Laboratoriediagnose af tuberkulose

Tuberkulose er en sygdom, der er nem at diagnosticere i moderne forhold og videnskabelige resultater. Laboratoriediagnosticering af tuberkulose er central for andre diagnostiske metoder, og kun for røntgenforskningsmetoder.

[1], [2], [3], [4], [5], [6], [7], [8]

Klinisk blodprøve

Hos patienter med tuberkulose er ændringer i den generelle analyse af blod ikke patognomoniske. Med begrænsede og inaktive former af tuberkulose hypochromia karakteristisk for erythrocytter i deres normale mængde. Når massive infiltrater eller caseøs pneumoni, mens forekomsten af caseøs lymfadenitis specifikke intestinale læsioner, såvel som for stor pulmonal eller postoperativ blødning og note erythropenia microcytosis, oligohromaziyu, polihromaziyu. Makrocytose, og især poikilotsitoz mødes meget sjældnere, normalt med alvorlig anæmi. Antallet af reticulocytter ved trin tuberculosis kompenseres området fra 0,1 til 0,6%, med subcompensated - fra den 0,6 til 1,0% og 1% er kendetegnet ved dekompenseret reticulocytter.

Når tuberkulose i nogle tilfælde kan der være en moderat leucocytose (op til 15 tusind af leukocytter.), Mindre stråling, som forekommer i 2-7% af patienter med begrænset og nem proces forekommende former og i 12,5% - ved destruktiv og progressiv lungetuberkulose .

De hyppigste skift forekommer i leukocytformlen. Marker både relativ og absolut neutrofili, et moderat skift af leukocytformlen til venstre før promyelocytter. Myelocytter er meget sjældne i tilfælde af ukompliceret tuberkulose. En stigning i antallet af neutrofiler med patologisk granularitet i hemogrammet hos en patient med tuberkulose indikerer altid varigheden af processen: hos patienter med svær tuberkulose indeholder næsten alle neutrofiler patologisk granularitet. Når det tuberkulære udbrud ophører, nærmer atomforskydningen sig relativt hurtigt normalt. Neutrofilernes patologiske granularitet varer normalt længere end andre ændringer i hemogrammet.

Indholdet af eosinofiler i det perifere blod varierer også afhængigt af procesens fase og organismens allergiske tilstand. Deres antal falder indtil aneozinofiliya i alvorlig og langvarig sygdomsudbrud, og omvendt stiger som resorptionen infiltrater og pleural effusion samt tidlige former for primær tuberkulose.

De fleste former for primær tuberkulose ledsages af lymfopeni, som undertiden observeres i en årrække, selv efter at der er forringet specifikke ændringer. Sekundær tuberkulose i eksacerbationsfasen afhænger af sværhedsgraden af processen, kan ledsages af enten et normalt antal lymfocytter eller lymfopeni.

Det indtager en særlig plads bestemmelse blodsænkning Supplerende prøver til evaluering tuberkuløse fremgangsmåde (ESR), der har en værdi i evaluere flow tuberkulose proces og identificere sine aktive former. Stigning i ESR indikerer tilstedeværelsen af den patologiske proces (smitsom-inflammatorisk, suppurativ septisk, hemoblastosis, Hodgkin et al.) Og er indikativ for dens sværhedsgrad, men normale niveauer ESR ikke altid viser forekomst af patologi. Acceleration af erythrocytsedimentering ledsages af en forøgelse af indholdet af globuliner, fibrinogen, kolesterol i blodet og et fald i viskositeten af blodet. Nedtrængning af erythrocytsedimentering er karakteristisk for tilstande ledsaget af hæmokoncentration, en forøgelse af indholdet af albuminer og galdesyrer.

Hemogrammet hos patienter med tuberkulose ændres under behandlingen. Hæmatologiske skift forsvinder jo hurtigere, jo mere vellykket det terapeutiske indgreb. Men man bør huske på virkningen på hæmopoiesis af forskellige antibakterielle lægemidler. De forårsager ofte eosinofili, i nogle tilfælde - leukocytose, og oftere leukopeni op til agranulocytose og lymfoidretikulær reaktion. Systematisk hæmatologisk kontrol og korrekt analyse af de opnåede data er afgørende for vurderingen af patientens kliniske tilstand, procesens dynamik og effektiviteten af den anvendte behandling.

[9], [10], [11], [12], [13], [14], [15], [16]

Klinisk analyse af urin

Med tuberkulose i urinsystemet er urinalyse den vigtigste laboratoriediagnostiske metode. Du kan observere leukocyturi, erytrocyturi, proteinuri, hypoisostenuri, tuberkulose mycobacterium, uspecifik bakteriuri.

Leukocyturi - den mest almindelige symptom på tuberkulose i urinvejene forud for kemoterapi og der er ingen specifik kun undtagelsesvis, såsom fuldstændig udslettelse af lumen af ureter. Nechyporenko prøve (bestemmelse af antallet af leukocytter i 1 ml urin) bidrager til mere objektivt vurdere graden leukocyturia nefrotuberkuloze med, og i nogle tilfælde for at identificere det ved normal urinanalyse. Det skal imidlertid tages i betragtning, at leukocyturi kan forekomme i akut og kronisk pyelonefritis, blærebetændelse, urethrit, nyre og urinsten.

Eritrotsiturii. Såvel som leukocyturi. Betragtes som et af de hyppigste laboratorie tegn på tuberkulose i det genitourinære system. Hyppigheden af hæmaturi afhænger af prævalensen af processen, den øges, da den destruktive tuberkulose-proces udvikler sig i nyrerne. Erythrocyturi uden leukocyturi er mere typisk for tidlige stadier af nyretuberkulose. Hæmaturi, som dominerer over leukocyturi, er et vigtigt argument til fordel for nyre-tuberkulose i dens differentiering med uspecifik pyelonefritis.

[17], [18], [19], [20], [21], [22], [23], [24], [25], [26], [27]

Biokemisk blodprøve

Med tuberkulose afhænger ændringer i nogle biokemiske parametre primært af fase i processen, komplikationer og forskellige samtidige sygdomme. Hos patienter med inaktiv tuberkulose i lungerne og andre organer er de totale protein- og proteinfraktioner i blodserum uændrede og bestemmer deres normale indhold.

I akutte former for sygdommen, såvel som med forværring og progression af kroniske former for tuberkulose, nedsættes albumin-globulinkoefficienten.

Væsentligt ved vurderingen den funktionelle tilstand af organisk skader og lever i tuberkulose og komplikationer er bestemmelsen af serum total og direkte-bilirubin, AST (ACT), alaninaminotransferase (ALT). Dynamisk bestemmelse af niveauet af aminotransferaser. Bilirubin til behandling af tuberkulose patienter, især i svære former, er en obligatorisk komponent i en biokemisk undersøgelse af tuberkulose patienter og udføres hver måned.

Vurdering af nyres funktionelle tilstand omfatter bestemmelse af serumkreatinin og beregning af glomerulær filtreringshastighed ifølge Cockcroft-Gault-formlen. Beregning af glomerulær filtreringshastighed ved hjælp af Rebergs prøve giver mindre præcise resultater.

Hovedmålet med dynamiske biokemiske undersøgelser af tuberkulosepatienter er at overvåge processen i gang, rettidig påvisning af bivirkninger af lægemidler og passende korrektion af de opstødende homeostatiske lidelser.

[28], [29], [30]

Anvendelse af biokemiske undersøgelsesmetoder i ekstrapulmonal tuberkulose

Den mest informative indikator er indholdet af tuberculostearinsyre i biologiske væsker, men dets definition er forbundet med tekniske vanskeligheder (behovet for gaskromatografi og massespektrometri).

Prospektiv måling af aktiviteten af adenosindeaminase - et enzym, bestemt i væsker: synovial, perikardial, ascitisk eller spinal. De vigtigste producenter af adenosindeaminase er lymfocytter og monocytter. Bestemmelse af aktiviteten af adenosin deaminase i biologiske væsker letter diagnosen tuberkulose synovitis, tuberkulose af lymfeknuder, tuberkuløs meningitis, tuberkulose serositis.

Nogle biokemiske indikatorer på grund af deres ikke-specificitet bestemmes kun i biologiske væsker tæt på læsionsfokuset. Mål niveauet af indikatorer som reaktion på subkutan eller intradermal injektion af tuberkulin (normalt før og 48 og 72 timer efter det). Herefter beregnes graden af stigning af markørniveauet (i%) i forhold til startniveauet.

Optimal bestemmelse i urinen af aktiviteten af et organspecifik enzym af transamidase, hvis udseende bemærkes, når nyrerne af forskellig art påvirkes. Undersøgelsen af transamidinase er kun berettiget under betingelser for subkutan injektion af tuberkulin for at forværre den lokale inflammatoriske proces. Bestem transamidinaktiviteten i urinen i første omgang og 24-72 timer efter introduktionen af 50 TE tuberculin. Udvidelsen af fermentia i 2 gange og mere tillader i 82% af tilfældene at differentiere aktiv tuberkulose af nyrerne fra forværring af kronisk pyelonefritis.

Ved tuberkulose af kvindelige kønsorganer bestemmes koncentrationerne af haptoglobin og malonic dialdehyd i blodet under betingelser med en provokerende tuberkulinprøve. Subkutant injiceret tuberkulin i en dosis på 50 TE og 72 timer senere udført en anden biokemisk undersøgelse. I tilfælde af tuberkulose etiologi er graden af stigning i niveauet af haptoglobin ikke mindre end 28%, og niveauet af malondialdehyd er 39% eller mere. Bestemmelsen af aktiviteten af adenosindeaminase i en peritoneal væske opnået fra Douglas-rummet anvendes også. Punctatet undersøges igen 72 timer efter intradermal injektion af tuberkulin i doser på 0,1 TE og 0,01 TE i fremspringet af de indre genitalorganer på den forreste abdominale væg. Til fordel for tuberkuloseprocessen er en stigning i aktiviteten af adenosindeaminase 10% eller mere i sammenligning med den oprindelige.

Når øjet påvirkes, undersøges fokalreaktionen, der forekommer i øjet som reaktion på antigenstimulering. Det er uønsket at udvikle et udtalt svar ledsaget af et fald i visuelle funktioner. Da vurderingen af minimale fokalreaktioner ofte er vanskelig, er det hensigtsmæssigt at orientere parallelt og om graden af vækst i blodserumet af haptoglobin eller adenosindeaminase.

Alle biokemiske undersøgelser skal udføres sammen med andre metoder.

[31], [32], [33], [34], [35], [36], [37]

Blodkoagulationssystemforskning

Relevans af forskningen status blodstørkningssystemet TB er forårsaget af tilstedeværelsen af en række patienter med lungetuberkulose hæmoptyse eller pulmonal blødning, samt hemocoagulation komplikationer i den kirurgiske behandling af tuberkulose. Derudover påvirker den latente strøm af intravaskulær hæmokoagulering, der naturligt følger med tuberkulose sygdomsforløbet og effektiviteten af kemoterapi.

Hos patienter med pulmonal TB prævalens af exudativ inflammation komponent af den observerede nedgang i blod antikoagulationsaktivitet. Hos patienter med en lav forekomst af en specifik læsion i lungerne med en overvægt af produktiv hemocoagulation intravaskulær inflammatorisk komponent udtrykt smule. Hos patienter med lungetuberkulose med hæmoptyse og pulmonal blødning tilstand blodstørkningssystemet er anderledes: i patienter med tab lavt blod på højden gemoptoe eller umiddelbart efter afslutning der er en skarp stigning i blodets koagulation evne på grund af alvorlig intensivering af trombinoobrazovaniya samtidig opretholde forøget "strukturel" koagulation. Hos patienter med massive blodtab observerede fald koaguleringsevne på bekostning af sænkning af koncentrationen af fibrinogen. Faktor XIII aktivitet, trombocytælling. På stadiet for kirurgisk behandling af patienter med begrænsede former for lungetuberkulose med alvorlige overtrædelser systemet homeostase forekommer. Patienter med udbredt proces i udførelsen af pnevmon- eller plevropnevmonektomii ofte udvikle DIC, som kan være i form af den "anden sygdom."

At overvåge tilstanden af blodkoagulation i patienter med lungetuberkulose bør udføres bestemmelse af den aktiverede partielle tromboplastintid (aPTT), fibrinogen, thrombin tid, prothrombin indeks og blødningstid og koagulationstid.

[38], [39], [40], [41], [42], [43]

Hormonal forskning

Moderne eksperimentelle og kliniske observationer indikerer tilstedeværelsen af ændringer i hormonstatus i en specifik tuberkuløs lungebetændelse. Det er bevist, at korrektionen af dysfunktion af hypofyse-binyre, hypofyse-thyroid systemer og pankreatisk funktion i forbindelse med anti-TB terapi bidrage til aktivering af fibrogenese og reparation på et sted specifik inflammation.

