitet, evnen til kraftig proliferation, minimale fænotypiske egenskaber og total potens med evnen til at differentiere til enhver af 350 specialiserede cellelinjer afledt af ekto-, meso- og endoderm. Differentiering af humane ESC'er begyndte (ved mediumskift, tilsætning af serum og eliminering af LIF) med cellebinding til substratet, hvilket indikerer udviklingen af cytoskelettet og ekspressionen af adhæsionsreceptorer. Vigtigt er det, at humane ESC'er med ubegrænset proliferation bevarede en normal karyotype.

Den anden metode til isolering af humane ESC-linjer er baseret på brugen af primære kønsceller. Eksperimentelle undersøgelser har vist, at E-cellelinjer kan udvindes fra kønsfolderne på 12,5 dage gamle musefostre. I disse tilfælde var hyppigheden af dannelsen af progenitorcellelinjer dog signifikant lavere end i eksperimenter med tidligere embryoner. Samtidig er primære kønsceller fra gonaderne hos musefostre med en gestationsalder på 13,5 dage slet ikke i stand til at transformere sig til linjer.

De første stabile linjer af pluripotente humane EG-celler blev opnået fra primære gonocytter isoleret fra gonaderne fra 5-9 uger gamle embryoner. De isolerede celler blev dyrket på et substrat af inaktiverede museembryonale fibroblaster i DMEM-medium med føtalt serum suppleret med mercaptoethanol, forskolin og rekombinante humane vækstfaktorer (FGF og LIF). Efter 7-12 dage fremkom multicellulære kolonier i kulturen, svarende til humane EG-celler ved morfologiske træk og molekylære markører. Efter aggregering dannede disse celler embryoide legemer, med hvis videre udvikling specialiserede celler, der var karakteristiske for derivater af alle tre kimlag, fremkom. I løbet af 10-20 passager beholdt EG-cellelinjerne en normal karyotype og mistede ikke pluripotens.

Det er også blevet vist, at den kombinerede virkning af LIF, membranbundne og opløselige stålfaktorer og TGF-b ændrer udviklingsprogrammet for primordiale kimceller. I stedet for at ophøre med mitotiske delinger og begynde at differentiere mod oogenese eller spermatogenese, fortsætter primordiale kimceller med at proliferere. Efter flere yderligere mitotiske cyklusser bliver de lig epiblastceller, og mister egenskaberne som kimcelleforløbere og transformeres til pluripotente embryonale stamceller (EG).

I 1998 blev der således for første gang isoleret udødeliggjorte linjer af primordiale kimceller fra det genitale rudiment af humant føtalt obduktionsvæv. I human embryogenese optræder primordiale kimceller i blommesækken i 3. udviklingsuge, og i 4.-5. uge migrerer disse celler til den genitale tuberkelzone, hvor de danner hvilende populationer af primære gonocytter. I en inaktiv tilstand bevares primordiale kimceller i embryoet indtil fødslen. Linjer af primordiale kimceller isoleres fra den føtale genitale tuberkel fra 5-9 uger gamle embryoner, hvis ekstraherede væv behandles ex tempore med en blanding af kollagenaser af typerne IV-V, hyaluronidase og DNase for at øge det kvantitative og kvalitative udbytte af celler. Primordiale kimceller i vævet fra den føtale genitale tuberkel er omgivet af stromale (mesenkymale) Sertoli-celler. Sertoli-cellernes funktionelle formål er at producere antiapoptotiske faktorer (Fas-ligand), mitogener og immunsuppressive midler, der beskytter kimceller mod immunangreb fra kroppen. Derudover spiller det stromale mikromiljø i genitaltuberklen en vigtig rolle i modningen af gameter. De isolerede primære kimceller plantes i kultur over et fødestromalt lag bestående af føtale fibroblaster fra de første tre passager. Den mest effektive kombination af mitogener er et kompleks bestående af LIF, FGF og forskolin (en stimulator af cAMP-dannelse). Proliferation af primære kimceller in vitro kræver tilsætning af føtalt serum, i hvis nærvær reproduktionen af primære gonocytter i kultur ledsages af dannelsen af kloner af sfæriske celler, der ikke er bundet til substratet.

På National Institutes of Health i USA blev der på baggrund af en opsummering af eksisterende data om metoder til isolering af humane ESC-linjer fra blastocyster draget en foreløbig konklusion om, at vellykket isolering af ESC'er er mest sandsynlig, når blastocyster med en velformet indre cellemasse dyrkes (Stem cells: scientific progress and future research directions. Nat. Inst, of Health USA). Ud fra dette synspunkt er den optimale kilde til ESC'er til dannelse af linjer humane blastocyster på 5. udviklingsdag, hvorfra trophectodermen forsigtigt bør fjernes, når den indre cellemasse isoleres. Den isolerede indre cellemasse, der på dette stadie består af 30-35 celler, bør dyrkes på et substrat af embryonale musefibroblaster, hvilket er en afgørende betingelse for dannelsen af ESC-kolonier i kultur.

Analyse af fænotypiske egenskaber ved embryonale stamceller

Af særlig interesse er den interspecielle sammenlignende analyse af de fænotypiske træk ved ESC'er. Det blev konstateret, at humane ESC-kolonier er tætte klynger af flade, epitellignende celler, hvorimod museembryoide kroppe består af et løst konglomerat af afrundede celler. I humane ESC'er er kerne-plasma-forholdsindekset lavere end i muse-ESC'er. Embryonale stamceller fra aber danner fladere kolonier af celler med ujævne kanter. Individuelle celler er let synlige i tidlige kloner af primat-ESC'er. Prolifererende ESC'er fra alle undersøgte dyrearter udtrykker ikke MHC klasse I og II molekyler. Samtidig giver humane ESC'er en positiv reaktion på TERA 1-60 og GCTM-2 antistoffer, hvilket indikerer tilstedeværelsen af keratin/chondroitinsulfatproteoglykaner på deres overflade, hvilket er karakteristisk for embryo-(terato)-carcinom stamceller. Ekspression af oct4-genet i ESC'er fra alle dyrearter tyder på, at det samme sæt gener, der er ansvarlige for at opretholde pluripotens, tilsyneladende aktiveres i humane og muse-ESC'er (Peru, 2001), på trods af fænotypiske forskelle. Derudover har ESC-linjer isoleret fra rotte-, svin-, kanin-, primat- og kvægembryoer lignende morfologiske karakteristika, et lignende sæt molekylære identifikationsmarkører og en næsten identisk molekylær mekanisme til implementering af embryogeneseprogrammer, hvilket giver os mulighed for at se på problemet med xenotransplantation med nye øjne.

I modsætning til normal embryogenese in vivo ledsages proliferation af ESC'er in vitro ikke af dannelsen af kimlag og forekommer på baggrund af blokering af homøotiske Hoxgener, dvs. uden organogenese. Da segmenteringsgenerne ikke fungerer, er det umuligt at reproducere sådanne perioder af embryogenese som æglægning af somitter, embryosegmentering, dannelse af blommesækken, allantois og andre provisoriske organer og væv i ESC-kultur. Dyrkede ESC'er synes at være frosset i begyndelsen af processen med dannelse af 350 restriktionslinjer af specialiserede celler. Således repræsenterer en klon af datterprogenitorceller og en centralt lokaliseret ESC kun en model af et embryo, under hvis udvikling forskellige linjer af specialiserede celler dannes samtidigt i forskellige vævsregioner, som dog stammer fra fælles forstadier. På trods af det minimale niveau af receptorer på overfladen af ESC'er bevarer de evnen til at udføre primitive morfogenetiske processer, der imiterer de volumetriske strukturer af et tidligt embryo: en suspension af ESC'er i kulturaggregater og danner strukturer, der ligner blastocyster eller endda senere embryoner (ægcylindre). Sådanne suspensionsaggregater kaldes henholdsvis simple og komplekse embryoide legemer.

Ved blandet differentiering udtrykkes tidlige gener fra ektodermen (oct3, fgf-5, nodal), endodermen (gata-4), mesodermen (brachyury), kardiogen mesodermen (pkh-2.5), neuralrøret (msx3) og hæmatopoiesen (elkf) samtidigt i forskellige celler i samme embryoide legeme. Ved at bruge forskellige kombinationer af vækstfaktorer og cytokiner til målrettet virkning på dannelsen af kimlagsceller in vitro var det i en række tilfælde muligt at opnå embryoide legemer, hvor ektoderm- eller mesodermgener fortrinsvis blev udtrykt, hvilket baner vejen for modellering af gastrulation og de indledende faser af organogenesen.

Klonal vækst af ESC'er er tegn på asymmetrisk celledeling, hvor kun én ESC i midten af klonen bevarer ubegrænset proliferationspotentiale, mens den anden dattercelle genererer en generation af progenitorceller, der allerede undergår differentiering. Derfor er klonproliferationshastigheden i periferien af den embryoide krop højere end i midten. De marginale celler i den voksende klon undergår spontan uordnet differentiering, migrerer eller dør ved apoptotiske mekanismer. Disse begivenheder bestemmer klonens skæbne: Hvis proliferationshastigheden overstiger migrationshastigheden og apoptotisk celledød, fortsætter klonen med at stige i størrelse, stabilisering sker, når apoptosehastigheden og hastigheden for ny celledannelse er ens, og regression sker, når forholdet mellem disse processer er omvendt. Progenitorceller deler sig symmetrisk, dvs. begge datterceller differentierer efterfølgende til modne specialiserede cellelinjer. Forholdet mellem ESC'er og progenitorceller varierer, men antallet af ESC'er er altid kun en brøkdel af en procent af progenitorcellepopulationen. Derfor kan kun omhyggelig pipettering og rettidig disaggregering af kloner øge antallet af ESC'er i kulturen. Disaggregation af kloner på stadiet 10-12 celler viste sig at være mest effektiv til at opnå det maksimale udbytte af ESC'er. Retningen og graden af differentiering af celler i den embryoide krop afhænger af deres placering. De ydre celler i den embryoide krop udtrykker ikke oct4-genet og differentieres til celler i den primære endoderm, hvorfra epitellignende celler i den parietale og viscerale ekstraembryonale endoderm efterfølgende dannes. De indre celler i den embryoide krop udtrykker oct4-genet og bevarer pluripotens i 48 timers dyrkning. Kulturen omstruktureres dog derefter morfologisk til et epitelmonolag, og ekspressionen af gener, der kontrollerer udviklingen af den primære ektoderm, begynder. Derefter begynder processen med total uordnet cytodifferentiering med fremkomsten af forskellige celletyper, der er derivater af alle tre kimlag. I processen med spontan differentiering af cellerne i den embryoide krop er aggregater med endodermmarkører i form af fragmenter (cyster) af blommesækken de første, der optræder. Derefter optræder angioblaster og endotelceller fra de voksende kapillærer i disse strukturer. I de sidste stadier af spontan differentiering udvikles forskellige terminalt differentierede celler fra de indre celler i den embryoide krop, herunder neuroner, gliale elementer, kardiomyocytter, makrofager og erytrocytter. I et vist omfang (under hensyntagen til den rumlige inversion af dannelsen af de germinale vævslag) er det ved hjælp af embryoide legemer muligt at studere morfogenetiske processer in vitro og analysere de molekylære mekanismer i de indledende perioder af embryonal cytodifferentiering,samt at fastslå specifikke geners rolle i implementeringen af disse processer.

Inden for klonen findes der således celler, hvor forskellige genetiske udviklingsprogrammer er blevet opdaget - ESC'er, tidlige progenitorer og differentierende progenitorpopulationer. Dyrkning af ESC'er ved hjælp af hængende dråbe- eller massekulturmetoder uden et fødelag og uden at tilsætte LIF til mediet fører uundgåeligt til dannelsen af embryoide legemer. Morfologien af cellerne i de ydre og indre lag af embryoide legemer er forskellig. Det ydre lag består af store, forgrenede celler. Deres overflade, der vender mod omgivelserne, er dækket af talrige mikrovilli. Det ydre lag af celler er adskilt fra det indre lag af en basalmembran, der ligner Reicherts membran, mens cellerne i det indre lag af embryoide legemer er søjleformet epitel. Morfologisk ligner det indre lag, selvom det indeholder mange delende celler, mere udifferentierede kolonier af ESC'er.

Karakteristika for humane embryonale stamceller

Fraværet af parenkymatøs-mesenkymale signalinteraktioner på baggrund af homøose-genblokering fører til forstyrret vækst af ESC'er i kultur, da dette forstyrrer dannelsen og udviklingen af infrastrukturen for provisoriske organer. Uorganiseret vækst og forstyrret spontan differentiering af ESC'er i kultur skyldes fraværet af mesenkymal markering af det stromale rammeværk i fremtidige organer: in vitro er det fuldt ud muligt at danne millioner af hepatocytter, men det er umuligt at opnå en enkelt leverlap, der inkluderer sådanne strukturelle og funktionelle elementer som sinuser, Disse-rum og Kupffer-celler.

Det menes, at ESC'ernes pluripotens udelukkende realiseres i embryogenesen med dannelsen af embryoets væv og organer, mens placenta og navlestreng er derivater af trofoblasten. ESC'er indesluttet i den trofektodermale membran genererer sekventielt kloner af provisoriske celler, der implementerer udviklingsprogrammet gennem det kombinatoriske mRNA fra Nokhteyovs volumetriske topografiske matrix, som forudbestemmer den rumlige arrangement, form og størrelse, antallet af celler i provisoriske og definitive organer samt samlingen af parenkymet i strukturelle og funktionelle enheder. Samtidig er ESC'er den eneste type celle, hvor den molekylære mekanisme til implementering af deres potenser er fuldstændig afkoblet fra det genetiske udviklingsprogram, og ESC'erne selv er frataget evnen til at interagere med andre celler på grund af blokering af både receptoropfattelser og transsignalsystemer. Imidlertid fører tilstrækkelig aktivering af ESC'er til en trinvis udvikling af embryogeneseprogrammet, der slutter med fødslen af en fuldt dannet organisme, bestående af milliarder af celler, klar til ekstrauterint liv. På denne kortsigtede, men ufatteligt langsigtede vej i det cellulære rum opstår der uundgåeligt fejl både i de molekylære mekanismer, der sikrer cellernes vitale aktivitet, og i de programmer, der styrer deres proliferation, differentiering og specialisering. Derfor betragtes sygdomme i den molekylære struktur og sygdomme i celleprogrammering separat i moderne farmakogenomik. Desuden er virkningen af de fleste nye lægemidler rettet mod at korrigere programmerne for differentiering, proliferation og organogenese, samt regenerering af organer og væv. I en voksen organisme gør ESC'er det muligt at kontrollere adfærden af stam-/progenitorceller transplanteret i hjernen, leveren, milten, knoglemarven og andre menneskelige organer for at genoprette beskadiget parenkym i modtagerens organer ved at differentiere og specialisere donorceller på den bevarede mesenkymale matrix. I bund og grund begynder totipotensprogrammet at blive realiseret på niveau med oocyt-, zygote- og blastomergenomerne; disse celler er dog endnu ikke blevet klonet og transplanteret i mængder, der er nødvendige for eksperimentel og praktisk medicins behov. Derfor forbliver ESC'er en unik kilde til genetisk information, der indeholder koder for et tredimensionelt kort over embryoet og koder for lineær restriktion af specialiserede cellelinjer under gastrulation.

Det praktisk talt ubegrænsede regenerative potentiale hos ESC'er skyldes, at deres genom, i modsætning til det genetiske apparat i differentierede somatiske celler, bevarer pluripotens. En af manifestationerne af den sovende tilstand af den genetiske information, der er indlejret i ESC'er, er den såkaldte minimale fænotype - et begrænset antal receptorer udtrykkes på overfladen af ESC'er, og derfor anvendes meget få transsignalprogrammer til interaktionen mellem cellens kerneapparat og dens mikromiljø. På baggrund af dvaletilstanden hos gener, der er ansvarlige for begrænsningen af specialiserede cellelinjer og celledifferentiering, aktiveres kun omkring 30 ud af 500 gener, hvis produkter sikrer cellens forbindelse med det omgivende mikromiljø. Ved hjælp af metoden med seriel analyse af genekspression blev det vist, at med det fælles arbejde af genomets vigtigste funktionelle bokse, der regulerer energi og metabolisme i somatiske celler og ESC'er, har sidstnævnte et meget lavt niveau af mRNA af receptorer, G-proteiner, sekundære budbringere, transkriptaser, ekspressions- og repressionskofaktorer, dvs. hele systemet med transmembran transmission af det regulatoriske signal til cellen. Dette skyldes fravær eller meget lav ekspression af transsignalgener. I perioden med induceret differentiering i ESC-genomet ophører 18 fungerende gener synkront med at virke på baggrund af aktivering af 61 transsignalgener, der kontrollerer syntesen af celleadhæsionsreceptorer, komponenter i den ekstracellulære matrix, restriktionstranskriptaser og messengerelementer i signaltransmissionssystemet til det nukleare apparat fra receptorerne i celleplasmamembranen. Samtidig blokeres ekspressionen af gener, der er ansvarlige for syntesen af silencerproteiner, såvel som co-hæmmere af genekspression, der sikrer ESC-genomets totipotens.

Genmarkører er blevet fundet for celler i alle tre kimlag. Identifikation af det ektodermale cellelag udføres ved ekspression af nodal-, oct3- og fgf-5-generne, mesodermceller - ved brachyury- og zeta-globin-generne, endoderm - ved ekspression af gata-4-genet. Ved normal embryogenese observeres aktiv migration af umodne populationer af stam- og progenitorceller i gastrulationsperioden, hvilket lokalt markerer udviklingszonerne for ansigtsknoglerne i kraniet, nogle dele af hjernen, det perifere nervesystem, hjertets ledningssystem og thymus, hvis væv er dannet af kloner af migrerende celler. Mærkning af celler ved hjælp af tidlige gener i kimlagene letter opgaven med topografisk analyse af migrationsprocesserne for precursorceller i det udviklende embryo. Det er især blevet fastslået, at i aggregater af P19-embryocarcinomceller begynder ekspressionen af det første mesodermgen, brachyury, i perioden med nedsat ekspression af generne for vævsplasminogenaktivator, α-fetoprotein, keratin 8 og keratin 19, som er markører for de første migrerende mesodermpopulationer. Følgelig begynder dannelsen af væv af mesodermal oprindelse først efter afslutningen af processen med punktmigration og spredning af mesodermale progenitorceller.