Den funktionelle tilstand af hypofyse-skjoldbruskkirtel-system vurderes ved indholdet i blodserum triiodthyronin (T ₃ ), thyroxin (T ₄ ), hypofyse thyroidstimulerende hormon (TSH). Det er fastslået, at subklinisk hypothyroidisme er opdaget hos 38-45% af patienterne med lungetuberkulose, og oftest diagnosticeres det med disseminerede og fibrøse kavære former for processen. Under disse samme former fleste dramatisk reducerede niveauer af både T ₃ og T ₄, og der kommer en ubalance af disse hormoner i form af forøgelse af forholdet mellem T ₄ / T _s.

Binyrebarkfunktion evalueres ved niveauet af cortisol i blodserum, og endokrin funktion i bugspytkirtlen - koncentration af immunreaktivt insulin. I den akutte fase af den smitsomme sygdom øges behovet for endogent kortisol og insulin. Hyperinsulinæmi vidner også for insulinresistensen af kropsvæv, hvilket er typisk for enhver aktiv inflammatorisk proces, især specifik. Bestemmelse glyukokortiko idnoy-binyrefunktionen med aktiv lungetuberkulose afslører tilstedeværelsen af Cushing hos de fleste patienter. Normale niveauer af koncentration cortisol blod i patienten med smitsom betændelse i den akutte periode bør betragtes som relative fiasko glucocorticoid funktion af binyrebarken, der kan tjene som grundlag for at holde doser effektiv substitutionsbehandling af glucocorticoider.

Næsten en tredjedel af patienterne med lungetuberkulose kan konstatere, at insulinemieniveauet i dem er ret lavt og nærmer sig den nederste grænse for normen, mens 13-20% observerer signifikant hyperinsulinisme. Både relativ hypo- og hyperinsulinisme er høje risikofaktorer for udvikling af overtrædelser af kulhydratmetabolisme af forskellig grad. Disse ændringer i den funktionelle aktivitet af B-celler i bugspytkirtlen kræver regelmæssig overvågning af glykæmi hos patienter med tuberkulose og rettidig forebyggelse af diabetes mellitus. Derudover. Dette tjener som en yderligere begrundelse for hensigtsmæssigheden af at anvende fysiologiske doser af insulin i den komplekse terapi af tuberkulose.

Generelt lavere niveauer af thyroidhormoner og deres ubalance hyperkortisolemi og hyperinsulinisme størst rækkevidde i patienter med alvorligt forløb af tuberkuløse proces, med omfattende lungeskade og alvorlige symptomer på tuberkulose forgiftning.

Mikrobiologisk diagnose af tuberkulose

Mikrobiologiske undersøgelser er nødvendige for at identificere patienter med tuberkulose, kontrollere diagnosen, overvåge og korrigere kemoterapi, evaluere behandlingsresultater, med andre ord fra det øjeblik patienten er registreret ved tuberkulose, inden den tages af.

Alle epidemiologiske programmer og projekter er baseret på en vurdering af antallet af bakterielle udskillere, som ikke kan gøres uden brug af laboratoriemetoder til at detektere mycobakterier tuberkulose. I en undersøgelse af den såkaldte uorganiserede befolkning når andelen af bakterielle angriber 70 eller derover, hvilket gør laboratoriemetoder til et tilstrækkeligt effektivt middel til at identificere tuberkulosepasienter blandt denne befolkningsgruppe.

Traditionelle mikrobiologiske metoder til diagnosticering af tuberkulose er bakterioskopiske og kulturelle studier. Moderne metoder overvejer dyrkning af mycobacterium tuberkulose i automatiserede systemer, indstillingen af PCR. Imidlertid kombinerer alle disse metoder nødvendigvis med klassiske bakteriologiske metoder.

Indsamling af diagnostisk materiale

Effekten af laboratorieundersøgelser afhænger i høj grad af kvaliteten af det diagnostiske materiale. Overholdelse af reglerne for indsamling, opbevaring og transport af diagnostisk materiale og den nøjagtige gennemførelse af patientens vurderingsalgoritme påvirker direkte resultatet og sikrer biologisk sikkerhed.

Til test på tuberkulose anvendes en række forskellige materialer. Skyldes, at TB logkih- mest almindelige form tuberkuloese læsioner, grundmaterialet for forskning Overvej spyt og andre former for aftagelig tracheobronkiale: øvre luftveje sekreter opnået efter aerosolinhalering: bronchiale vaskninger; bronchoalveolar skylninger; materiale opnået ved bronkoskopi, og intrapulmonær transtracheal biopsier fra bronkiale udsugninger, larynx podninger, ekssudater fra sår og udstrygninger al.

Effektiviteten af forskningen øges, hvis en kontrolleret samling af materiale fra en patient udføres. Til dette formål tildeles et særligt udstyret værelse eller der købes specielle førerhuse. Indsamling af materiale er en farlig procedure, derfor er det nødvendigt at indsamle materiale til forskning, der overholder reglerne for smitsom sikkerhed.

Materialet til testning på mycobacterium tuberculosis opsamles i sterile flasker med tæt skruede hætter for at forhindre forurening af miljøet og beskytte det opsamlede materiale mod forurening.

Hætteglas til indsamling af diagnostisk materiale skal opfylde følgende krav:

• skal være fremstillet af slagfast materiale
• bør let smelte under autoklavering;
• være tilstrækkeligt volumen (40-50 ml):
• have en bred åbning til sputumindsamling (diameter ikke mindre end 30 mm)
• være lette at håndtere, gennemsigtig eller gennemskinnelig, så du kan vurdere mængden og kvaliteten af den indsamlede prøve uden at åbne låget.

For at opnå optimale forskningsresultater skal følgende betingelser overholdes:

• Saml materialet inden starten af kemoterapi;
• Materialet til undersøgelsen skal indsamles inden morgenindtagelse af mad og medicin;
• Til forskning er det ønskeligt at indsamle mindst 3 prøver af morgenslem. Saml sputum i 3 på hinanden følgende dage;
• Det samlede materiale skal leveres til laboratoriet så hurtigt som muligt:
• I det tilfælde, hvor det umiddelbart er umuligt at levere materialet til laboratoriet, opbevares det i køleskabet ved en lufttemperatur på 4 ° C i højst 48 timer.
• Ved transport af materialet er det nødvendigt at nøje overvåge hætteglassets integritet.

Korrekt opsamlet sputum er slim eller mucopurulent. Det optimale volumen af det testede sputum er 3-5 ml.

Sputum samles under tilsyn af en læge. Personer med ansvar for sputumindsamling bør følge gennemførelsen af visse regler:

• Det er nødvendigt at forklare patienten formålet med undersøgelsen og behovet for at hoste op ikke spyt eller nasopharyngeal slim, men indholdet i det dybe luftveje. Dette kan opnås som et resultat af en produktiv hoste, der opstår efter flere (2-3) dybe vejrtrækninger. Det er også nødvendigt at advare patienten om, at han skal skylle munden med kogt vand for at fjerne hovedparten af mikrofloraen, der vegeterer i mundhulen og madrester, der hæmmer undersøgelsen af sputum;
• en læge, der deltager i sputumopsamling, ud over en badekåbe og en hat skal have en maske, gummihandsker og et gummiblad;
• står bag patienten, anbefales han at holde flasken så tæt som muligt på læberne og straks adskille den ind i slem, da den hoster, og det skal sikres, at luftstrømmen er rettet væk fra sundhedsarbejderen:
• Efter færdiggørelsen af sputumindsamlingen skal sundhedspersonalet omhyggeligt lukke hætteglasset med et låg og vurdere mængden og kvaliteten af det opsamlede sputum. Derefter mærkes flasken og placeres i en speciel bix til transport til laboratoriet.

Hvis patienten ikke producerer slim, natten før og tidligt om morgenen på dagen for indsamling af de nødvendige for at give ham en slimløsende :. Et uddrag af rødderne af marshmallow (mukaltin), bromhexin, ambroxol, osv materiale - eller anvende en irriterende indånding anvende udstyr, der er installeret i rummet til at indsamle opspyt. Materialet opsamlet på denne måde er ikke genstand for bevarelse og bør undersøges på dagen for indsamling. For at undgå "culling" i laboratoriet i retningen skal der laves et særligt mærke.

Hvis mikrobiologiske undersøgelser ikke udføres på dette anlæg, skal det indsamlede diagnostiske materiale leveres centralt til laboratoriet, forudsat at materialet bevares i intervallerne mellem leveringer i køleskabet eller ved anvendelse af konserveringsmidler. Lever materiale til laboratoriet i transportkasser, som nemt kan desinficeres. Hver prøve skal forsynes med den relevante etiket, og hele partiet skal fyldes med en ledsagende formular.

[44], [45], [46], [47]

Modeller og hyppighed af undersøgelse af patienter

Ved den første, såkaldte diagnostiske undersøgelse af patienten for tuberkulose er det nødvendigt at undersøge mindst 3 sputumdele i 2 eller 3 dage. Indsamlet under tilsyn af medicinsk personale, hvilket øger effektiviteten af mikroskopi.

Den primære screening for tuberkulose bør udføres af alle medicinske diagnostiske institutioner i sundhedssystemet. For nylig er såkaldte mikroscopiccentre udstyret med moderne mikroskoper og udstyr til epidemisikkerhed blevet organiseret på basis af kliniske diagnostiske laboratorier for at forbedre effektiviteten af den indledende undersøgelse.

I anti-TB-anlæg anvendes en screeningstest, der omfatter sputumundersøgelse eller andet diagnostisk materiale i mindst 3 gange i 3 dage. Under behandlingen udføres mikrobiologiske undersøgelser regelmæssigt mindst en gang om måneden i den intensive kemoterapifase. Ved overgangen til behandlingsfasen udføres undersøgelser sjældnere - med et interval på 2-3 måneder, mens undersøgelsens frekvens reduceres til to.

Funktioner i samlingen af diagnostisk materiale til ekstrapulmonal tuberkulose

Feature patologisk materiale med ekstrapulmonale former for TB - Mycobacterium tuberculosis lav koncentration i den, hvilket kræver en mere følsomme metoder for mikrobiologiske undersøgelser, primært på såning teknikker medium.

Med tuberkulose i det genitourinære system er urin det mest tilgængelige studiemateriale. Urinopsamling bør udføres af en specialuddannet sygeplejerske.

De ydre kønsorganer vaskes med vand med sæbe eller en svag opløsning af kaliumpermanganat. Den udvendige åbning af urinrøret behandles omhyggeligt. I et sterilt hætteglas samles en gennemsnitlig del af morgenurinen: hos mænd, naturligvis hos kvinder, ved hjælp af et kateter. Urin fra nyreskytten opsamles i sterile rør med kateterisering af en eller to nyrer, i sidstnævnte tilfælde - nødvendigvis separat fra hver nyre. En lille mængde af denne urin centrifugeres, sedimentet undersøges.

Hos mænd, sædceller, punkteres testikler, udsættes prostats hemmelighed for centrifugering for at opnå et bundfald. Ved enhver lokalisering af en specifik proces i kønsområdet hos mænd kan prostationsmassage fremme sekretionen af sekreter indeholdende mycobacterium tuberkulose.

Menstruationsblod hos kvinder indsamles ved at suge eller bruge en Kafka-hætte. Det opnåede materiale befries fra røde blodlegemer, vasker det med destilleret vand efterfulgt af centrifugering. Bundfaldet undersøges.

Tildelinger fra livmoderhalsen i livmoderen opsamles i en vis Kafka-kapacitet eller -kapsel, det vil sige at det er ønskeligt at akkumulere 1-2 ml patologisk materiale.

Materiale opnået fra operative indgreb på nyrerne, kønsorganer. Med biopsier, skrabninger fra endometrium, homogenisere. For at gøre dette placeres den i en steril mørtel og knuses grundigt med steril saks. Til denne opslæmning blev tilsat steril flodsand i en mængde svarende til dens vægt, og derefter toppede med 0,5-1.0 ml isotonisk natriumchloridopløsning, og alt blev tritureret, indtil en pastaagtig masse med tilsætning af isotonisk natriumchloridopløsning (4-5 ml). Derefter får massen lov til at afregne i 1-1,5 minutter, supernatanten undersøges.

Tuberkulose af knogler og led. Punctaten (pus af abscesser) opnået med en steril sprøjte placeres i sterile retter og leveres straks til laboratoriet. Steril pipette, der tidligere er fugtet med steril isotonisk natriumchloridopløsning, tager 2-5 ml pus, overfør den til en flaske perler og tilsæt endnu en 2-3 ml isotonisk natriumchloridopløsning. Flasken er lukket med en kork og rystet i et jokerapparat i 8-10 minutter. Den homogeniserede suspension undersøges.

I fistulous former for osteoartikulær tuberkulose tages pus fra fistelen. Den rigelige udledning samles direkte ind i et reagensglas. I tilfælde magert pyorrhea fistel vasket med sterilt isotonisk natriumchloridopløsning, og vaskevæskerne blev opsamlet i et reagensglas, eller det stykke tamponen er imprægneret med pus sendes til analyse.

Det kirurgiske materiale opnået under kirurgiske indgreb på knogler og ledd kan bestå af purulentnekrotiske masser, granuleringer, arvæv, knoglevæv, synovialt membranvæv og andre substrater. Dens behandling udføres som i tuberkulose af nyrerne.