Trods ekstremt begrænsede fænotypiske træk og fraværet af de fleste trans-signalenheder, udtrykker ESC'er stadig nogle receptormolekyler, der kan bruges til deres identifikation. Det er bemærkelsesværdigt, at ESC-markørantigener hos mennesker og primater har vist sig at være almindelige. Oftest anvendes mærkede antistoffer mod membranbundne antigener SSEA-3, SSEA-4 (unikke lipidantigener, der repræsenterer et kompleks af glycolipid GL7 med sialinsyre), såvel som højpolymerglykoproteinerne TRA-1-81, TRA-1-60 til ESC-mærkning. Derudover udtrykker ESC'er det specifikke embryonale antigen SSEA-1 og endogen alkalisk fosfatase, såvel som den specifikke transkriptionsfaktor Oct4. Sidstnævnte er nødvendig for at opretholde mekanismerne for ESC-proliferation - den specifikke transkriptionsfaktor Oct4 aktiverer ekspressionen af fibroblastvækstfaktor 4-genet og stabiliserer ekspressionen af den boks af gener, der er ansvarlig for ubegrænset DNA-replikation i umodne celler. De vigtigste intracellulære markørproteiner er Oct3, Oct4, Tcf og Groucho, som er relateret til kromatin-silencerproteiner.

Næsten umiddelbart efter mange års succesfulde forsøg på at dyrke ESC'er uden for kroppen, og de første kulturer af stamceller isoleret fra museblastocyster og kulturer af primære kønsceller blev opnået, begyndte en fase af forskning i ESC'ers pluripotente potentiale, da de blev introduceret i embryoner i tidlige udviklingsstadier. Det blev vist, at ESC'er i morula- og blastocyststadierne er i stand til at danne kimære embryoner, hvor efterkommere af donor-ESC'er detekteres i alle somatiske væv og endda i gameter. Således blev der i udviklingsbiologien ved hjælp af ESC'er etableret en "bro" mellem eksperimentelle studier in vivo og in vitro, hvilket betydeligt udvidede mulighederne for at studere processerne for dannelse af primære væv og organer, deres differentiering og embryonale organogenese.

Det er klart fastslået, at ESC'er in vivo under embryogenesen integreres i cellemassen i det tidlige embryo, og deres derivater findes i alle organer og væv. ESC'er koloniserer en linje af kimceller i det kimære embryo, hvis efterkommere danner fuldgyldige æg og sædceller. Embryonale stamceller er klonogene - en enkelt ESC er i stand til at skabe en genetisk identisk koloni af celler med molekylære markører, som inkluderer ekspression af oct4-genet og alkalisk fosfatase, høj telomeraseaktivitet og ekspression af visse embryonale antigener.

For at studere mekanismerne bag embryogenese ved hjælp af ESC'er er der udviklet en metode til morula-kimærisering ved at skabe en biologisk konstruktion, uden for hvilken der er et lag af recipient-tetraploide blastomerer, og donor-ESC'er introduceres indeni. Således dannes trofoblasten fra efterkommerne af recipientens tetraploide blastomerer, hvilket sikrer implantation og placentation, og donor-ESC'er fungerer som en intern cellemasse, hvorfra kroppen af et levedygtigt embryo og en linje af primære progenitor-kimceller dannes. Forskningsværdien af ESC'er ligger ikke kun i, at pluripotensen bevares under in vitro-manipulationer med deres genom, men også i, at ESC'ers evne til at deltage i dannelsen af primære kimceller i et kimært embryo bevares. Det er blevet vist, at efterkommerne af blot én genetisk modificeret ESC befolker alle primære rudimenter og udviklende væv i et kimært embryo opnået ved aggregering eller samdyrkning af denne celle med et 8-cellet embryo. Da ESC'er transficeret med det grønne fluorescerende proteingen blev transplanteret ind i morulaen hos mus, blev fluorescerende efterkommere af denne celle fundet i alle undersøgte væv i det udviklende embryo (Shimada, 1999). Transplantation af ESC'er ind i morulaen muliggør skabelsen af levedygtige mus, hvis organisme kun består af efterkommere af donor-ESC'en, hvilket åbner muligheder for forskellige muligheder for terapeutisk kloning. Denne metodologiske tilgang bruges nu med succes til at studere problemer inden for udviklingsbiologi, især bruges den til at analysere mekanismerne for genetisk inaktivering af X-kromosomet eller epigenetisk ustabilitet af ESC'er. Transplantation af ESC'er ind i et tidligt embryo bruges også i landbrugsbioteknologi såvel som i genterapieksperimenter.

Transplantation af genetisk modificerede ESC'er bruges til at teste målceller for mutante gener. In vitro-dyrkede ESC'er bruges i bioteknologi til at skabe knockout-mus. Til dette formål fjernes det gen, der skal undersøges, fra ESC'erne ved homolog rekombination (knockout), og celler, der mangler dette gen, isoleres på selektive medier. Knockout-ESC'er introduceres derefter i blastocysten eller aggregeres med morula-blastomerer. De kimære tidlige embryoner, der opnås på denne måde, transplanteres til recipienthunner, og individer med gameter, der er nullizygote for et givet gen, udvælges blandt de nyfødte mus. Denne teknologi er blevet brugt til at skabe mange linjer af knockout-mus, som er meget anvendte i eksperimentel biologi og eksperimentel medicin. Sådanne biologiske modeller bruges til at studere betydningen af visse gener i embryonisk udvikling, såvel som deres rolle i mekanismerne bag menneskelige sygdomme og patologiske tilstande. Derudover anvendes knockout-dyrelinjer i præklinisk afprøvning af nye genterapimetoder. For eksempel er det ved at transfektere den normale allel af et mutantgen ind i ESC-genomet muligt effektivt at korrigere en mutation, der påvirker det hæmatopoietiske system. Introduktionen af fremmede gener i ESC'er muliggør hurtig oprettelse af linjer af homozygote transgene forsøgsdyr. Det skal dog bemærkes, at teknikken med målrettet rekombinationsdeletion af gen indtil videre kun er blevet udviklet pålideligt i forhold til muse-ESC'er. Ved hjælp af dobbelt knockout-muse-ESC'er blev den funktionelle rolle af genklyngeregionen på kromosom 7 (en kopi af den genomiske region på humant kromosom 19) og den proximale region af kromosom 11 (en kopi af humant kromosom 5g) fastslået - deletion af disse gener i muse-ESC'er gjorde det muligt at evaluere funktionen af deres analoger hos mennesker.

Mulighederne for at studere funktionen af humane embryogenesegener er blevet udvidet, og transfektion heraf ind i genomet af ESC'er fra forsøgsdyr har især gjort det muligt at afklare kryptogenets rolle i dannelsen og udviklingen af det kardiogene mesoderm, pax-6-genet - i øjenembryogenese. De første kort over genekspression i umodne prolifererende ESC'er af teratocarcinom og blastocyster hos mus er ved at blive udarbejdet, og undertrykkende repression af transsignalgener i ESC'er er blevet bekræftet. En kombination af 60-80 mutante ESC'er og 20-30 celler fra normale præimplantationsmuseembryoner fører til udviklingen af kimære embryoner, hvor organprimordier består af donor- og recipientceller, hvilket gør det muligt at afklare ukendte geners rolle i gastrulation og organogenese. Funktionskort over gener fra udviklende museembryoner blev suppleret med information om sf-1-genets rolle i dannelsen af binyrerne og kønskirtlerne, wt-1-genets rolle i dannelsen af nyrerne, gener fra myoD-familien i dannelsen af skeletmuskulatur og gener fra gata-1-4-familien i restriktionsmodningen af erytropoiese- og lymfopoiese-rudimenterne.

Direkte afbrydelse af maternelle og paternale alleler af gener i ESC'er ved hjælp af vektorrekombinaser gjorde det muligt at afklare funktionerne af forskellige gener i den tidlige periode af embryogenesen, og teknologien til rettet overførsel af ukendte humane gener til mus-ESC'er bidrager til opdagelsen af nye mutante gener, der er ansvarlige for udviklingen af alvorlig arvelig patologi. Ved hjælp af knockout-metoden blev den obligatoriske betydning af nogle gener for dannelsen af embryonalt væv bestemt: gata-4 - for myokardiet, gata-1 - for den erythroide afstamning af hæmatopoietisk væv, myoD - for skeletmuskler, brachyury - for mesodermen, restriktionstranskriptaserne hnf3 og hnf4 - for leverstamceller, rag-2 - for dannelsen af T- og B-lymfocytkloner (Repin, 2001). Dobbelt deletion af gener i ESC'er har åbnet adgang til studiet af den funktionelle rolle af kimlagsgener, segmentering og homeose, og ESC-transplantation har gjort det muligt at opnå levedygtige interspecies hybridembryoner. Ved hjælp af en forbedret teknik til transplantation af en enkelt donor-ESC ind i et 8-cellet embryo er det blevet bevist, at mange organer i recipientembryoet kimæriseres på celleniveau. Det skal bemærkes, at der er fundet cellespirer af humant væv i organerne hos recipientmus efter introduktion af humane hæmatopoietiske stamceller i blastocysten. Det er blevet fastslået, at pluripotente ESC'er cirkulerer i blodet hos museembryoer i perioden med organdannelse. Det er muligt, at deres biologiske funktion ligger i den embryonale organisering af det fremtidige immunsystem. Ved hjælp af ESC'er er der blevet reproduceret tilstrækkelige modeller af menneskelig genetisk patologi under laboratorieforhold: dobbelt knockout af dystrofin-genet modeller Duchenne muskeldystrofi hos mus og nedlukning af atm-genet (kontrol af kromatinsignalkinasesyntese) - ataksi-telangiektasi. I denne dødelige arvelige sygdom hos børn udvikles degeneration af Purkinje-celler i lillehjernen på grund af defekter i DNA-reparation, som ledsages af involution af thymus på grund af død af prolifererende celler. Det kliniske billede, patofysiologien og patomorfologien af ataksi-telangiektasi, reproduceret ved at introducere patologisk genetisk information i ESC'er, hos kimære mus svarer til dem hos mennesker. Ud over ataksi-telangiektasi er der ved hjælp af ESC'er og knockout-mus blevet udviklet eksperimentelle modeller af nogle arvelige homozygote menneskelige sygdomme forbundet med patologi af kulhydrat- og lipidmetabolisme, aminosyrekatabolisme og kobber- og bilirubinudskillelse, hvilket har udvidet mulighederne for eksperimentel medicin betydeligt i præklinisk testfase af nye metoder til behandling af de tilsvarende menneskelige sygdomme.

[ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ]

Brug af stamcelle-cytohybrider

Hybridceller opnået ved at fusionere ESC'er med somatiske celler er en tilstrækkelig og lovende model til at studere pluripotensen af stamceller og omprogrammere kromosomerne i differentierede celler. Cytohybrider opnået ved at fusionere ESC'er med differentierede celler fra et voksent dyr gør det muligt at studere forholdet mellem genomer i forskellige "aldre": en unik situation opstår, når homologe kromosomer, der stammer fra celler på forskellige differentieringsstadier og forskellige modenhedsgrader, er placeret i den samme cellekerne, hvor de let kan udveksle trans-virkende regulatoriske signaler. Det er vanskeligt at forudsige, hvordan de cisregulatoriske epigenetiske systemer af homologe kromosomer, dannet under individuel udvikling, vil reagere på påvirkningen af trans-virkende signaler, der udgår fra embryonale relaterede genomer. Derudover forekommer segregering af forældrekromosomer i hybridceller, hvilket giver os mulighed for at studere interaktionen af genomer på niveauet af individuelle kromosomer, dvs. potentielt at identificere specifikke kromosomers deltagelse i at opretholde pluripotens eller omvendt, afgangen til differentiering.

Cytohybrider opnået ved at fusionere pluripotent teratocarcinom og differentierede somatiske celler blev brugt som den første eksperimentelle model til at studere interaktionen mellem genomer med forskellige "udviklingshistorier". I nogle tilfælde bevarede sådanne hybridceller pluripotente egenskaber på et ret højt niveau. Især inducerede in vivo teratocarcinom-somatiske hybridceller udviklingen af ægte teratomer indeholdende derivater af alle tre kimlag, og in vitro i suspensionskulturer dannede de embryoide legemer. Selv i interspecifikke cytohybrider af denne type blev tilstedeværelsen af embryonale antigener bemærket i tilfælde, hvor de somatiske partnere i fusionen med teratocarcinomceller var lymfocytter eller thymocytter. Det er bemærkelsesværdigt, at cytohybrider skabt ved at fusionere teratocarcinomceller med fibroblaster svarede til fibroblaster i fænotype.

Den vigtigste etablerede kendsgerning er, at der i teratocarcinom-somatiske hybridceller opstod tegn på omprogrammering af det differentierede cellegenom, hvilket var karakteriseret ved reaktivering af enten individuelle gener eller det inaktive X-kromosom hos den somatiske partner. Resultaterne af undersøgelser af cytohybrider af den teratocarcinom-somatiske celletype indikerer således, at pluripotens ofte bevares i hybridceller, og at der er tegn på omprogrammering af det somatiske partnergenom.

I eksperimenter med at opnå intraspecifikke embryonale hybridceller ved at fusionere muse-ESC'er med voksne splenocytter blev karakteristikaene for sådanne cytohybrider undersøgt, segregation af forældrekromosomer blev analyseret, og pluripotensen af hybridgenomet blev vurderet. Intraspecifikke hybridceller opnået ved at fusionere teratocarcinomceller med somatiske celler er normalt karakteriseret ved et lavt niveau af kromosomsegregation med en tetraploid eller næsten-tetraploid karyotype. En lignende kromosomal sammensætning blev observeret i cytohybrider under fusion af primære kimceller med lymfocytter. Samtidig viste interspecifikke hybridceller opnået ved at fusionere muse-teratocarcinomceller med minklymfocytter intens segregation af kromosomerne hos den somatiske partner.

En kvalitativt ny fase i studiet af segregation af forældrekromosomer i intraspecifikke hybrider begyndte efter udviklingen af en metode til analyse af mikrosatellitter ved hjælp af polymerasekædereaktion, takket være hvilken der blev fundet flere hundrede markører for hvert musekromosom, hvilket muliggjorde pålidelig diskriminering af ethvert par homologe kromosomer i hybridceller.

Ved at fusionere ESC'er (HM-1-celler med mangel på hypoxanthinphosphoribosyltransferase-aktivitet, 2n = 40, XY, isoleret fra blastocyster fra 129/01a-mus) med splenocytter fra de kongene DD/c-mus var det muligt at opnå et sæt hybridkloner, der morfologisk set lignede ESC'er. Alle kloner blev isoleret på et selektivt medium, hvor kun celler med aktiv hypoxanthinphosphoribosyltransferase kan vokse. Elektroforetisk analyse viste, at alle kloner havde en allelisk variant af hypoxanthinphosphoribosyltransferase, der er karakteristisk for DD/c-mus. Cytogenetisk analyse viste, at tre af de fire hybridkloner havde et næsten diploidt sæt kromosomer. En næsten tetraploid klon indeholdt to populationer af hybridceller, hvoraf den ene var tetraploid, og den anden, mindre, var diploid.

Mikrosatellitanalyse, som muliggør diskriminering af ethvert par af homologe kromosomer hos musene 129/01a og DD/c, i hybridkloner med et næsten diploidt sæt, viste, at der i to kloner var en klar præferentiel eliminering af autosomer fra den somatiske partner. De fleste autosomer i klonerne HESS2 og HESS3 havde markører for 129/01a-linjen, dvs. den pluripotente partner. Undtagelsen var kromosom 1 og I: i klonerne HESS2 og HESS3 var markører for den somatiske partner til stede i små mængder sammen med markører for HM-1-celler. Sådanne resultater kan afspejle ufuldstændig segregering af kromosom 1 og I hos den somatiske partner og er i overensstemmelse med cytogenetiske data, der viser, at trisomi for disse kromosomer observeres i 30-40% af cellerne i klonerne HESS2 og HESS3. Klon HESS4 adskilte sig signifikant i sin kromosomale sammensætning: mange autosomer i denne klon stammede fra ESC-genomet (kromosom 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 13, 14 og 17), men kromosom 1, 9, 11, 12, 15, 16, 18 og 19 var repræsenteret af homologer fra begge forældre. Det kvantitative forhold mellem mikrosatellitter, der markerede disse homologe kromosomer, var cirka 1:1. Dette tillod forfatterne at antage, at den ene homolog stammede fra ESC-genomet, og den anden fra differentierede celler. I nogle subkloner af klon HESS4 var kun markører for kromosom 18 og 19 fra den somatiske partner til stede. De opnåede resultater indikerer, at der i cellerne i HESS4-klonen, udover segregeringen af kromosomerne fra den somatiske partner, også forekom eliminering af en eller begge homologer af de ovennævnte kromosomer i det pluripotente genom, dvs. der var en bilateral segregering af kromosomerne fra begge forældre - et meget usædvanligt fænomen, da segregering af kromosomerne fra kun en af forældrene er karakteristisk for cytohybrider.

Derudover indeholdt alle kloner af hybridceller efter den 20. passage kun markører for den somatiske partners X-kromosom, dvs. at ESC X-kromosomet var blevet erstattet af den somatiske partners X-kromosom i klonerne. Denne vigtige kendsgerning bekræftes af in situ-hybridiseringsdata ved hjælp af en FITC-mærket probe specifik for musens X-kromosom: et positivt signal blev kun detekteret på ét kromosom. Det skal bemærkes, at i tidligere stadier af dyrkningen (før den 15. passage) indeholdt mange celler ifølge cytogenetiske data to X-kromosomer. Derfor muliggør brugen af selektive medier manipulation af den kromosomale sammensætning af hybridceller og selektiv udvælgelse af kloner, der bærer enkelte kromosomer fra den somatiske partner på baggrund af ESC-genomet.

Da et unikt træk ved cytohybrid-genomet er lokaliseringen af forældregenomerne i én cellekerne, opstår spørgsmålet naturligt om bevarelsen af de pluripotente egenskaber ved det embryonale genom i ESC-somatiske cellehybrider under betingelser med tæt kontakt med genomet i en differentieret celle. Morfologisk set lignede cytohybriderne af ESC'er og somatiske celler den forældrelige ESC-linje. Evaluering af pluripotens viste, at alle kloner med et næsten diploidt sæt af kromosomer var i stand til at danne embryoide legemer i suspensionskulturer, hvor derivater af tre kimlag var til stede.