Mikrobiologisk undersøgelse af synovialvæske i 3% natriumcitratopløsning (1: 1 forhold) for at forhindre koagulering udføres umiddelbart efter punkteringen.

Tuberkulose af lymfeknuder. Pusen, der ekstraheres under punkteringen af lymfeknuderne, undersøges også. Som pus af abscesserne. Vævene fra lymfeknuderne opnået under kirurgiske indgreb, biopsier, undersøges som med andre former for tuberkulose.

Undersøgelsen af afføring masser på mycobacterium tuberculosis er yderst sjælden på grund af den næsten samlede mangel på positive resultater.

[48], [49], [50], [51], [52], [53], [54], [55], [56], [57]

Mycobacteriummikroskopi

Sputummikroskopi er en relativt hurtig, enkel og billig metode, der bør anvendes i alle tilfælde med mistænkt tuberkulose. Derudover udføres denne undersøgelse for at evaluere effektiviteten af kemoterapi og for at fastslå genoprettelsen eller manglende behandling, hvis der ikke er nogen kultur test.

To metoder til mikroskopisk undersøgelse anvendes:

• metode til direkte mikroskopi, når et smear fremstilles direkte fra det diagnostiske materiale
• Metode til mikroskopi af et sediment fremstillet ud fra dekontaminerende behandlet materiale til dyrkning.

Den første metode anvendes i de laboratorier, hvor kun mikroskopiske undersøgelser udføres (kliniske og diagnostiske laboratorier i det generelle medicinske netværk).

De bedste resultater af mikroskopisk undersøgelse opnås ved at koncentrere det diagnostiske materiale (for eksempel ved centrifugering).

For at detektere mycobacterium tuberculosis med en sandsynlighed på 50% ved udførelsen af mikroskopien, skal 1 ml sputum indeholde mere end 5000 mikrobielle celler. Sputummet hos patienter med lungerformer af tuberkulose indeholder sædvanligvis en betydelig mængde syrefaste bakterier, som gør det muligt at påvise dem pålideligt ved bakterioskopi. Den diagnostiske følsomhed ved denne metode kan forbedres ved at undersøge flere sputumprøver fra en patient. Et negativt resultat af en bakterioskopisk undersøgelse udelukker ikke diagnosen tuberkulose, da sputum fra nogle patienter indeholder mindre mykobakterier end detekteres ved mikroskopi. Dårlig forberedelse af sputum smear kan også forårsage et negativt resultat af en bakterioskopisk undersøgelse.

Den mest almindelige metode til påvisning af syrefaste mykobakterier i smøret er farve ifølge Tsiol-Nelsen. Fremgangsmåden er baseret på penetrationen carbolsyre fuchsin i den mikrobielle celle membran omfattende et voksagtigt lipidlag med samtidig udsættelse for varme og kraftig indsats ætsemiddel phenol. Efterfølgende desaturering smøre 25% opløsning af svovlsyre eller saltsyre alkohol 3% fører til misfarvning af syrefaste strukturer. De misfarvede elementer i smøret er farvet med en 0,3% opløsning af methylenblåt. Mycobakterier tager ikke almindelige anilin farvestoffer, hvilket resulterer i syrefaste baciller farves højrød farve og andre bakterier og cellulære elementer - i blåt.

For smears farvet med Ziehl-Nelsenu bruge lys binokulært mikroskop med olieimmersion linse (90- eller 100-fold stigning) og okularet til 7- eller 10 gange forstørrelse. Udforsk 100 synsfelt, som er nok til at identificere enkelte mykobakterier i smøret. I tilfælde af at resultatet af en sådan undersøgelse er negativ, anbefales det at se yderligere 200 synsfelter til bekræftelse. Optag resultaterne, hvilket angiver antallet af detekterede syrefaste baciller (KUM).

Ud over denne teknik anvendes farvefluorokromer til luminescerende mikroskopi, hvilket gør det muligt at opnå de bedste resultater. Anvendelsen af denne metode øger effektiviteten af mikroskopien med 10-15%. Ved behandling af mykobakterier med luminescerende farvestoffer (auramin, rhodamin, etc.) binder disse stoffer også til de vokslignende strukturer i den mikrobielle celle. Ved bestråling af farvede celler med en spændende lyskilde (et bestemt spektrum af ultraviolet stråling) begynder de at gløde med orange eller lyst rødt lys på en sort eller mørkegrøn baggrund. På grund af den synlige billedets høje lysstyrke og kontrast kan den samlede forstørrelse af mikroskopet reduceres 4-10 gange, synsfeltet udvider og forberedelsens visningstid falder. Sammen med dette på grund af den meget større dybdeskarphed kan du øge undersøgelsens komfort.

Når fluorescensmikroskopi anvendes til at scanne det samme område, udbreder smøret signifikant mindre tid end lysmikroskopi af Tsiol-Nelsen-farvningen. Hvis en arbejdsdag undersøger et mikroskop omkring 20-25 sådanne udtværinger, så kan han ved hjælp af fluorescensmikroskopi undersøge mere end 60-80 prøver på samme tid. Erfarne mikroskopere ved, at farvningen af celler med en blanding af auramin og rhodamin på en eller anden måde er specifik for syrefaste baciller, som i dette tilfælde ligner guldpinde. Saprophytter er malet i grønlig farve.

En anden vigtig fordel ved metoden til fluorescerende mikroskopi - evnen til at detektere ændret Mycobacterium, tabt under indflydelse af negative faktorer, herunder intensiv kemoterapi, kislotousotoychivosti ejendom og er ikke påvist i forbindelse med denne farvning Ziehl-Nelsenu.

Ulemperne ved fremgangsmåden til fluorescensmikroskopi indbefatter den relativt høje pris for mikroskopet og dets drift. Men i centraliserede eller andre store laboratorier, hvor belastningen overstiger normen for 3 laboratorieteknikere, der arbejder med tre konventionelle mikroskoper, er det i stedet billigere at bruge et fluorescerende mikroskop.

Bakterioskopiske metoder har ret høj specificitet (89-100%). Ca. 97% af de positive resultater opnået ved en hvilken som helst metode til mikroskopi bekræftes entydigt af resultaterne af såningen.

Det skal bemærkes, at når mikroskopisk undersøgelse af smøret af patologisk materiale er det umuligt at bestemme arten tilhørende de identificerede syrefaste mykobakterier. Mikroskopi metode gør det muligt at udtale sig kun på tilstedeværelse eller fravær af syre til fremstilling af mikroorganismer, hvilket kan forklares ved tilstedeværelsen i naturen af et stort antal af morfologisk ligner tuberkuløse mykobakterier komplekse nontubercular sure resistente mikroorganismer.

Resultaterne af mikroskopi evalueres i semiquantitative enheder.

For at kunne sammenligne resultaterne fra forskellige metoder til mikroskopi introduceres empiriske koefficienter. For eksempel for at sammenligne resultaterne af udstrygninger farvet med fluorescerende farvestoffer, de data forskning lysmikroskop (1000 ganges forstørrelse), er det nødvendigt at opdele antallet af syrefaste baciller detekteres af fluorescensmikroskop, den tilsvarende koefficient ved 250 gange forstørrelse - til 10, 450 gange - til 4, med 630 gange - til 2.

Egenskaber ved mikroskopi til ekstrapulmonal tuberkulose

Direkte mikroskopi udføres såvel som mikroskopi af udstrygninger fremstillet efter berigelse efterfulgt af Tsiol-Nelsen-farvning eller luminescerende farvestoffer. Direkte mikroskopi af udstødninger er ineffektiv på grund af en lav koncentration af mykobakterier i materialet, og derfor er det mere rationelt at anvende berigelsesmetoder. Den mest effektive er centrifugering. Hvis det biologiske materiale er viskøst, anvendes centrifugering med samtidig homogenisering og kondensation af materialet, som udføres under anvendelse af højhastighedscentrifuger med en centrifugeringskraft på 3000 g og hypochloritopløsninger. Andre metoder til berigelse, såsom mikroflotation, anvendes i øjeblikket ikke på grund af dannelsen af biologisk farlige aerosoler.

[58], [59], [60], [61], [62]

Den kulturelle metode til diagnose af tuberkulose

Metoden til såning eller dyrkningsmetoden er mere følsom end smearmikroskopi og har en række fordele i forhold til sidstnævnte. Det giver mulighed for at opdage flere snesevis af levedygtige mykobakterier i testmaterialet og har stor diagnostisk værdi. Dette er især vigtigt, når man undersøger et materiale fra nyligt diagnosticerede eller behandlede patienter, som frigiver en lille mængde mycobakterier.

Sammenlignet med mikroskopi giver kulturforskning mulighed for at øge antallet af TB-patienter, der er diagnosticeret med mere end 15-25%, samt at verificere tuberkulose i tidligere stadier, når sygdommen stadig kan behandles. En meget vigtig fordel ved kulturtesten er muligheden for at opnå en exciterkultur, der kan identificeres og studeres med hensyn til lægemiddelfølsomhed, virulens og andre biologiske egenskaber.

Ulemperne med dyrkningsmetoder indbefatter deres varighed (materialets ventetid når 10 uger). Højere omkostninger, kompleksitet ved behandling af diagnostisk materiale.

Principper for presowing behandling af diagnostisk materiale

Konventionelle mikrobiologiske metoder kan ikke anvendes til undersøgelser af tuberkulose. Dette skyldes det faktum. At mycobacterium tuberculosis vokser meget langsomt, og de fleste kliniske prøver indeholder hurtigt voksende pyogene og putrefaktive mikroorganismer, svampe. Deres hurtige vækst på rige næringsmedier interfererer med udviklingen af mykobakterier og tillader ikke isolering af tuberkulosens forårsagende middel, så det diagnostiske materiale skal forbehandles før sådd. Desuden er mykobakterier udgivet fra patientens luftveje omgivet af en stor mængde slim, hvilket gør det vanskeligt at koncentrere sig. I denne henseende er det nødvendigt, inden de plantes sputum og andre lignende materialer, deres kondensering, dekontaminering.

Alle vaskemidler og decontaminer har en mere eller mindre udtalt toksisk virkning på mykobakterier. Som et resultat af forarbejdning kan op til 90% af mykobakterierne dø. For at holde nok af mycobakterielle befolkning, skåner behovet for at bruge behandlingsteknikker, der tillader, på den ene side, til at undertrykke de hastigt voksende pyogene bakterier og rådden, og på den anden - for at bevare levedygtigheden af mykobakterier til stede i materialet.

Afhængig af materialet, dens grad af homogenitet og forurening til forbehandling under anvendelse af forskellige dekontamineringsmiddel: Spyt - 4% natriumhydroxidopløsning, opløsninger trohzameschonnogo natriumfosfat 10%, benzalkoniumchlorid, trinatriumphosphat, NALC-NaOH (N-acetyl-L-cystein natriumhydroxid) i en slutkoncentration på 1% NaOH, i urin og andre flydende materialer - svovlsyreopløsning 3%, for de forurenede prøver, fedtholdige materialer - opløsning af oxalsyre til 5%. Derudover anvendes i nogle tilfælde enzymer, overfladeaktive midler (vaske- og rengøringsmidler). Anvendelsen af Tween og nogle andre vaskemidler ledsages af en mindre død af mycobakterielle celler (40-50% overlever). De kan dog kun bruges til flydende materialer. Den største fordeling i verden var NALC-NaOH. Produceret i sæt. Denne metode giver mulighed for at tildele mere end 85% af befolkningen af mycobakterielle celler. Dekontaminering tkanesoderzhaschih faststoffer sværere at gætte fordi graden af dispersion af materialet under homogeniseringen vanskelig. For eksempel ledsages behandling af biopsier af lymfeknuder ofte med en øget kontamineringsfrekvens ved ekstern flora. I dette tilfælde kan 1% etonium anvendes.

Ikke-homogent materiale homogeniseres med glasperler i nærværelse af dekontaminanter. De flydende materialer for-centrifugeres, og kun et bundfald behandles.

Sånings- og inkubationsteknikker

Efter forbehandling centrifugeres materialet, hvorved mykobakterierne udfældes og deres indhold i sedimentet ("slam berigelse") forøges. Det resulterende bundfald neutraliseres og inokuleres (inokuleres) med tætte næringsmedier eller rør med flydende (halvflydende) medier. Fra resten af sedimentet udarbejdes smears til mikroskopisk undersøgelse. Såningsteknikken bør forhindre krydskontaminering af det diagnostiske materiale.

For en pålidelig klinisk fortolkning af resultaterne af en mikrobiologisk undersøgelse skal følgende regel overholdes: Mikroskopiske og kulturstudier skal udføres parallelt fra samme prøve af det diagnostiske materiale.

De podede rør anbringes i en termostat ved 37 ^° C i 2 dage i en vandret position. Dette sikrer en mere jævn absorption af materialet i kulturmediet. Efter 2 dage overføres rørene lodret og hermetisk forseglet med gummi- eller silikontilslutninger for at forhindre tørring af det såmede medie.

Afgrøder inkuberes ved 37 ^om C i 10-12 uger med normal ugentlig visning. For hver forhåndsvisning registreres følgende parametre:

• perioden visuelt observeret fra dagen for såningstilvækst
• vækstrate (antal CFU'er);
• forurening af afgrøden med en fremmed mikrobiell flora eller svampe (sådanne rør fjernes);
• mangel på synlig vækst. Rørene er efterladt i termostaten indtil næste visning.