De fleste hybridceller indeholdt ECMA-7-antigenet, en markør, der er karakteristisk for tidlige museembryoner, og havde også høj alkalisk fosfataseaktivitet. De mest overbevisende data om hybridcellers høje pluripotente egenskaber blev opnået i eksperimenter med at opnå en række injektionskimærer, der involverede hybridceller af HESS2-klonen. Analyse af biokemiske markører viste, at efterkommere af donorhybridcellerne var til stede i de fleste væv i kimærerne. Derfor bevarer hybridceller opnået ved at fusionere ESC'er og somatiske differentierede celler pluripotens på et højt niveau, herunder evnen til at danne kimærer, når de injiceres i blastocysthulrummet.

Klonerne HESS2 og HESS4 adskilte sig signifikant i sammensætningen af forældrekromosomer, men havde lignende pluripotente egenskaber. Det kan antages, at pluripotens i hybridgenomet manifesterer sig som et dominerende træk, men det er muligt, at ikke alle kromosomer i det embryonale genom er involveret i processen med at opretholde pluripotens. Hvis denne antagelse er korrekt, kan det forventes, at elimineringen af nogle kromosomer fra den pluripotente partner fra hybridcellernes genom ikke vil blive ledsaget af en ændring i deres pluripotente status. I dette tilfælde vil analysen af segregation af forældrekromosomer i embryonale hybridceller give os mulighed for at nærme os identifikationen af kromosomer, der er ansvarlige for kontrollen af pluripotens i embryonale celler.

O. Serov et al. (2001) fandt ingen afkom blandt 50 afkom opnået ved at krydse kimærer med normale mus, der havde 129/01a-musegenotypen og bar X-kromosomet fra DD-mus. Forfatterne mener, at dette skyldes et fald i pluripotens i hybridceller under påvirkning af det somatiske genom. En alternativ forklaring kan være den negative effekt af trisomi på nogle autosomer og ubalance i kønskromosomer (XXY blev observeret i celler op til den 15. passage) i hybridceller under meiose. Det er kendt, at XXY-celler ikke er i stand til at gennemgå meiose og danne gameter. Trisomi kan også forårsage et fald i den proliferative aktivitet af hybridceller, hvilket resulterer i, at den selektive fordel i udviklingen af kimærer kan tilhøre cellerne i modtagerembryoet. Det følger heraf, at det for en tilstrækkelig vurdering af hybridcellers pluripotente potentiale er nødvendigt at opnå hybridkloner med et normalt diploidt sæt af kromosomer.

I O. Serovs og medforfatteres (2001) eksperimenter blev muligheden for at omprogrammere X-kromosomet i en somatisk celle i genomet af hybridceller for første gang demonstreret. Denne konklusion fra forfatterne følger af analysen af ekspressionen af hprt-genet (en X-kromosommarkør) i kimærer: tilstedeværelsen af den alleliske variant af hprt hos DD/c-mus blev påvist i alle analyserede kimære væv. Det er passende at understrege, at efter introduktionen af hybridceller i blastocysthulrummet falder cytohybriderne i ikke-selektive tilstande, og bevarelsen af X-kromosomet i genomet af hybridceller betyder, at det er blevet dets obligate komponent, og genomet diskriminerer ikke det fra Y-kromosomet hos den pluripotente partner.

Forfatterne opsummerer resultaterne af analysen af interaktionen mellem de somatiske og pluripotente genomer i hybride embryonale celler og konkluderer, at pluripotens i nogle cytohybrider manifesterer sig som et dominerende træk. Hybridgenomet er i stand til at omprogrammere individuelle kromosomer i differentierede celler, hvilket dog ikke udelukker muligheden for en omvendt effekt af det somatiske genom på det embryonale genoms pluripotens. Ved dyrkning af hybridceller forekommer induktion af differentiering betydeligt oftere end i den oprindelige forældrelinje af ESC'er HM-1. En lignende effekt observeres under dannelsen af primære kolonier: mange primære kolonier af embryonale hybridceller differentierer i tidlige stadier af dannelsen med store tab af kloner under deres selektion og reproduktion.

Således bevarer cytohybrider skabt ved fusion af ESC'er med somatiske celler, på trods af tæt kontakt med genomet af differentierede celler, pluripotens som en unik egenskab ved det embryonale genom. Desuden er omprogrammering af individuelle kromosomer, der stammer fra differentierede celler, mulig i sådanne hybridceller. Det er fortsat uklart, i hvilken grad de pluripotente egenskaber ved det embryonale genom bevares i hybridceller, især deres evne til at deltage i dannelsen af kimlinjen i kimærer. Dette kræver, at man opnår embryonale hybridceller med en normal karyotype. Under alle omstændigheder kan pluripotente embryonale hybridceller blive en reel genetisk model til at identificere kromosomer involveret i at opretholde pluripotens eller kontrollere den, da bilateral segregation af forældrekromosomer potentielt giver en sådan mulighed.

Ikke mindre attraktivt er studiet af det fænomen, som O. Serov et al. (2001) definerer som "kromosomal hukommelse". I hybridgenomet findes homologe kromosomer i to alternative konfigurationer: homologer af den somatiske partner har engang gennemgået differentiering, hvorimod denne proces hos homologer af den pluripotente partner kun lige er begyndt. Følgelig indikerer bevarelsen af høje pluripotente egenskaber hos hybridceller, at den "pluripotente" konfiguration af ESC-homologer er tilstrækkelig stabil i hybridgenomet, på trods af indflydelsen af transaktionsfaktorer, der stammer fra den somatiske partner. De ovenfor beskrevne tegn på omprogrammering af homologe kromosomer i det differentierede genom under udviklingen af kimærer udelukker ikke muligheden for, at de i de første stadier af dannelse og dyrkning af cytohybrider in vitro bevarer deres status, der er erhvervet under differentiering in vivo. Ifølge nyligt opnåede data viser embryonale hybridceller, når de overføres til et ikke-selektivt miljø, intensiv eliminering af kromosomer fra kun den somatiske partner, dvs. genomet af hybridceller diskriminerer let homologer efter in vitro-dyrkning i 10-15 passager. Embryonale hybridceller repræsenterer således en lovende eksperimentel model til at studere ikke kun en så fundamental egenskab ved det embryonale genom som pluripotens, men også dens alternative egenskab - embryonal differentiering.

Terapeutisk effekt af embryonal stamcelletransplantation

Før vi analyserer den terapeutiske effekt af transplantation af ESC'er og deres derivater, opsummerer vi ovenstående materiale. ESC'ers evne til fuld implementering af embryogenese in vitro er utilstrækkelig, da udviklingsdefekter i dette tilfælde skyldes fraværet af mesenkymale stamceller, som opstår i kroppen autonomt og uafhængigt af ESC'er. ESC'ers genetiske potentiale er mindre end zygotens genetiske potentiale, derfor anvendes ESC'er ikke direkte til kloning af embryoner. ESC'ers unikke biologiske potentiale, som de eneste celler, hvor udviklingsprogrammer er fuldt implementeret i en ensartet implementering, anvendes i studier af genfunktion. Ved hjælp af ESC'er afkodes de første kombinationer af signaler, der aktiverer ekspressionen af tidlige og sene gener, der koder for udviklingen af tre kimlag. Bevarelse af ESC-genomets pluripotens in vitro gør dem til et unikt værktøj til reparativ regenerering, der er i stand til automatisk at genopbygge cellulære tab i tilfælde af skader på organer og væv. I et ideelt hypotetisk scenario kan det antages, at "... ved transplantation af donor-ESC'er overføres kompakt pakkede programmer til modtagerens krop, som under gunstige forhold realiseres i konstruktionen af nyt væv'7, der er i stand til "... at blive effektivt integreret i modtagerens krop på både morfologisk og funktionelt niveau."

Naturligvis begyndte in vivo-studiet af den funktionelle aktivitet af celler opnået in vitro fra én specialiseret klon efter udviklingen af metoder til monodifferentiering af ESC'er. En prolifererende ESC-klon genererer populationer af migrerende progenitorceller, der er i stand til aktivt at integrere sig i områder med recipientvævsskade, hvilket anvendes i regenerativ-plastisk medicin. Det er blevet fastslået, at transplantation af DOPA-neuroner ind i substantia nigra reducerer kliniske manifestationer ved eksperimentel hemiparkinsonisme. Regionale transplantationer af donor-neurale stamceller reducerer graden af motoriske forstyrrelser forårsaget af traumer eller kontusion af rygmarv og hjerne. De første positive resultater af stamcelletransplantation ved demyeliniserende sygdomme er også opnået. Det ser ud til, at ESC'ers regenerativ-plastiske potentiale åbner ubegrænsede muligheder for brugen af celletransplantation i praktisk medicin. Men når ESC'er transplanteres ind i ektopiske zoner, omdannes de uundgåeligt til tumorer. Teratomer dannes, når ESC'er injiceres subkutant i immundefekte mus. Når ESC-suspensioner transplanteres under testikelkapslen hos syngene mus, dannes der også teratomer, der består af forskellige væv, hvis celler er derivater af alle tre kimlag. I sådanne teratomer er processer med reduceret organogenese ekstremt sjældne.