Næringsmedier

Forskellige næringsmedier anvendes til dyrkning af mykobakterier; tæt, halvflydende, flydende. Intet af de kendte næringsmedier har imidlertid egenskaber, der sikrer væksten af alle mycobakterielle celler. I forbindelse med dette anbefales 2-3 næringsmedier med forskellig sammensætning at blive brugt samtidig for at øge effektiviteten.

WHO anbefaler Levenstein-Jensen-miljøet som standardmedium til primær isolering af tuberkulosens forårsagende middel og til bestemmelse af dens følsomhed. Dette er et tæt ægmiljø, hvorpå væksten af mykobakterier opnås på den 20.-25. Dag efter at have sådd et bakterioskopisk positivt materiale. Afgrøder af bakterioskopisk negativt materiale kræver en længere inkubationsperiode (op til 10-12 uger).

I vores land er den foreslåede E.R. Finn æg miljø Finn-II. Det adskiller sig i, at det i stedet for L-asparagin bruger natriumglutamat, som udløser andre måder at syntetisere mycobakterierne på. Vækst fremkommer på dette medium lidt tidligere, og hyppigheden af tildeling af mykobakterier er 6-8% højere end i Lowenstein-Jensen-mediet.

For at forbedre effektiviteten af bakteriologisk diagnose af ekstrapulmonal tuberkulose er det tilrådeligt at inkludere modificeret Finn-II medier i næringsmediernes kompleks. For at accelerere væksten tilsættes et natriumthioglycolat 0,05%, som reducerer koncentrationen af oxygen, desuden til Finn-II næringsmediet. For at beskytte mycobakteriernes enzymsystemer fra giftige lipidperoxidationsprodukter i Finn-II næringsmediet tilsættes antioxidant-a-tocopherolacetat i en koncentration på 0,001 μg / ml. Såningen af det diagnostiske materiale udføres ifølge en standardprocedure.

I Ruslands anti-tuberkuloselaboratorier anvendes andre modifikationer af tætte næringsmedier; foreslået G.G. Mordovian næringsmedium "New", udviklet af V.A. Aniciske næringsmedier A-6 og A-9 osv.

På grund af det faktum, at i processen med kemoterapi er beskadigelse af forskellige metaboliske systemer af mikrobielle celler, nogle mycobakterielle befolkning mister evnen til at udvikle sig normalt i konventionelle næringsmedier og kræver osmotisk balance (eller halvflydende) kulturmedier.

Vurdering og registrering af såningsresultater af diagnostisk materiale

Nogle stammer og arter af mykobakterier vokser langsomt, væksten kan forekomme selv ved den 90. Dag. Antallet af sådanne afgrøder er lille, men det gør det muligt at modstå afgrøder i en termostat i 2,5-3 måneder.

Virulente kulturer af mycobacterium tuberculosis vokser normalt på tætte ægmiljøer i form af R-form kolonier af forskellige størrelser og arter. Kolonier tørre, rynket, elfenben, lidt pigmenteret. I andre medier kan kolonien af mycobacterium tuberkulose være mere fugtig. Efter et kursus af kemoterapi eller under behandling kan glatte kolonier med fugtig vækst (S-former) tildeles.

Ved isolering af afgrøder anvendes et sæt specialstudier til at skelne mycobacterium tuberculosis fra ikke-tuberkulose mykobakterier og syrefaste saprophytter.

Et positivt svar gives efter en obligatorisk mikroskopisk undersøgelse af det farvede Tsiol-Nelsen-smear fra de dyrkede kolonier. I tilfælde af vækst af mykobakterier i udstødninger er der fundet lyse røde stifter, der alene eller i grupper danner klynger i form af filt eller fletninger. Hos unge kulturer, især isoleret fra langtidsbehandling af patienter med kemoterapi, mycobakterier afvige det udtrykte polymorfi, indtil tilstedeværelsen af stavformede, sammen med korte, næsten coccoide eller aflange versioner, der ligner mycelium.

Væksthastigheden for mykobakterier er angivet ved følgende skema: (+) - 1-20 cfu in vitro (scant bacterial excretion); (++) - 20-100 CFU in vitro (moderat bakteriel udskillelse); (+++) -> 100 CFU in vitro (rigelig bakteriel udskillelse). I laboratoriediagnosen af tuberkulose er det ikke nok at svare på, om mycobakterien er påvist ved en eller anden metode. Have en detaljeret forståelse af omfanget og arten af den mykobakterielle population, dens sammensætning og egenskaber. Det er disse data, som giver os mulighed for korrekt at fortolke procesens tilstand, planlægge taktik og rette behandlingen korrekt.

I de senere år er der foreslået næringsmedier på agarbasis med forskellige vækstadditiver og anvendelsen af en særlig gasblanding for at fremskynde væksten af mykobakterier. For at opnå væksten af mykobakterier på disse medier, under dyrkning, skabes en atmosfære med et højt indhold af carbondioxid (4-7%). Særlige CO ₂ -inkubatorer anvendes til dette formål . Men de mest udviklede automatiserede systemer til dyrkning af mykobakterier: MGIT-BACTEC-960 og MB / Bact.

Et sådant system - MGIT systemet (mycobakterier vækst indikerer rør), der henviser til udvikling af højteknologiske og er beregnet til hurtig bakteriologisk diagnose af tuberkulose og Mycobacterium modtagelighed for first-line lægemidler og nogle andengenerationsantibiotika. MGIT er fokuseret på at bruge det som en del af VASTES-960-enheden. Mikroorganismer dyrkes i specielle rør med et flydende næringsmedium baseret på det modificerede Middlebrook-7H9 medium. For at stimulere væksten af mykobakterier og undertrykke væksten af fremmed mikroflora anvendes MGIT Growth Supplement og en blanding af PANTA antibakterielle lægemidler.

Væksten af mikroorganismer optages optisk. Det er baseret på fluorescens, som opstår, når ilt forbruges af mykobakterier under vækst. Oxygenafhængige fluorokromiske farvestoffer findes på bunden af et specielt testrør og dækket af et lag silicone. Reproduktion mycobakterier fører til et fald i mængden af oxygen i røret og reducere koncentrationen, der forårsager en stigning i fluorescens, som bliver synlig under bestråling med ultraviolet lys rør og automatisk registreret fotosensor indbygget apparat VASTES-960. Intensiteten af luminescens registreres i vækstenheder (GU-vækst-enheder). Vækstdataene registreres i computeren, hvor de kan gemmes automatisk. Computer analyse af vækstkurver kan give oplysninger om forekomsten af en række forskellige Mycobacterium puljer, herunder nontubercular, og hjælper også til at evaluere vækst- egenskaber mykobakterier.

Som følge af tidspunktet for fremkomsten af sådanne systemer mycobakteriel vækst reduceres signifikant, gennemsnitligt 11 dage VASTES-960 og 19 dage på MB / Bact til 33 dage på standard fast næringsmedium. Det skal bemærkes, at disse systemer kræver højt kvalificeret personale. Seeding materiale til flydende medier vil blive eskorteret af udsåning på Lowenstein-Jensen-medium, spiller rollen som dubleant i tilfælde, hvor andre medier af Mycobacterium tuberculosis ikke tillader vækst.

[63], [64], [65], [66], [67], [68], [69], [70], [71]

Bestemmelse af mycobakteriers medikamentfølsomhed

Bestemmelsen af spektret og graden af følsomhed for mykobakterier mod anti-tuberkulosemedicin er af stor klinisk betydning såvel som til den epidemiologiske evaluering af spredning af tuberkulose med lægemiddelresistens. Derudover gør overvågning af narkotikaresistens det muligt at vurdere effektiviteten af tuberkulose-programmet som helhed, idet det er en integreret indikator for udførelsen af alle bestanddele af anti-tuberkuloseaktiviteter.

Multiplikation og timing af narkotikafølsomhed:

• før behandlingens start en gang for at bestemme strategi og taktik for behandling:
• når de isoleres fra syge kulturer fra forskellige materialer (sputum, BAL væske, urin, ekssudater, væske, etc.) undersøges alle isolerede stammer:
• i slutningen af den intensive behandlingsfase i mangel af klinisk og radiologisk dynamik:
• hvis det er nødvendigt at ændre behandlingsregimen i følgende tilfælde:
  • fravær af sputum smear;
  • re-isolering af kultur efter sputum-smear-negativ;
  • en drastisk stigning i antallet af CMU i swab efter den oprindelige nedgang. Det er velkendt, at stammer af mycobacterium tuberculosis, som er heterogene med hensyn til lægemiddelfølsomhed, isoleres fra materialet fra en patient med tuberkulose. Stammenes følsomhed over for anti-tuberkulosemedier kan variere inden for rækkevidde af stoffer, grad, hyppighed og forekomst af resistens.

Graden af lægemiddelresistens af Mycobacterium tuberculosis blev bestemt i overensstemmelse med fastlagte kriterier, som er fokuseret på den kliniske betydning og stabilitet afhænge af aktiviteten af anti-TB lægemiddel, dets farmakokinetik koncentrationen i læsionen. Den maksimale terapeutiske dosis og så videre.

Bestemmelsen af mycobakteriers medikamentfølsomhed udføres for øjeblikket ved mikrobiologiske metoder:

• Absolutte koncentrationer (fortyndingsmetode på tætte eller flydende næringsmedier),
• proportioner,
• modstandskoefficient.

Normalt stabilitet manifesteret som visuelt observerbare kolonivækst af Mycobacterium tuberculosis, men der er teknikker, der inducerer de tidlige stadier af vækst i delende celler af Mycobacterium i form af farvereaktion. Disse metoder forkorter testtiden fra 3-4 til 2 uger.

Som forenet i Rusland er blevet udvidet, anbefalet af kemoterapi metode absolutte koncentrationer WHO udvalg, som er fra et metodologisk synspunkt, er det mest enkle, men det kræver stor præcision og standardisering af laboratorieprocedurer. Lægemiddelmodtagelsestesten består af et sæt reagensglas med et næringsmedium modificeret med anti-TB-lægemidler. Sættet består af 2-3 rør med forskellige koncentrationer af hver af de lægemidler, der anvendes, et kontrolrør uden lægemiddel for miljøet og et rør indeholdende 1000 mcg / ml natrium Sali tsilovokislogo eller 500 ug / ml paranitrobenzoynoy syre nontubercular at detektere vækst af mykobakterier.

For at forberede et sæt medier med præparater anvendes et modificeret Levenstein-Jensen medium (uden stivelse), der hældes i kolber. I hver af kolberne tilsættes et specifikt volumen af passende fortynding af det antituberkuløse præparat. Indholdet af kolberne blandes grundigt, hældes i rør og foldes i en skrånende stilling i 40 minutter ved en temperatur på 85 ° C. Det anbefales at spole mediet i en elektrisk rewinder med automatisk temperaturregulering. Onsdag med anti-TB-stoffer

1-st-serien kan opbevares i køleskabet ved 2-4 ° C i 1 måned, med præparater af anden række - ikke mere end 2 uger. Opbevaring af medier med præparater ved stuetemperatur er uacceptabel. Ved fremstilling af opløsninger af anti-tuberkulosemediciner tages der hensyn til deres aktivitet, beregning af koncentrationen justeret for molekylvægten af den ikke-specifikke del af præparatet, renhed mv. For at bestemme stoffets følsomhed anvendes kun kemisk rene stoffer.

Princippet med metoden er at bestemme koncentrationen af et antituberkuløst lægemiddel, der hæmmer væksten af en væsentlig del af den mykobakterielle population. Hvis det gøres korrekt, har denne metode en god pålidelighed.

Før testen er det nødvendigt at sikre, at den isolerede kultur af mycobacterium tuberculosis ikke har fremmed mikroflora. Fra mycobakteriens kultur i 0,9% natriumchloridopløsning fremstilles en homogen suspension, der indeholder 500 millioner mikrobielle legemer pr. Ml (optisk turbiditetsstandard på 5 enheder). Den resulterende opslæmning fortyndes med 0,9% natriumchloridopløsning (1:10), og der tilsættes 0,2 ml opslæmning til hvert rør af sættet med dyrkningsmedier. De inokulerede Rørene blev anbragt i en inkubator ved 37 ° C og holdt i en horisontal position i 2-3 dage til den skrå overflade af mediet blev jævnt inokuleret med en suspension af Mycobacterium tuberculosis. Rørene overføres derefter til en lodret position og inkuberes i 3-4 uger. Resultaterne registreres efter 3-4 uger.

Fordi timingen af middel-frigivelse fra klinisk materiale på næringssubstrater udgør kan opnås mindst 1-1,5 måneder medikamentsusceptibilitet ved denne metode er ikke tidligere end efter 2-2,5 måneder efter podning materiale. Dette er en af de største ulemper ved metoden.

Fortolk resultaterne af bestemmelsen af mycobakteriernes narkotikafølsomhed på grundlag af visse kriterier. På fast dyrkningsmedium anses følsom for koncentrationen af lægemidlet, der er indeholdt i mediet, hvis antallet af kolonier af mycobakterier dyrket in vitro med dette stof er ikke mere end 20 med rigelige vækst i styrerøret uden stoffer. Kun i nærværelse af mere end 20 kolonier anses kultur som resistent over for denne koncentration. I praksis opnår man vækstvækst i reagensglas tæt på 20 cfu. Det er nødvendigt at underrette den kliniske enhed om, at følsomhed eller modstand i dette tilfælde er grænseoverskridende, da det nogle gange kan forklare den klare dynamik i kliniske indikatorer.

For forskellige lægemidler etableres en vis koncentration, hvor reproduktionen af den kritiske andel af den mykobakterielle population observeres. Disse koncentrationer kaldes "kritisk". Som et kriterium for stabilitet anvendes væksten af populationen af mykobakterier på et næringsmedium med et præparat ved en kritisk koncentration.

I den indenlandske TB-praksis er de ved bestemmelse af lægemiddelresistensen ikke begrænset til kun at bestemme kritiske koncentrationer. Dette skyldes det faktum. At den udvidede definition niveau af lægemiddel resistens tillader klinikeren mere nøjagtigt at positionere taktik kemoterapi under anvendelse af kendskab potensere virkningen af lægemiddelkombinationer, på kryds og tværs forventede resistens eller at anvende en mere effektiv medicin gruppe, der anvendes anti-TB-medicin.

Den absolutte koncentrationsmetode er den enkleste, men det er også den mest følsomme over for de fejl, der gøres, når den udføres. Mere pålidelige, især ved at bestemme følsomheden over for andre lægemidler, og almindelig udenfor Rusland er metoden for proportioner. Det tager hensyn til manglerne i metoden for absolutte koncentrationer, men i udførelse er det mere besværligt.

Metoden ligner meget den absolutte koncentrationsmetode. Forberedelse af reagensglas med medicin udføres på samme måde. Som i den absolutte koncentrationsmetode. Frødosis af suspensionen af mycobacterium tuberculosis reduceres dog med en faktor på 10. Som eliminerer hyppigheden af spontan modstand af nogle stammer af mycobacterium tuberculosis til sådanne lægemidler som Etambutol, protionamid, capreomycin. Som kontrol anvendes 2 eller 3 rør med en frødosis, der er lige i reagensglasene, successivt fortyndet 10 og 100 gange. Kriteriet om stabilitet er andelen af visuelt observeret vækst af mycobacterium tuberculosis. For lægemidler i 1. Serie er stabilitetskriteriet overskuddet af vækst på 1% af den oprindelige population, for lægemidlet i anden række - en stigning på 1 eller mere end 10% af initialen afhængigt af den valgte kritiske koncentration.

I 1997 har en arbejdsgruppe af WHO og International Union for identifikation af god tuberkulose TB lægemiddelresistens foretaget justeringer til disse kriterier, der tilbyder betragtes som resistente mycobakterier, der vokser på faste æg medier Lowenstein-Jensen ved følgende koncentrationer:

• dihydrostreptomycin - 4 μg / ml;
• isoniazid 0,2 μg / ml:
• rifampicin 40 μg / ml:
• Ethambutol - 2 μg / ml.

I 2001 blev der foreslået kritiske koncentrationer for følgende lægemidler på anden linje (for en kritisk andel på 1%):

• capreomycin - 40 mcg / ml;
• protionamid - 40 mcg / ml;
• kanamycin - 30 μg / ml;
• viomycin - 30 mcg / ml;
• cycloserin 40 μg / ml;
• aminosalicylsyre - 0,5 μg / ml;
• ofloxacin - 2 μg / ml.

Vækstresultaterne evalueres efter 4 uger som en foreløbig og efter 6 ugers dyrkning - som den endelige.

For at bestemme stoffets følsomhed overfor pyrazinamid, som er meget anvendt i moderne kemoterapi til tuberkulose, er den anbefalede kritiske koncentration 200 μg / ml. Imidlertid er der stadig ingen almindeligt accepteret fremgangsmåde til bestemmelse af lægemiddelresistens over for dette lægemiddel på faste næringsmedier, da dets antibakterielle aktivitet kun manifesteres i surt medium (pH <6), hvilket er teknisk vanskeligt at opretholde. Derudover vokser mange kliniske kulturer af mycobacteria tuberculosis modvilligt på ægmiljøer med et surt miljø.

At evaluere kvaliteten af resultaterne af resistensbestemmelse af Mycobacterium, anbefales, at hver ny batch af medie LJ styre parallel bestemmelse af følsomheden af standard museum stamme H37Rv. Derudover er der visse mikrobiologiske kriterier, som skal opretholdes, således at teknikkerne giver et godt reproducerbart og korrekt fortolket resultat. Heriblandt levedygtigheden af kulturen i Mycobacterium tuberculosis, reglerne for opnåelse en homogen suspension og suspensionskulturer af reglerne for Mycobacterium tuberculosis, er repræsentative for den valgte bakterielle masse udvælgelse. Pålideligheden af bestemmelsen af lægemiddelresistens falder med en ekstremt knap bakteriel frigivelse.

For nylig er en metode til bestemmelse af lægemiddelfølsomhed ved hjælp af automatiserede systemer blevet betragtet som lovende. Den mest perfekte i dette område er udviklingen baseret på VASTES MGIT-960. I dette tilfælde bestemmes lægemiddelfølsomheden af mycobacterium tuberculosis på basis af en modificeret proportionsmetode. I bestemmelsesprocessen sammenlignes væksthastigheden for mycobacterium tuberculosis i et kontrolrør og i reagensglas med lægemidler. At bestemme følsomheden over for streptomycin, isoniazid, rev-pitsinu og ethambutol anvendes berigende tilsætningsstoffer og antibiotika i sættet SIRE kit. For at bestemme følsomheden over for pyrazinamid skal du bruge PZA-kittet. I løbet af suspension test Mycobacterium tuberculosis inokuleret reagensglas med narkotika samt kontrolglassene med rekonstitueret suspension 100 gange for alle stoffer undtagen pyrazinamid, hvor suspensionen er fortynding af 10 gange. Kriteriet om stabilitet er vækstindikatoren for mykobakterier på 100 GU, når vækst opnås i kontrolrøret 400 GU (se "Kulturmetoder til isolering af mykobakterier"). Regnskab og fortolkning af resultaterne udføres automatisk og indstilles af input eller det valgte program.

Som kritiske koncentrationer anvendes slutkoncentrationer i et reagensglas med et flydende næringsmedium. På nuværende tidspunkt er der udviklet kritiske koncentrationer til både 1-line og 2-line medicin. Det skal bemærkes, at følsomheden af mycobacteria tuberculosis til cycloserin og aminosalicylsyre kun bestemmes på ægnæringsmedier.

En detaljeret arbejdsprotokol på det beskrevne system gør det muligt at studere lægemiddelmodtagelighed både på en isoleret kultur (med et tæt næringsmedium) og ved anvendelse af den primære vækst af mycobacterium i et MGIT-rør. Sidstnævnte mulighed reducerer tiden for kultur, så du kan få det fulde resultater af kulturen i Mycobacterium tuberculosis (herunder oplysninger om narkotika følsomhed) efter 3 uger fra datoen for opsamling af materialet, mens den traditionelle metode er det muligt at opnå kun det 3. Måned. Med tiden kan de opnåede resultater, når patienten er i en intensiv behandlingsfase, kompensere for de relativt høje omkostninger ved forskning.

[72], [73], [74], [75], [76], [77], [78], [79]

Differentiering af mykobakterier

Under hensyntagen til, at de anvendte næringsmedier ikke er strengt selektive. Den efterfølgende differentiering af de isolerede mykobakterier er anerkendt som obligatorisk. Behovet for differentiering af mycobakterier skyldes en række karakteristiske træk ved patologiske processer forårsaget af slægten: anden retning og udfaldet af tuberkulose og mycobacteriosis, tilstedeværelsen af naturlige medikamentresistens til nogle anti-TB-medicin.

Det anerkendes, at den primære identifikation af Mycobacterium tuberculosis-komplekset M. Nontubercular fra mykobakterier udføres ved følgende egenskaber: vækstraten på faste næringsmedier, pigmentering, kolonimorfologi, tilstedeværelsen af syre modstand og temperatur optimal vækst.

Desværre er der ingen enkelt laboratoriemetode til pålideligt differentiere M. Tuberculosis mycobakterier fra andre syrefaste baciller, alligevel kombinationen af træk beskrevet ovenfor med de nedenfor angivne resultater af en række biokemiske forsøg tillader identifikation af Mycobacterium tuberculosis-komplekset med M. Sandsynligvis 95%.

Til differentieringen af Mycobacterium-komplekset M. Tuberculosis (M. Tuberculosis, M. Bovis, M. BovisBCG, M. Africanum, M. Microti, M. Canettii og andre) fra langsomt voksende mycobakterier anvendes nontubercular grundlæggende biokemiske tests, der registrerer tilstedeværelsen af følgende symptomer:

• evnen til at producere nikotinsyre (niacin test):
• nitratreduktaseaktivitet;
• termostabil katalase;
• vækst på medium med natriumsalicylat (1 mg / ml).

Som yderligere test kan vækst på et medium indeholdende 500 μg / ml paranitrobenzoesyre eller 5% natriumchlorid også anvendes.

Mange bakteriologiske laboratorier identificerer kun disse mikroorganismer på niveauet af komplekset, hvilket skyldes laboratoriernes begrænsede kapaciteter og de metodologiske evner hos specialister.

I de fleste tilfælde, men i praksis til differentiering M. Tuberculosis og M. Bovis er tilstrækkelig følgende prøver: niacin, for tilstedeværelsen af nitrat, registrering tilstedeværelse og pirazinamidazy vækst i medium indeholdende 2 ug / ml hydrazid med thiophen-2-carboxylsyre. Det tages i betragtning, at mycobakterierne i M. Tuberculosis-komplekset er karakteriseret ved følgende sæt tegn:

• langsom vækst (mere end 3 uger);
• vækst temperatur i intervallet 35-37 ^o C;
• fravær af pigmentering (elfenben)
• markeret syrefast farve;
• en positiv niacin test
• en positiv nitratreduktase test
• fravær af termostabil katalase (68 ^° C).
• Fraværet af vækst på et Levenstein-Jensen medium indeholdende:
  • 1000 μg / ml natriumsalicylat,
  • 500 μg / ml paranitrobenzoesyre,
  • 5% natriumchlorid:
• vækst i nærvær af 1-5 μg / ml thiophen-2-carboxylsyre.

Relevansen af differentiering af isolerede mykobakterier vil stige markant med stigningen i hyppigheden af registrering af hiv / aids-tilfælde i forbindelse med tuberkulose eller mycobakterier. På nuværende tidspunkt er der ingen absolut sikkerhed for, at praktiske regionale laboratorier er parate til at udføre denne arbejdsvolumen korrekt.

[80], [81], [82], [83], [84], [85], [86], [87], [88]

Immunologisk diagnose af tuberkulose

Der er en række universelle fænomener, stoffer og immunologiske tests, der oprindeligt blev fundet præcist med tuberkulose eller på modellen af immunresponset mod mykobakterier. Disse omfatter BCG Tuberculin, et sådant fænomen som kutan DTH (tuberkulin - Pirquet og Mantoux reaktion) reaktionen på subkutane tuberkulin sensibiliserede dyr (Koch fænomen). En af de første antistoffer i smitsomme sygdomme blev også påvist i tuberkulose. Selvfølgelig kan jo bredere forståelsen af mekanismerne for antituberkuløs immunitet og deres genetiske kontrol være brugen af immunologiske metoder og lægemidler, som påvirker immuniteten for at løse de praktiske problemer med fytiologi.

Det vigtigste og vanskelige praktiske problem betragtes i øjeblikket som detektion af tuberkulose i massescreening af befolkningen. På trods af de mange rapporter om "succeser" (på begrænset materiale) er der imidlertid ingen egnet immunologisk metode (reproducerbar i "nogen arme") og et lægemiddel der er egnet til dette formål.

Immunologiske metoder, især serologiske undersøgelser (bestemmelse af antigener, antistoffer) og tuberkulinprøvende forsøg anvendes meget i klinisk praksis.

For det første er der blandt de immunologiske undersøgelser, der anvendes i differentialdiagnose, serologiske metoder - bestemmelse af antigener og antistoffer i forskellige miljøer i kroppen.

Specificiteten af antistoffer mod mycobakterier tuberkulose afhænger af antigenerne anvendt i immunoassayet. En signifikant mængde antigener foreslås, hvoraf den første er tuberkulin PPD:

• PAP og andre komplekse præparater fra kulturvæsken;
• ultralydsintegration
• Triton ekstrakt og andre komplekse præparater af cellevægge;
• 5-antigen (Daniel);
• 60-antigen (Coccito);
• lipoarabinomannan;
• ledningsfaktor (trehalose-6,6-di-mycollat);
• phenol og andre glycolipider;
• lipopolysaccharid;
• fibronectin-bindende antigen;
• proteiner (oftest rekombinante); 81,65,38,34,30,19,18,16,15,12 CDA osv.