En række undersøgelser giver information om de positive resultater af transplantation af tidlige ESC-derivater til dyr med eksperimentel patologi. Cellulær neurotransplantation ved hjælp af ESC-derivater udvikles yderligere i eksperimenter og de første kliniske forsøg for at korrigere funktionelle forstyrrelser i hjerne- og rygmarvsskader og til behandling af syringomyeli og multipel sklerose (Repin, 2001). Med fremkomsten af teknikken med in vitro-neurogenese fra ESC'er udvikles der metoder til transplantation af neurosfærederivater opnået fra embryonale nervevævskulturer i stedet for at bruge embryonalt hjernevæv. Sådanne transplantationssuspensioner er betydeligt mere homogene og indeholder dedikerede forstadier til neuroner og neuroglia.

Med regelmæssig tilsætning af retinsyre i en dosis på 10 μg/ml til dyrkningsmediet i 6 uger dannes mere end 80% af postmitotiske neuroner i den humane embryo-(terato)-karcinomlinje NTERA-2. Fuldstændig homogenitet af neuronpopulationen opnås ved flowsortering af modne neuroner mærket med immunfænotypiske markører, hvilket gør det muligt at fjerne rester af teratokarcinom og umodne celler. Efter transplantation til forskellige områder af hjernen hos forsøgsdyr overlever sådanne neuroner ikke kun, men integreres også i regionale neurale netværk. Hos dyr med eksperimentelle modeller af lokale CNS-defekter reducerer neurotransplantation de kliniske manifestationer af sådanne menneskelige patologier som konsekvenserne af traumatisk hjerneskade, slagtilfælde, demyeliniserende sygdomme, arvelige defekter i udviklingen af lillehjernen, sygdomme i lipid- og polysaccharidaflejring.

For at optimere regenereringsprocesser ved degenerative sygdomme i centralnervesystemet udvikles der teknologier til at udvinde myelinproducerende oligodendrocytter fra ESC'er. Det første trin omfatter traditionelt proliferation af ESC'er med reproduktion af det antal celler, der kræves til transplantation. I det andet trin udføres målrettet differentiering af celler til en population af myelinproducerende oligodendrocytforløbere, hvilket kontrolleres af selektive markørantigener.

Der åbner sig visse perspektiver for brugen af ESC-derivater til udvikling af metoder til at korrigere immundefekter forårsaget af genetiske defekter i thymusmodningen. I studier af knockout-mus (rag 1) med en induceret gendeffekt - en forstyrrelse af rekombinationsmekanismen af V(D)J-loci i TCR-gener, hvilket fører til tab af T-lymfocytfunktion - genopretter transplantation af tidlige ESC-derivater i thymus hos dyr modningen af normale populationer af immunkloner, der er ansvarlige for cellulær immunitet. Kliniske forsøg med transplantation af in vitro-prædannede ESC'er til behandling af fatale arvelige anæmier hos børn er i gang.

Indvendinger mod den hurtige introduktion af stamcelletransplantation i klinikken er baseret på det begrænsede antal stabile linjer af humane embryonale stamceller og behovet for deres standardisering. For at øge renheden af standardiserede ESC-linjer, såvel som voksne humane stamceller, foreslås det at anvende en metode til linjeudvælgelse baseret på molekylærgenetisk analyse af korte tandem-DNA-gentagelser. Det er også nødvendigt at teste ESC-linjer for tilstedeværelsen af små kromosomale omlejringer og genetiske mutationer, hvis potentiale for at forekomme under cellekulturbetingelser er ret højt. Der fremsættes en tese om obligatorisk testning af egenskaberne ved alle typer ESC'er og regionale pluripotente stamceller, da deres reproduktion in vitro kan føre til fremkomsten af nye egenskaber, der ikke er iboende i embryonale stamceller eller definitive væv. Især antages det, at langvarig dyrkning i medier med cytokiner bringer ESC-linjer tættere på tumorceller, da de undergår lignende ændringer i cellecyklusreguleringsvejene med erhvervelsen af evnen til at udføre et ubegrænset antal celledelinger. Nogle forfattere anser, baseret på potentialet for tumorudvikling, transplantation af tidlige embryonale stamcellederivater til mennesker for at være hensynsløs. Efter deres mening er det meget sikrere at bruge dedikerede efterkommere af ESC'er, dvs. linjer af differentierede celleprogenitorer. Der er dog på nuværende tidspunkt endnu ikke udviklet en pålidelig teknik til at opnå stabile humane cellelinjer, der differentierer i den ønskede retning.

Der dukker således flere og flere data om den positive terapeutiske effekt af transplantation af humane embryonale stamcellederivater op i litteraturen. Mange af disse undersøgelser bliver dog gennemgået og kritiseret. Nogle forskere mener, at resultaterne af tidlige kliniske forsøg er foreløbige og kun indikerer, at stamceller er i stand til at udøve en gunstig effekt på det kliniske forløb af en bestemt sygdom. Derfor er det nødvendigt at indhente data om de fjerne resultater af celletransplantation. Udviklingsstadierne inden for klinisk neurotransplantation nævnes som et argument. Faktisk var publikationer om den høje effektivitet af transplantation af embryonale hjernefragmenter ved Parkinsons sygdom i starten fremherskende i litteraturen, men derefter begyndte rapporter at dukke op, der benægtede den terapeutiske effektivitet af embryonalt eller føtalt nervevæv transplanteret i patienters hjerne.

De første kliniske forsøg blev udført for at vurdere sikkerheden ved transplantation af neuroblaster afledt af NTERA-2 teratocarcinom ESC'er, hvis umodne celler blev udsat for proliferation i kultur indtil akkumulering af 100 millioner cellemasse. Nogle af de celler, der blev opnået på denne måde, blev brugt til at karakterisere fænotypen og bestemme cellulære urenheder, samt til at teste for mulig kontaminering med virus og bakterier. LIF og fødelaget af føtale stromale celler blev fjernet fra kulturmediet, og der blev skabt betingelser for målrettet differentiering af ESC'er til neuroblaster ved hjælp af en kombination af cytokiner og vækstfaktorer. Derefter blev neuroblasterne oprenset fra umodne teratocarcinomceller på en flowcellesorterer. Efter sekundær oprensning og fænotypekarakterisering af transplanterede celler blev en suspension af neuroblaster (10-12 millioner) injiceret i basalkernen i patienternes hjerner (i den syvende måned efter hæmoragisk slagtilfælde) ved hjælp af en speciel mikrokanyle og sprøjte under stereotaksisk og computertomografisk kontrol. Etårig screening efter transplantation af konsekvenserne af neurontransplantation i apopleksizonen afslørede ingen bivirkninger eller uønskede virkninger. Halvdelen af patienterne viste forbedring i motorisk funktion i perioden fra 6 til 12 måneder efter transplantationen. Positive kliniske ændringer blev ledsaget af øget blodforsyning til apopleksizonen efter celletransplantation: den gennemsnitlige stigning i absorptionen af fluorescensmærket 2-deoxyglucose, ifølge positronemissionstomografi, nåede 18%, og hos nogle patienter - 35%.

De amerikanske National Institutes of Health har imidlertid gennemført en uafhængig undersøgelse af den kliniske effektivitet af neurotransplantation hos patienter med Parkinsonisme. Patienter i den første gruppe fik transplanteret sektioner af embryonalt nervevæv, der producerer dopamin, mens den anden patientgruppe gennemgik en simuleret operation. Resultaterne indikerer nul klinisk effektivitet af en sådan neurotransplantation, på trods af at dopaminproducerende embryonale neuroner overlevede i modtagernes hjerner. Desuden udviklede 15 % af patienterne vedvarende dyskinesi 2 år efter transplantationen af embryonalt nervevæv, hvilket var fraværende hos patienter i placebogruppen (Stamceller: videnskabelige fremskridt og fremtidige forskningsretninger. Nat. Inst, of Health. USA). Observationer af yderligere udvikling af sygdommen hos disse patienter er i gang.

Nogle forfattere forbinder de modstridende litteraturdata om vurdering af den kliniske effektivitet af neurotransplantation med forskellige tilgange til udvælgelse af patientgrupper, utilstrækkeligt valg af metoder til objektiv vurdering af deres tilstand og, vigtigst af alt, forskellige udviklingsperioder for embryonalt nervevæv og forskellige områder af hjernen, hvorfra dette væv blev opnået, forskellige transplantationsstørrelser og metodologiske træk ved kirurgisk indgreb.

Det skal bemærkes, at forsøg på direkte transplantation af pluripotente embryonale stamceller ind i striatumregionen i hjernen hos rotter med eksperimentel hemiparkinsonisme blev ledsaget af proliferation af ESC'er og deres differentiering til dopaminerge neuroner. Det bør antages, at nydannede neuroner blev effektivt integreret i neurale netværk, da der efter ESC-transplantation blev observeret korrektion af adfærdsmæssige anomalier og motorisk asymmetri i apomorfin-testen. Samtidig døde nogle dyr på grund af transformationen af transplanterede ESC'er til hjernetumorer.

Eksperter fra de nationale og medicinske akademier i USA og specialister fra National Institute of Health i USA mener, at det kliniske potentiale ved ESC'er fortjener den mest seriøse opmærksomhed, men insisterer på behovet for en detaljeret undersøgelse af deres egenskaber, sandsynligheden for komplikationer og langsigtede konsekvenser i eksperimenter med tilstrækkelige biologiske modeller af menneskelige sygdomme (Stamceller og fremtidens regenerative medicin, National Academy Press.; Stamceller og fremtidige forskningsretninger. Nat. Inst, of Health USA).

Fra dette synspunkt er det vigtigt, at en sammenlignende histologisk analyse af eksperimentelle teratomer opnået ved transplantation af ESC-suspension i testiklen med teratomer dannet som følge af transplantation af et tidligt embryo, som også indeholder ESC, viste, at ESC, uanset deres oprindelseskilde eller interaktion med visse omgivende celler, udnytter deres tumorigeniske potentiale på samme måde. Det er blevet bevist, at sådanne teratomer har en klonal oprindelse, da tumorer bestående af derivater af alle tre kimlag kan opstå fra ét ESC (Rega, 2001). Det er bemærkelsesværdigt, at når klonede ESC'er med en normal karyotype blev transplanteret til immundefekte mus, blev der også dannet teratomer bestående af forskellige typer differentierede somatiske celler. Disse eksperimentelle data er et upåklageligt bevis på teratomers klonale oprindelse. Fra et udviklingsbiologisk synspunkt indikerer de, at det ikke er flere engagerede progenitorceller, men en enkelt pluripotent stamcelle, der fungerer som en kilde til differentierede derivater af alle tre kimlag, der udgør et teratom. På vejen til praktisk celletransplantation er resultaterne af disse undersøgelser imidlertid, om ikke afskrækkende, så et advarselstegn på potentiel fare, da podning af ESC'er eller primordiale kimceller i forskellige væv fra voksne immundefekte mus uundgåeligt forårsager udvikling af tumorer fra transplanterede stamceller. Neoplastisk degeneration af ektopisk transplanterede ESC'er ledsages af fremkomsten af satellitpopulationer af differentierede celler - på grund af delvis differentiering af ESC'er og progenitorkloner til specialiserede linjer. Interessant nok, når ESC'er transplanteres ind i skeletmuskler, dannes neuroner oftest ved siden af teratocarcinomceller. Introduktionen af ESC'er i et delende æg eller en blastocyst ledsages imidlertid af fuldstændig integration af cellerne i embryoet uden dannelse af neoplastiske elementer. I dette tilfælde integreres ESC'er i stort set alle organer og væv i embryoet, inklusive genital primordium. Sådanne allofne dyr blev først opnået ved at introducere teratocarcinom 129-celler i tidlige embryoner i stadierne 8-100 celler. Hos allofene mus integreres populationer af heterogene celler afledt af donor-ESC'er i vævene i knoglemarv, tarm, hud, lever og kønsorganer, hvilket gør det muligt at skabe lige så mange interartede cellekimærer i eksperimentet. Jo kortere udviklingsperioden for det tidlige embryo er, desto højere er procentdelen af cellekimærisering, med den højeste grad af kimærisering observeret i det hæmatopoietiske system, hud, nervesystem, lever og tyndtarm hos allofene embryoet. I en voksen organisme er væv beskyttet mod recipientens immunsystem af histohæmatiske barrierer modtagelige for kimærisering:Transplantation af primære kimceller i testikelparenkym ledsages af inkorporering af donorstamceller i recipientens kimvævslag. Ved transplantation af ESC'er i en blastocyst forekommer der imidlertid ikke dannelse af kimære rudimenter af kønsorganerne med generering af primære donorkimceller. ESC'ers pluripotens kan, når der skabes særlige betingelser, også anvendes til kloning: transplantation af mus-ESC'er i et 8-16-cellet museembryo, hvor cellulære mitoser blokeres af cytokalsin, fremmer implementeringen af normal embryogenese med udvikling af et embryo fra donor-ESC'er.

Et alternativ til allogen ESC-transplantation er derfor terapeutisk kloning baseret på transplantation af somatiske cellekerner ind i et enukleeret æg for at skabe en blastocyst, fra hvis indre cellemasse linjer af ESC'er, der er genetisk identiske med donoren af den somatiske kerne, derefter isoleres. Teknisk set er denne idé ret realistisk, da muligheden for at skabe ESC-linjer fra blastocyster opnået efter transplantation af somatiske kerner ind i enukleerede æg gentagne gange er blevet bevist i forsøg på forsøgsdyr (Nagy, 1990; Munsie, 2000). Især hos mus, der var homozygote for rag2-genmutationen, blev fibroblaster opnået ved dyrkning af subepidermale vævsceller anvendt som donorer af kerner, som blev transplanteret ind i enukleerede oocytter. Efter oocytaktivering blev "zygoten" dyrket indtil blastocystdannelse, fra hvis indre cellemasse ESC'er blev isoleret og overført til en linje af celler, der var nullizygote for det mutante gen (rag2~/~). Mutationen af et allelgen blev korrigeret i sådanne ESC'er ved hjælp af metoden med homolog rekombination. I den første serie af eksperimenter blev embryoide legemer opnået fra ESC'er med et rekombinant restaureret gen, deres celler blev transficeret med en rekombinant retrovirus (HoxB4i/GFP) og efter reproduktion injiceret i venen hos rag2~/~ mus. I den anden serie blev tetraploide blastomerer aggregeret med genetisk modificerede ESC'er og transplanteret til recipienthunner. De resulterende immunkompetente mus fungerede som knoglemarvsdonorer til transplantation til rag2~/~ mutantmus. I begge serier var resultatet positivt: efter 3-4 uger blev modne normale myeloide og lymfoide celler, der var i stand til at producere immunoglobuliner, fundet i alle mus. Således kan transplantation af somatiske cellekerner til oocytter ikke kun bruges til at opnå ESC-linjer, men også til cytogenoterapi - korrektion af arvelige anomalier ved hjælp af ESC som en vektor til transport af korrigerende genetisk information. Men denne retning af celletransplantation har, udover bioetiske problemer, sine begrænsninger. Det er uklart, hvor sikker transplantation af terapeutisk klonede celler med en genotype identisk med en specifik patients genotype vil være, da sådanne celler kan introducere mutationer, der skaber en prædisponering for andre sygdomme. Normale menneskeæg forbliver et vanskeligt tilgængeligt objekt, hvorimod selv med transplantation af somatiske kerner til enukleerede dyreæg udvikler kun 15-25% af de konstruerede "zygoter" sig til blastocyststadiet. Det er endnu ikke fastlagt, hvor mange blastocyster der kræves for at opnå én linje af pluripotente klonede ESC'er. Det er også værd at bemærke de høje økonomiske omkostninger forbundet med kompleksiteten af den terapeutiske kloningsmetode.

Afslutningsvis skal det bemærkes, at i ESC'er kombineres genomets pluripotens med hypomethyleret DNA med høj telomeraseaktivitet og en kort C^-fase af cellecyklussen, hvilket sikrer deres intensive og potentielt uendelige reproduktion, hvor ESC'er bevarer et diploidt sæt af kromosomer og et "juvenilt" sæt af fænotypiske egenskaber. Klonal vækst af ESC'er i kultur forstyrrer ikke deres differentiering til nogen specialiseret cellelinje i organismen, når proliferationen stoppes, og passende regulatoriske signaler tilføjes. Restriktionsdifferentiering af ESC'er til somatiske cellelinjer in vitro realiseres uden mesenkymets deltagelse, omgåelse af Nochteys, uden for organogenesen og uden embryodannelse. Ektopisk introduktion af ESC'er in vivo fører uundgåeligt til dannelsen af teratocarcinomer. Transplantation af ESC'er i en blastocyst eller et tidligt embryo ledsages af deres integration med det embryonale væv og stabil kimærisering af dets organer.

Regenerativ-plastiske teknologier baseret på celletransplantation er skæringspunktet mellem interesserne hos repræsentanter for cellebiologi, udviklingsbiologi, eksperimentel genetik, immunologi, neurologi, kardiologi, hæmatologi og mange andre grene af eksperimentel og praktisk medicin. De vigtigste resultater af eksperimentelle undersøgelser beviser muligheden for at omprogrammere stamceller med en målrettet ændring i deres egenskaber, hvilket åbner muligheder for at kontrollere cytodifferentieringsprocesserne ved hjælp af vækstfaktorer - til myokardieregenerering, genoprettelse af CNS-læsioner og normalisering af funktionen af øapparatet i bugspytkirtlen. For den udbredte introduktion af transplantation af ESC-derivater i praktisk medicin er det imidlertid nødvendigt at studere egenskaberne af humane stamceller mere detaljeret og fortsætte eksperimenter med ESC'er på eksperimentelle sygdomsmodeller.

Bioetiske problemstillinger og problemet med afstødning af en allogen celletransplantation kunne løses ved den opdagede plasticitet af genomet af regionale stamceller fra en voksen organisme. Imidlertid bliver den indledende information om, at når isolerede og omhyggeligt karakteriserede hæmatopoietiske autologe celler transplanteres ind i leveren, hvorfra nye hepatocytter udledes, der integreres i leverlobulerne, nu revideret og kritiseret. Ikke desto mindre er der blevet offentliggjort data, der viser, at transplantation af neurale stamceller ind i thymuskirtlen forårsager dannelsen af nye donor T- og B-lymfocytspirer, og transplantation af neurale stamceller fra hjernen ind i knoglemarven fører til dannelsen af hæmatopoietiske spirer med langvarig donormyelo- og erythropoiese. Følgelig kan pluripotente stamceller, der er i stand til at omprogrammere genomet til potentialet af ESC'er, forblive i organerne hos en voksen organisme.