Som et resultat af mange års forskning af russiske og udenlandske forskere har afsløret de grundlæggende love og effektiviteten af antistoffet serologiske diagnose af tuberkulose: den mere komplekse antigen, den højere følsomhed og lavere specificitet af testen. Specificitet i forskellige lande varierer afhængigt af befolkningen i M. Tuberculosis-infektion og nontubercular mykobakterier fra transporterer BCG-vaccination og andre. Hos børn, at indholdet af serodiagnose oplysninger er lavere end hos voksne. I primær tuberkulose (oftest børn) er definitionen af IgM mere informativ. Med sekundær IgG. Hos HIV-inficerede patienter reduceres den informative værdi af serodiagnose ved bestemmelse af antistoffer. Effektivitet bestemmelse af antistoffer afhænger af antallet af "kliniske aspekter": proces aktivitet (tilstedeværelsen eller fraværet af "isolation" mycobakterier tilstedeværelse henfald af hulrum, graden af infiltration), forekomsten af processen, varigheden af dets strømning.

Sensibiliteten af fremgangsmåden for enzymimmunoassay (ELISA) er ca. 70%. Undersøgelsens utilstrækkelige effektivitet skyldes dets lave specificitet. Tidligere blev muligheden for at anvende serologisk screening i højrisikogrupper, især blandt personer med post-tuberkuloseændringer i lungerne, overvejet.

For at øge specificiteten af ELISA fortsætter søgninger efter mere specifikke antigener, herunder dem der opnås ved genteknologi: ESAT-6 mv. (Se ovenfor). Anvendelsen af strengt specifikke antigener (38 kDa, ESAT) øger specificiteten. Men reducerer analysens følsomhed signifikant. Sammen med IFA (eksperimentel laboratorie testsystemer. E.g. Pathozyme ELISA-kit) tilvejebringer også kits med sideværts immunkromatografisk filtrering (Mycodot), samt andre lignende tests (dot-analyse på membranen) med en visuel vurdering af testresultatet. Under disse test udføres analysen i 10-30 minutter; de kræver ikke særligt udstyr, de kræver en visuel evaluering af resultaterne, som er forbundet med en bestemt subjektivitet. Disse metoder har omtrent samme følsomhed og specificitetskarakteristika (henholdsvis 70% og 90-93%) som den traditionelle ELISA.

Anvendelsen af immunanalysemetoder har en bestemt værdi som en ekstra, der tages i betragtning i det anvendte kompleks af metoder, i differentialdiagnosen af tuberkulose, især ved diagnosen af dets ekstrapulmonale former. Den mest effektive ELISA-metode er ved diagnosen tuberkulose meningitis i undersøgelsen af cerebrospinalvæske. I dette tilfælde er følsomheden af analysen 80-85%, og specificiteten er 97-98%. Der er data om effektiviteten af detektion af antistoffer mod mycobakterier tuberkulose i tårevæske ved diagnosen tuberkuløs uveitis.

Induktion af gamma interferonsyntese in vitro

Gamma interferon (IFN-y) er en specifik immunforsvarsfaktor realiseret ved aktivering af makrofag enzym systemer. Induktion af IFN-y-syntese ved sensibiliserede T-lymfocytter forårsager deres interaktion med antigener af mykobakterier.

Som antigener, der anvendes som tuberkulin PPD. Og de specifikke antigener, er opnået ved gensplejsning, især antigener ESAT-6 (tidligt udskilt antigen med en molekylvægt 6 kDa) og CFP-10 (kulturfiltrat protein 10 kDa). Geneteknik eller rekombinante antigener er fraværende i cellerne i BCG-vaccinen og andre mykobakterier. Ved anvendelse af tuberkulin er resultaterne af induktionstest IFN-y sammenlignelige med resultaterne af tuberkulinhudtesten (direkte korrelation). Ved anvendelse af genetisk manipulerede antigener er testresultaterne mere specifikke og afhænger ikke af tidligere BCG-vaccination. Ved testning af vaccinerede personer, der ikke havde haft kontakt med tuberkuloseinfektion, er testets specificitet 99%. Testens følsomhed blandt patienter med tuberkulose varierer fra 81 til 89%.

Test og diagnostiske værktøjer er blevet udviklet baseret på den kortsigtede dyrkning af celler eller fuldblod mononukleære celler isoleret fra blodet med antigener fra Mycobacterium tuberculosis in vitro med efterfølgende bestemmelse af IFN-γ koncentration eller ved at tælle antallet af T-lymfocytter, der syntetiserer IFN-γ. Koncentrationen af interferon syntetiseret i et reagensglas bestemmes ved ELISA under anvendelse af monoklonale antistoffer, der binder IFN-y. Derefter bestemmes koncentrationen ved at kalibrere standard IFN-y i testrøret eller brøndene på pladen.

Ved udførelse af Elispot-testen er antallet af T-limocytter syntetiseret IFN-y. Tælles på overfladen af en plade belagt med antistoffer mod IFN-y.

Developers Diagnosticum på IFN-γ in vitro ved induktion, som er godkendt af agentur for lægemidler og amerikanske produkter, hævder, at en test er umuligt at skelne mellem latent TB-infektion fra aktiv tuberkulose. Derfor er testen ikke direkte diagnostisk i regioner med et højt infektionsniveau. Men i vores land kan det bruges til at differentiere tuberkuloseinfektion hos børn fra postvaccinationallergi og at vurdere niveauet af specifik immunitet i behandlingsprocessen.

I øjeblikket er det indenlandske testsystem til bestemmelse af induktionen af IFN-y-syntese ved specifikke tuberkuloseantigener in vitro undersøgt.

Immunstatus og forløb af tuberkulose, immunkorrektion

I behandling med tuberkulose hos mennesker er der ændringer i antigenæmi og immunsystemets tilstand.

Data om ændringer i ekssudater og væv er stort set modstridende. Det eneste, der med god grund kan bemærkes, er, at der i tuberkulære granulomer som regel registreres et signifikant antal aktiverede T-lymfocytter.

Det er fornuftigt at dvæle på to yderligere bestemmelser, der er nødvendige for at forstå rollen som immunologiske mekanismer til behandling af tuberkulose hos mennesker:

• Aids-patienter har en særlig høj forekomst af flere lægemiddelresistens;
• med multiple lægemiddelresistens (og i fravær af HIV-infektion) er immunitetsforstyrrelser (især T-celle-forbindelsen) særligt signifikante.

Når tuberkulose bredt anvende forskellige fremgangsmåder til immunmodulation: det primært lægemidler, der virker primært på T-celle-immunitet den og et system af mononukleære fagocytter (thymushormoner, isophoron, likopid, polioksidony et al.). Såvel som hele (svækkede) mykobakterier og deres komponenter.

Molekylærbiologisk diagnose af tuberkulose

For molekylær biologi fremgangsmåder til diagnosticering af infektionssygdomme indbefatter hovedsageligt metoder baseret på manipulering med det genomiske materiale af bakterielle og virale patogener til at identificere specifik genetisk materiale - DNA-segmenter med en nukleotidsekvens specifik for en bestemt type eller patogenstammer at analysere specifik DNA-sekvenser i gener, som bestemmer patogenes følsomhed for visse lægemidler, og også for funktionel analyse aktivitet af visse gener af patogenet. Molekylærbiologiske teknikker var bredt i videnskabelig forskning og praktisk anvendelse i diagnosticering og overvågning af forskellige bakterielle og virale infektioner efter åbning i 1985, Carrie Myullisom (vinder af Nobelprisen. 1989) polymerasekædereaktion.

Principper og muligheder for polymerasekædereaktionsmetoden

PCR tillader at amplificere (multiplicere) in vitro en nukleotidsekvens (DNA-fragment af patogenet) i adskillige timer i millioner af gange. Reaktionen i nærvær af enkelt-DNA-kæder bestemmer analysens ekstremt høj følsomhed.

Nukleotidsekvensen af bestemte regioner i DNA-kæden bestemmer den genetiske identitet af mikroorganismen, hvilket forklarer PCR's høje specificitet.

Værdien af denne teknik til påvisning og undersøgelse af de karakteristika forårsaget af Mycobacterium tuberculosis biologiske karakteristika af en mikroorganisme, som har meget langsom vækst: fordoblingstid på Mycobacterium tuberculosis DNA, når dyrkningen er 12-24 timer.

Princippet om PCR-metoden består i forstærkning - flere, millioner af gange. Multiplicere sektionerne af en specifik DNA-sekvens i en rørmikrovolume under en cyklisk gentagelse af de følgende tre reaktionstrin, der hver især passerer i et forskelligt temperaturregime:

• Trin I - denaturering af dobbeltstrenget DNA efter opvarmning med en divergens af dens kæder;
• II-stadium - komplementær binding (hybridisering) af primere (primingoligonukleotider) med terminale sektioner af kæder af strengt specifikke, valgt til multiplikation af DNA-fragmentet;
• Trin III - færdiggørelse af DNA-fragmentkæden ved hjælp af en termostabil DNA-polymerase.

For at amplificere in vitro skal der være molekyler af matrix-DNA. Fire typer deoxynucleosidtriphosphater (nukleotider) indeholdende de tilsvarende nitrogenbaserede baser: adenin (A), thymin (T), guanin (D), cytosin (C); kunstigt syntetiserede primeroligonukleotider (primere) bestående af 18-20 basepar; termostabil DNA-polymerase enzym med et temperaturoptimum på 68-72 ^om C og magnesiumioner.

Specificiteten af PCR afhænger af valget af DNA-fragmentet. I overensstemmelse hermed syntetiseres flank-frø-oligonukleotider. Specificitet af hybridisering og afslutning af DNA-kæden skyldes komplementaritetsprincippet af de følgende par nitrogenholdige baser: adenin-thymin, guanin-cytosin.

At bestemme det genomiske tuberkuløse mykobakterier kompleks mest effektive målamplifikation i de fleste testsystemer valgte DNA-fragment på IS6110, som i de fleste stammer af Mycobacterium tuberculosis-genomet har et betydeligt antal (10-20) af gentagelser, som giver, sammen med specificitet, høj følsomhed af assayet. På samme tid beskrives stammer af Mycobacterium tuberculosis med et lille antal gentagelser eller fraværet af IS6110 fragment.

Isolering af DNA-molekyler fra en biologisk prøve

Til udførelse af PCR skal patogenes DNA-molekyler isoleres fra det biologiske materiale i et minimalt volumen med en minimal mængde ikke-specifik DNA og forskellige inhibitorer af enzym-DNA-polymerasen.

Fremstillingen af prøver skal udføres under betingelser, der forhindrer krydskontaminering af prøverne ved hjælp af de isolerede DNA-molekyler. For at gøre dette er forbehandling af rummet med ultraviolet, gulve og arbejdsflader af skriveborde og apparater nødvendigt med klorholdige opløsninger. Også obligatorisk brug af rene handsker, disponible reagensglas og tip til automatiske pipetter.

Til isolering af DNA fra Mycobacterium tuberculosis fra kliniske prøver (cerebrospinalvæske, bronkial vask) ikke indeholder et stort antal celler, cellerester, eller salte deraf, der er tilstrækkelig til centrifugere prøven 3-4 tusind. Rpm, tilsættes til slammet 20-30 pi 2% opløsning triton X-100 og opvarmes ved 90 ^om C i 30 minutter.

Til fremstilling af spytprøver skal være effektiv smeltning, som generelt anvendes til en 4% opløsning af natriumhydroxid og N-acetyl-L-cystein (NALC) i en mængde på 50-80 mg per prøve - afhængig af prøven viskositet. NALC-opløsningen skal fremstilles ex tempore eller NALC-pulver kan tilsættes tørt til prøven direkte. Efter kondensation skal prøver centrifugeres i 15 minutter ved 3,5-4,000 omdrejninger pr. Minut (3000 g) i 50 ml hætteglas med skruehætter, i. E. Under de samme betingelser, som anbefales til presdannelse af slim.

Til ekstraktion af DNA fra pelleten metoden anvendes oftest baseret på anvendelse af en 5-6 molær opløsning af guanidinisothiocyanatlyseringsopløsning reagens som de mikroporøse partikler og siliciumoxid ( "diatoméjord") sorbering DNA-molekyle. Uspecifikke stoffer, herunder inhibitorer mulige, derefter vasket i en 2,5 molær opløsning af guanidiniumisothiocyanat og ethanol opløsning, hvorefter DNA-molekylet desorberes i vand, og disse prøver blev anvendt til at udføre PCR. For at forenkle teknologien ved DNA-ekstraktion erstattes "diatoméjord" ofte med magnetiske mikropartikler overtrukket med siliciumoxid. I dette tilfælde anvendes en særlig magnetisk stand til mikrotubes i stedet for centrifugering for at udfælde partiklerne.

I Rusland blev en original metode til immunomagnetisk adskillelse af mycobakterier udviklet efterfulgt af ekstraktion af patogenens DNA. For Mycobacterium tuberculosis immunomagnetisk separation under anvendelse ferroparticles størrelse på 3-5 um, overtrukket med silica, hvortil der er knyttet ved kemisk binding polyklonale (kanin) antistoffer mod Mycobacterium tuberculosis. Prøver af sputum efter alkalisk lys neutraliseres med en sur tris-HCI-opløsning og inkuberes med en immunomagnetisk sorbent. Derefter opsamles immunoferropartiklerne med en magnetstang med en udskiftelig spids, overføres til en mikrotube og udfældes. Tilsæt 20-30 μl af en 2% Triton X-100 opløsning og varm i 30 minutter ved 90 ^° C. Supernatanten anvendes som en DNA-skabelon til PCR-analyse.

Et vanskeligt problem er isoleringen af mycobacterium tuberculosis DNA fra biopsiprover. Til enzymbiopsi anvendes enzymproteinasen K ved en slutkoncentration på 200-500 mg / l ved en temperatur på 56 ^° C natten over. Endvidere anvendes en af de kendte fremgangsmåder. Overskydende uspecifik DNA i PCR-analysen af biopsier forårsager ofte inhiberingen af reaktionen, hvilket kræver gentagen ekstraktion af DNA.

Metoder til at registrere resultater

Efter afslutning af reaktionen identificeres de amplificerede DNA-fragmenter af patogenet ved forskellige metoder.

Gelelektroforesefremgangsmåden er velkendt. Således opnåede DNA-fragment blev identificeret ved en positiv kontrol, der omfatter den ønskede specifikke fragment af DNA eller kendt på forhånd størrelsen (antal basepar) fragment, som blev bestemt ved standard molekylær markør.

I nærvær af et specifikt farvestof indgår ethidiumbromid i dobbeltstrenget DNA. Det syntetiserede DNA-fragment detekteres som et bånd lysende under virkningen af ultraviolet.

Størrelsen af DNA-fragmentet, bestemt ved elektroforese fra afstanden fra starten, skal svare til en kendt molekylvægtmarkør eller positiv kontrol.

Andre metoder til bestemmelse af PCR-resultater baseret på hybridiseringen af en enkelt-kæde PCR-produkter med et oligonukleotid komplementær dertil - DNA probe mærket med biotin, efterfulgt af påvisning via enzymatiske reaktioner, fx ved binding til streptavidin-biotin-alkalisk phosphatase.

Baseret på denne type detektion er PCR-analysatorer blevet oprettet, hvor detektion af PCR-resultater udføres automatisk som et resultat af læsning af den optiske densitet i prøverne efter manifestationen af den enzymatiske reaktion.

Ulemperne ved disse metoder er mulighederne for intralaboratorisk kontaminering ved ret korte fragmenter af DNA-molekyler. Når molekyler indtaster nye prøver, bliver de en matrix til PCR og fører til falske positive resultater.

I denne henseende indføres der strenge regler for adskillelse og isolering af lokaler for at forhindre falske positive resultater: at udtrække DNA fra biologiske prøver; lokaler til påvisning af resultater (elektroforese) fra den rene zone. Disse lokaler er en zone med sandsynlig forurening. Et andet isoleret område er et rent rum til introduktion af de DNA-prøver, der skal testes i rør med en reaktionsblanding til PCR. Endelig antages det, at hovedenheden - DNA-forstærkeren - skal placeres i et separat, eventuelt kontorlokal.

At forhindre forurening af produkterne fra de foregående reaktioner - nogle Likon-amp PCR-system testen i stedet dezoksinukleozidtimidina indeholde dezoksinukleoziduridin som, når in vitro syntese kredsløb inkorporeret i stedet i den korrekte position, dvs. Den nitrogenholdige base af thymin, der er til stede i nativt DNA, erstattes af uracil. Uracil-DNA-glycosylase sættes til reaktionsblandingen til analytten, ødelægger kun kontaminerende fragmenter deoxyuridin, men ikke DNA native analyseret. Lign. Efterfølgende opvarmning ved 94 ^° C inaktiverer dette enzym og interfererer ikke med amplifikation i PCR.

Der er et testsystem baseret på isotermisk amplifikation af rRNA, for hvilken den omvendte transkription og syntese af DNA-molekyler udføres først. Som igen er en matrix til den efterfølgende syntese af RNA-molekyler. RNA ampliconer detekteres under anvendelse af en acridinfarvet DNA-probe, når den hybridiseres i en reaktionsrøropløsning. Denne metode ud over høj følsomhed har den fordel at analysere i et rør, hvilket forhindrer kontaminering. Ifølge forfatterne når følsomheden af denne metode i respiratoriske prøver 90% med en specificitet på 99-100%.

Nye påvisningsmetoder implementeres i realtid PCR. Disse metoder adskiller sig primært i denne PCR, og påvisning af dets resultater udføres samtidigt i et lukket rør. Dette forenkler ikke kun teknikken med analyse teknologisk, men forhindrer også kontaminering af laboratorierum og testprøver med produkter fra tidligere PCR.

Med realtids-PCR skyldes detektering af resultaterne på grund af fluorescens som følge af hybridiseringen af en fluorogen DNA-probe med et specifikt DNA-fragment amplificeret under PCR. Struktur fluorogene DNA-prober konstrueret således, at den fluorescerende markør frigives som et resultat af enzymatisk reaktion eller i afstand fra slukningsmolekylet fluorescens kun under specifik hybridisering med det ønskede DNA-molekyle, der skal amplificeres under PCR. Da antallet af probemolekyler hybridiseret med forøgelsen i fluorescens er proportional med den detekterede niveau af antallet af molekyler af det amplificerede produkt. Eftersom ved hver cyklus antal PCR-fragment-DNA-molekyle multipliceres med halvdelen, cyklusnummeret hvor fluorescens bestemmes og øger omvendt proportional med antallet af DNA-molekyler i den oprindelige prøve. Hvis reaktionen er at introducere som kalibratoren adskillige forskellige kendte koncentrationer af molekyler tilsvarende DNA-fragment på Mycobacterium tuberculosis, ved anvendelse af computerprogrammet kan beregnes, og mængden af genomisk DNA i testmaterialet.

Hver standardprøve duplikeres. Det kvantitative kriterium er det mindste antal PCR-cyklusser, der er nødvendige for starten og væksten af den bestemte fluorescens. På abscissen - antallet af cyklusser; ordinatet er fluorescensværdien. DNA-koncentrationerne er omvendt proportional med antallet af cyklusser, der kræves for udseendet af fluorescens. I højre kolonne (21-32) er cyklusnumrene for de tilsvarende koncentrationer markeret. Forskelle mellem 10-foldede koncentrationer af DNA-fragmenter 10 ² -10 ⁶ ml - 3,2-3,4 cykler. For to patienter var koncentrationerne af IS6110-fragmenter ca. 10 ³ / ml og 10 ⁴ / ml. Under hensyntagen til antallet af gentagelser (6-20) af fragmenterne analyseret i genomet af Mycobacterium tuberculosis er antallet af myco-bakterier i kliniske prøver henholdsvis ca. 100 og 1000 celler.

Anvendelsen af PCR i diagnosen tuberkulose

PCR-metoden er mest anvendt til accelereret diagnose af tuberkulose - påvisning af mycobacterium tuberkulose i kliniske prøver: sputum. Bronchial vanding, pleural eksudat, urin, cerebrospinalvæske, osteolyse punctate, kvindelige kønsorganer aspirater og forskellige biopsi prøver. I undersøgelsen i Nederlandene omkring 500 spyt og bronkial lavageprøver fra 340 patienter med bekræftet diagnose af pulmonal tuberkulose blev undersøgt for at sammenligne følsomheden af PCR-fremgangsmåder, mikroskopi og kultur undersøgelser udstrygninger. Analysens følsomhed var henholdsvis 92,6,88,9 og 52,4%. Specificiteten af alle metoder var omkring 99%.

Effektiviteten af detektion af mycobacterium tuberculosis ved smearmikroskopi, seeding på Levenstein-Jensen medium, VASTES test system og PCR analyse blev sammenlignet. PCR viste en følsomhed på 74,4%, mikroskopi - 33,8%, såning på et tæt medium - 48,9% og VASTES - 55,8%. Den gennemsnitlige detektionstid for såning på et Levenstein-Jensen medium er 24 dage. VASTES - 13 dage, PCR - 1 dag.

Muligheden for at bruge PCR som en følsom og hurtig metode til overvågning af effektiviteten af tuberkulosebehandling diskuteres også.

Påvisning af M. Tuberculosis-DNA ved PCR med effektiv kemoterapi bestemmes over en længere tid - i gennemsnit 1,7 måneder sammenlignet med smear defineret under fluorescerende mikroskopi, og ved 2,5 måneder sammenlignet med den bakteriologisk undersøgelse.

Diagnose af ekstrapulmonale former for tuberkulose

Værdi som en følsom PCR-metode er særlig stor for ekstrapulmonale former som den danner under disse kliniske og radiografiske metoder konventionelle bakteriologiske metoder til bestemmelse af Mycobacterium tuberculosis i diagnostiske materialer ineffektive.

I undersøgelsen af urinprøver PCR-resultater var positive i 16 af 17 patienter med aktiv tuberkulose og negativ urin 4 patienter inaktive renal tuberkulose og 39 patienter med urinvejene sygdom nontubercular.

Effektiviteten af PCR-analyse i undersøgelsen af knoglemarvsaspirater hos patienter med feber af ukendt oprindelse blev påvist i tilfælde af mistænkt tuberkulose. For at diagnosticere tuberkuløs lymfadenitis blev 102 punkteringsaspirater og en biopsiprofil af 67 børn med mistænkt tuberkuløs lymfadenitis undersøgt hos børn. Positive resultater blev opnået: 71,6% real-time PCR. Fluorescensmikroskopi - 46,3%. Kulturforskning - 41,8%. I undersøgelsen af 50 lymfeknudebiopsier hos patienter med "cat scratch" -sygdom var alle resultaterne negative. Således blev 100% specificitet af PCR-analyse påvist. I samme arbejde med punkteringsbiopsi af lymfeknuder blev muligheden for påvisning af M. Avium påvist.

Diagnose af tuberkulose af det kvindelige kønsorganers infertilitet, som det er kendt, er et af de vanskeligste diagnoseproblemer. I et PCR-studie af endometriebiopsier, endometriale aspirater og væskeprøver fra Douglas-rummet blev 14 (56%) af 25 patienter undersøgt laparoskopisk med mistænkt tuberkulose modtaget positive resultater. Ved anvendelse af smearmikroskopi og kultur blev der opnået 1 og 2 resultater. Disse tilfælde var også PCR-positive. De fleste PCR-positive resultater var relateret til tilfælde med karakteristiske tegn på tuberkulose ifølge den histologiske undersøgelse; et mindre antal - med mistanke om tuberkulose ifølge laparoskopi data. Kun ét positivt resultat af PCR-analyse blev opnået i fravær af laparoskopiske data for tuberkulose.

Ved diagnosticering af ekstrapulmonale former for tuberkulose har klinikere ofte et spørgsmål om muligheden for at påvise et patogen, når de prøver blodprøver med PCR-metoden. Literære data indikerer, at detektion af DNA fra mycobacterium tuberculosis fra blodprøver er mulig med vidtrækkende former for HIV-infektion. DNA fra mycobacterium tuberculosis blev kun påvist ved generaliseret tuberkulose af forskellige organer hos patienter med transplanteret nyre og immunosuppression.

[89], [90], [91], [92], [93], [94], [95]

Arteridentifikation af mykobakterier

PCR-metoden kan være ganske effektiv til hurtig identifikation af mycobakterier af tuberkulose-komplekset og nogle arter af mycobakterier nontubercular efter deres oprindelige vækst. I dette tilfælde kan brugen af PCR spare 7-10 dage, der er nødvendig for den efterfølgende kulturelle identifikation af et positivt resultat. PCR-testen er teknisk meget enkel, da det ikke kræver kompliceret prøvepræparation af det kliniske materiale for at opnå høj følsomhed. I undersøgelsen 80 positive i denne test-system (MB Vasto. Organon selskab) alle positive kulturer af PCR var strengt specifikke og holdt i 1 dag. At identificere andre arter af mycobakterier ved fremstillingen af DNA af patogenet kultur hybridiseret med specifikke DNA prober mærket med acridin og stammer detekteres ved fremkomsten af kemiluminescens via kemiluminometer eller nitrocellulosestrimler med en visuel bedømmelse efter hybridisering. Ved hjælp af et sådant sæt identificeres et begrænset antal arter: mycobacterium tuberculosis komplekset. M. Avium, M. Avium complex, M. Kansasii og M. Gordonae.

A.Telenti et al. Også udviklet en forholdsvis enkel og billig metode til identifikation af arter af klinisk vigtige arter af mycobakterier ved PCR og efterfølgende behandling med to restriktionsenzymer (enzymer med egenskaber sender et DNA-molekyle ved specifikke punkter). DNA fragmentet amplificeres. Som koder for et varmechokprotein (65 kDa), og derefter behandles PCR-fragmentet af 439 nukleotidpar fremstillet ved PCR separat med to enzymer, Bste II og Nae III. Derefter analyseret ved anvendelse af agarosegelelektroforese opnås to produkter, fastlæggelsen af deres størrelse (antal basepar) under anvendelse af et standardsæt af DNA-fragmenter (molekylære DNA-markører) i længde fra 100 til 1000 basepar. I hver af de specifikke typer (M. Tuberculosis, M. Avium, M. Intracellulare, M. Kansasii, M.fortuitum) detektere to eller tre DNA-fragmenter af forskellig størrelse for hvert restriktionsenzym. Kombinationen af forskellige opnåede DNA-størrelser muliggør differentiering af disse arter indbyrdes.