Kilden til at opnå ESC til medicinske formål er fortsat det menneskelige embryo, hvilket forudbestemmer uundgåeligheden af et nyt skæringspunkt mellem moralske, etiske, juridiske og religiøse spørgsmål ved menneskelivets oprindelse. Opdagelsen af ESC har givet et stærkt skub til genoptagelsen af hårde diskussioner om, hvor grænsen går mellem levende celler og materie, væren og personlighed. Samtidig findes der ingen universelle normer, regler og love vedrørende brugen af ESC i medicin, på trods af gentagne forsøg på at skabe og implementere dem. Hver stat løser dette problem uafhængigt inden for rammerne af sin lovgivning. Læger over hele verden forsøger på deres side fortsat at bringe regenerativ-plastisk medicin ud over rammerne af sådanne diskussioner, primært ved at bruge reserver af voksne stamceller snarere end embryonale stamceller.

Lidt historie om isolering af embryonale stamceller

Terato(embryo)karcinomceller blev isoleret fra spontant forekommende testikelteratomer hos 129/ter-Sv-mus, spontane ovarieteratomer hos Lt/Sv-mus og fra teratomer afledt af ektopisk transplanterede embryonale celler eller væv. Blandt de stabile museterato(embryo)karcinomcellelinjer, der blev opnået på denne måde, var nogle pluripotente, andre differentierede kun til én specifik celletype, og nogle var fuldstændig ude af stand til cytodifferentiering.

På et tidspunkt var fokus på studier, hvis resultater indikerede muligheden for at bringe terato-(embryo)-karcinomceller tilbage til en normal fænotype efter deres introduktion i vævet i et udviklende embryo, samt arbejde med in vitro-skabelse af genetisk modificerede terato-(embryo)-karcinomceller, ved hjælp af hvilke mutante mus blev opnået til biologisk modellering af menneskelig arvelig patologi.

Konditioneret suspensionsdyrkning blev anvendt til at isolere terato-(embryo)-carcinomcellelinjer. I kultur vokser terato-(embryo)-carcinomceller, ligesom ESC'er, til embryoide legemer og kræver obligatorisk dissociation for linjeoverførsel, opretholdelse af pluripotens på et fødelag af embryonale fibroblaster eller under suspensionsdyrkning i et konditioneret medium. Celler af pluripotente terato-(embryo)-carcinomlinjer er store, sfæriske, karakteriseret ved høj alkalisk fosfataseaktivitet, danner aggregater og er i stand til multidirektionel differentiering. Når de introduceres i en blastocyst, aggregerer de med morulaen, hvilket fører til dannelsen af kimære embryoner, i sammensætningen af forskellige organer og væv, hvoraf derivater af terato-(embryo)-carcinomceller findes. Imidlertid dør langt de fleste af sådanne kimære embryoner in utero, og i organerne hos overlevende nyfødte kimærer detekteres fremmede celler sjældent og med lav densitet. Samtidig stiger forekomsten af tumorer (fibrosarkom, rhabdomyosarkom, andre typer maligne tumorer og bugspytkirteladenom) kraftigt, og tumordegeneration forekommer ofte i perioden med intrauterin udvikling af kimære embryoner.

De fleste terato-(embryo)-karcinomceller i mikromiljøet af normale embryonale celler erhverver næsten naturligt maligne neoplastiske karakteristika. Det menes, at irreversibel malignitet skyldes aktivering af proto-onkogener i forbindelse med strukturelle omlejringer. En af undtagelserne er celler af embryocarcinomlinjen SST3, opnået fra musetestikulære teratomer (linje 129/Sv-ter), som udviser en høj evne til at integrere sig i embryonets væv og organer uden efterfølgende tumordannelse hos kimære mus. Derivater af terato-(embryo)-karcinomcellelinjer hos kimære mus deltager praktisk talt ikke i dannelsen af primære gonocytter. Dette skyldes tilsyneladende den høje frekvens af kromosomafvigelser, der er karakteristiske for de fleste terato-(embryo)-karcinomlinjer, i hvis celler både aneuploidi og kromosomale abnormiteter observeres.

Adskillige stabile linjer af humane terato-(embryo)-karcinomceller karakteriseret ved pluripotens, høj proliferativ aktivitet og evnen til at differentiere under vækst i kulturer blev opnået under laboratorieforhold. Især linjen af humane terato-(embryo)-karcinomceller NTERA-2 blev brugt til at undersøge mekanismerne for neural cytodifferentiering. Efter transplantation af celler fra denne linje ind i den subventrikulære region af forhjernen hos nyfødte rotter blev deres migration og neurogenese observeret. Der blev endda gjort forsøg på at transplantere neuroner opnået ved dyrkning af celler fra terato-(embryo)-karcinomlinjen NTERA-2 til patienter med slagtilfælde, hvilket ifølge forfatterne førte til en forbedring af sygdommens kliniske forløb. Samtidig var der ingen tilfælde af malignitet af transplanterede celler fra terato-(embryo)-karcinomlinjen NTERA-2 hos patienter med slagtilfælde.

De første linjer af udifferentierede pluripotente embryonale stamceller fra mus blev opnået i begyndelsen af 1980'erne af Evans og Martin, som isolerede dem fra blastocystens indre cellemasse - embryoblasten. De isolerede ESC-linjer bevarede pluripotens og evnen til at differentiere til forskellige celletyper under påvirkning af faktorer i et specielt kulturmedium i lang tid.

Selve udtrykket "embryonal pluripotent stamcelle" tilhører Leroy Stevens, som, mens han studerede effekten af tobakstjære på forekomsten af tumorudvikling, henledte opmærksomheden på den spontane forekomst af testikelteratocarcinom hos lineære (129/v) mus i kontrolgruppen. Cellerne fra testikelteratocarcinomer var karakteriseret ved en høj proliferationshastighed, og i nærvær af væske fra bughulen differentierede de spontant med dannelsen af neuroner, keratinocytter, chondrocytter, kardiomyocytter samt hår- og knoglefragmenter, men uden tegn på ordnet cytoarkitektur af det tilsvarende væv. Når de blev placeret i kultur, voksede teratocarcinomcellerne som pluripotente kloner, der ikke var bundet til substratet, og dannede embryoide legemer, hvorefter de ophørte med at dele sig og gennemgik spontan uordnet differentiering til neuroner, glia, muskelceller og kardiomyocytter. Stevens fandt, at museteratocarcinom 129/v indeholder mindre end 1% celler, der er i stand til at differentiere til en række specialiserede somatiske linjer, og selve differentieringen afhænger af de faktorer, der påvirker dem (sammensætningen af peritonealvæsken, produkter fra modne celler eller væv tilsat kulturen). Leroy Stevensons hypotese om tilstedeværelsen af embryonale progenitorceller fra kimlinjen blandt teratocarcinomceller blev bekræftet: en suspension af embryoblastceller fra præimplantationsembryoner i væv fra voksne mus dannede teratocarcinomer, og rene cellelinjer isoleret fra dem efter intraperitoneal administration til recipientdyr differentierede til neuroner, kardiomyocytter og andre somatiske celler afledt af alle tre kimlag. I in vivo-eksperimenter resulterede transplantation af ESC'er (opnået fra embryoblasten, men ikke trofoblasten) i museembryoner fra en anden linje i blastomerstadierne 8-32 i fødslen af kimære dyr (uden udvikling af tumorer), i hvis organer spirer af donorvæv blev fundet. Kimærisme blev observeret selv i kimcellelinjen.

Primære progenitor-kimceller isoleret fra det genitale rudiment af et museembryo svarede i morfologi, immunologisk fænotype og funktionelle egenskaber til ESC'er opnået af Stevenson fra teratocarcinom og embryoblast. I kimærer født efter ESC'er blev introduceret i en blastocyst, var allofen morfogenese af organer karakteriseret ved en mosaikveksling af donor- og recipientstrukturelle og funktionelle enheder i lever, lunger og nyrer. I nogle tilfælde blev dannelsen af intestinale krypter eller leverlobuler bestående af både recipient- og donorceller observeret. Morfogenese blev dog altid realiseret i henhold til det genetiske program for den art, som recipienten tilhørte, og kimærisme var udelukkende begrænset til celleniveau.

Det blev derefter fastslået, at proliferation af ESC'er uden cytodifferentiering på et fødelag af mesenkym-afledte celler (føtale fibroblaster) forekommer med den obligatoriske tilstedeværelse af LIF i selektive næringsmedier, som selektivt sikrer overlevelsen af kun stam- og progenitorceller, mens det overvældende flertal af specialiserede cellulære elementer dør. Ved hjælp af sådanne metoder isolerede James Thomson i 1998 fem udødeliggjorte linjer af embryonale stamceller fra den indre cellemasse af en menneskelig blastocyst. Samme år udviklede John Gerhart en metode til at isolere udødelige ESC-linjer fra den genitale tuberkel af fire til fem uger gamle menneskelige embryoner. På grund af deres unikke egenskaber begyndte embryonale stamceller og stamceller fra definitive væv blot to år senere at blive anvendt i praksis inden for regenerativ medicin og genterapi.