Teknologien for biologiske DNA-mikroarrays udvikles. Som vil hjælpe med at identificere mere end 100 arter af mykobakterier i en undersøgelse.

Arteridentifikation kan også udføres ved PCR-amplifikation af 16S rRNA-variabelregionen efterfulgt af amplikon-sekventering sammenlignet med den tilsvarende primære struktur, som tillader identifikation af mere end 40 arter af mykobakterier.

Ved hjælp af PCR kan en artidentifikation inden for mycobacterium tuberculosis komplekset også udføres, herunder differentiering af M. Bovis og M. Bovis BCG. For at gøre dette analyseres tilstedeværelsen eller fraværet af nogle gener i de genomiske områder af RD1. RD9 og RD10. RD1 er fraværende i M. Bovis BCG, men er til stede i virulente arter, inklusiv M. Bovis.

Bestemmelse af lægemiddelfølsomhed af Mycobacterium tuberculosis ved PCR

Mål molekylærgenetiske fremgangsmåder til lægemiddel eller resistens af Mycobacterium tuberculosis reducere til identificering af mutationer i specifikke nukleotidsekvenser for kendte gener. Grundlæggende metoder er enten baseret på direkte prochityvanii (sekventering) af disse sekvenser efter amplifikation eller hybridisering af biotinmærkede DNA-fragmenter amplificeret under PCR-DNA-prober. Begge alternativer involverer identifikation af nukleotidsubstitutioner i sekvenserne, der ved hjælp af DNA-prober fører til fravær eller ufuldstændig hybridisering til en nitrocellulosemembran under anvendelse af enzymkonjugat (streptavidin-alkalisk phosphatase) - Metode LiPA-Rif-TB.

Fremgangsmåde til måling af fluorescens i et lokalt fikseret på microsections DNA-prober komplementære til kendte mutationer i PCR-amplificerede genregioner er ansvarlige for resistens eller lægemiddel følsomhed, kaldet mikrobiochipov metode. Hovedalgoritmen til gennemførelse af denne forskning er som følger. Efter isolering af DNA fra en klinisk prøve eller dyrkning af mycobakterier er nødvendigt at gennemføre PCR-amplifikation af de relevante fragmenter af rpoB-genet er ansvarlig for lægemiddelsensitivitet for rifampicin eller katG og Inha gener, der koder proteiner af Mycobacterium er ansvarlige for følsomhed over for Isoniazid. PCR-resultater blev evalueret ved agarosegelelektroforese, i hvilken bekræfter modtagelsen af passende DNA-fragmenter af den ønskede længde. Udføres derefter den 2. Runde af PCR for at indføre den fluorescerende mærket i DNA'et. Resultaterne af PCR bekræftes igen ved gelelektroforese. Derefter blev hybridisering udført (inkubation natten over), efterfulgt af vask det resulterende materiale på biochip, hvilket er et stort antal fast i en lille glasplade korte DNA-strenge (prober), som er komplementære til nucleotidsekvenser af lægemiddel-sensitive typen Mycobacterium tuberculosis på de steder mulige mutationer. Såvel som til de mutante sekvenser der er ansvarlige for lægemiddelresistens. Placering af DNA-prober på pladen - nøje defineret, og niveauet af fluorescens observeret ved hybridisering for at bestemme resultatet hjælp af en særlig læseindretning er installeret. I denne henseende er analyseresultaterne bestemmes ved hjælp af et særligt computerprogram.

I de senere år er alternative metoder til bestemmelse af mycobakterie-tuberkulosens medikamentfølsomhed udviklet på basis af realtids-PCR-teknologi, som gør det muligt at gennemføre disse undersøgelser i en lukket rørprøve.

I fig. 13-13 viser resultatet af analyse af kliniske isolater af Mycobacterium tuberculosis i fastlæggelsen resistens overfor rifampicin ved PCR i realtid: 218 - kontrolprøve (følsomme overfor rifampicin); 93 - positiv kontrol for mutationen af Ser-Trp TCG-TGG; 4482 - positiv kontrol for mutation af Ser-Leu TCG-TTG; 162-322 - eksperimentelle prøver. Resultat af beregning af amplifikations kinetiske kurver på 4 kanaler: kanal 1: 393 - positiv kontrol for mutation af Ser-Trp TCG-TGG; kanal 2: 4482 - positiv kontrol for mutation af Ser-Leu TCG-TTG; 162, 163, 172, 295 - eksperimentelle prøver; kanal 4: kinetiske kurver for amplifikation af alle prøver, der deltager i eksperimentet. Positiv kontrol af amplifikationsreaktionen. Konklusioner: Baseret på resultaterne af analysen blev følgende mutationer, der bestemmer resistensen over for rifampicin, afsløret: i prøver 162.163.172.295-Ser-Leu TCG-TTG. Det samme princip blev brugt til at bestemme lægemiddelresistensen over for isoniazid for generne katG og inhA, som bestemmer de hyppigste mutationer.

[96], [97], [98], [99], [100], [101], [102], [103], [104]

Strainidentifikation af mycobacterium tuberkulose

Den mest grundigt undersøgte fremgangsmåde til identifikation af stammer af Mycobacterium tuberculosis er en teknik kaldet restriktionsfragmentlængde-polymorfisme (RFLP RFLP,. Eller i den engelske version), og som er baseret på fragmentirovanin (restriktion) af Mycobacterium tuberculosis-DNA PvuII og fragmenterne opnået efterfølgende hybridisering med visse specifikke sekvenser på DNA dens gentagne element IS6110. Intraspecifikke variabilitet realiseres gennem forskellige antal gentagelser IS6110 og deres placering på DNA. Samt en række forskellige afstande mellem visse angrebspunkter restriktionsenzym (restriktionssteder) og elementet IS6110. Denne teknologi er meget kompliceret og tidskrævende. Efter behandling med DNA ekstraheret fra en kultur af Mycobacterium tuberculosis, er gelelektroforese udført med et restriktionsenzym, og derefter overført DNA-fragmenter af forskellige længder på en nitrocellulosemembran, blev hybridisering udført med fragmenter af IS6110-elementet og detekteres ved hjælp af enzymatiske reaktioner. Det resulterende mønster specifikke DNA-bånd karakteriserer særlige stamme af Mycobacterium tuberculosis. Ved hjælp af computer analyse it identiske eller beslægtede stammer. På trods af at den RFLP metode er den mest diskriminerende, dvs. Identificerer det største antal forskelle i de analyserede stammer, det er ineffektivt for et mindre antal (mindre end 5) IS6110-gentagelser observeret i nogle stammer. I fig. 13-14 viser resultaterne af RFLP skrive stammer.

Et alternativ kan være metoden til spoligotyping - analyse af polymorfien af spacer-DNA-sekvenser - mellemprodukt mellem direkte gentagelser af DR-regionen. Ved udførelse af spoligotyping af stammerne udføres PCR med primere der grænser DR-regionen, hvorefter fragmenter af forskellig længde dannes, som hybridiserer med de variable mellemliggende regioner af DNA. Analyse af afstandsekvenserne af DR-regionen er præsenteret. Ifølge forskere, mere enkel, produktiv og egnet til primær screening af stammer og foreløbig epidemiologisk analyse samt forskning direkte klinisk materiale.

En mere effektiv og teknologisk tilgængelig metode er tydeligvis VNTR (forkortelse af engelske ord) eller en metode til bestemmelse af det variable antal eksakte tandem-gentagelser i DNA'et af mycobacterium tuberculosis. Denne metode er kun baseret på brug af PCR og kræver ikke yderligere manipulation. Da antallet af tandem-gentagelser i forskellige stammer og i forskellige lokaliteter er forskellig, bestemmes fragmenterne af forskellige størrelser og analyseres på det resulterende elektroforegram af PCR-produkter. Ifølge forskerne opnår VNTR en større grad af diskrimination af stammer end med RFLP-metoden.

I de senere år har der været meget opmærksomhed på fordelingen af stammer af Mycobacterium tuberculosis fra W-Beijing familien (undertiden kaldet Beijing-stammen), der stort set er stofresistente.

Grundlæggende krav til kvaliteten af molekylær biologisk forskning

[105], [106], [107], [108], [109], [110]

Grundlæggende reguleringsdokumenter for PCR

Ordrer russiske sundhedsministerium: №45 fra 2000/02/07 g .. Nummer 109 fra 2003/03/21 g .. Nummer 64 fra 2000/02/21, retningslinjerne: 1.3.1888-04 "Tilrettelæggelse af arbejdet i undersøgelser med anvendelse af PCR materiale inficeret med sygdomsfremkaldende biologisk midler fra gruppe III-IV af patogenicitet "; 1.3.1794-03 "Organisationen af undersøgelser ved hjælp af PCR med materiale inficeret med mikroorganismer I-II patogenicitetsundersøgelser grupper". 2003.; 3.5.5.1034-01 "Dekontaminering af materialet, inficerede bakterier I-IV patogenicitet grupper ved brug PCR" 2001 appendiks 11 til de ensrettede instruktioner mikrobiologiske undersøgelsesmetoder i identifikation, diagnosticering og behandling af tuberkulose.

[111], [112], [113], [114]

Personalet

Udførelse af molekylær biologisk forskning kan holde lægerne af kliniske laboratorie diagnostik, læger bacteriologists, virologer, læger, biologer, klinisk diagnostisk laboratorium, samt specialister med sekundær medicinsk uddannelse, passerede specialisering og videreuddannelse på den foreskrevne måde.

Arrangement af laboratorielokaler

Følgende laboratorierum er påkrævet:

• Prøvehåndteringsområde er et laboratorium, der er indrettet til at virke med infektiøse agenser i III-IV-patogenicitetsgrupperne ifølge de metodiske instruktioner 13.1888-04.
• Zone til fremstilling af reaktionsblandinger PCR - laboratorierum, som giver beskyttelse mod intern laboratorieforurening - "ren" zone.
• • Hvis elektroforese eller hybridisering anvendes til analyse af PCR-produkter. Laboratorium rum, hvor de multiplicerede DNA-fragmenter ekstraheres fra rørene og amplifikation kan henholdsvis komme i miljøet, i overensstemmelse med kravene for PCR laboratorier (1.3.1794-03 Retningslinjer, Guidance 1.3.1888-04) skal være fuldt er isoleret fra de lokaler, der er angivet i de foregående afsnit. Det bør udelukkes fra bevægelsen zone til zone elektroforese for prøvehåndtering og en "ren" område af eventuelle personale, udstyr, materialer og genstande, samt overførsel af luft gennem ventilationssystemet, eller som følge af træk. Denne zone er ikke nødvendig til fluorimetrisk detektion af PCR-produkter.
• Rummet til dokumentation og behandling af resultater er udstyret med computere og nødvendigt kontorudstyr. Dette rum kan indeholde udstyr, der giver detektion af PCR-produkter uden at åbne røret. - fluorescerende PCR detektorer og termiske cykler til real-time PCR.

Sanitære og epidemiologiske krav til primær behandling af sputum svarer til de standard mikrobiologiske krav til arbejde med mykobakteri tuberkulose.

[115], [116], [117], [118], [119]

Afslutning af laboratorieudstyr til PCR-diagnostik

Laboratoriet omfatter udstyr til følgende værelser.

• plads til prøvepræparation, indeholder følgende udstyr: laminar af II-klassen af beskyttelse "SP-1.2": faststoftermostat med et varmelåg til reagensglas af typen "Eppendorf"; mikrocentrifuge ved 13.000 omdr./min; en centrifuge (vortex); køleskab med et temperaturområde fra -20 ^о С til +10 ^о С; pipetter med variabelt volumen af "Rroline" serien; en pumpe med en OM-1 fælde kolbe; et stativ til pipetter; stativ arbejdsstation 200x0,5 ml; stativ arbejdsstation 50x1,5 ml; Stativ til opbevaring af reagensglas 80x1,5 ml;
• Reaktionsblandingspræparationsrum: PCR-kasse med beskyttelseskammer ("Laminar-C, 110 cm); centrifuge - Vortex; Variable volumen pipetter af Proline serien; et stativ til pipetter; stativ arbejdsstation 200x0,2 ml; Stativ til opbevaring af reagensglas 80x1,5 ml; køleskab med et temperaturområde fra -20 ^о С til + 10 ^о С;
• plads til elektroforese: kamera til vandret elektroforese; strømforsyning; transilluminator;
• DNA-forstærkere eller nukleinsyreanalysator (PCR i realtid) med en computer og software; kan placeres i noget ekstra rum. Hvis der anvendes realtids-PCR-teknologi. Plads til elektroforese er ikke nødvendig.

[120], [121], [122], [123], [124]

Ekstern kvalitetskontrol

For at være sikker på at opnå objektivt pålidelige resultater, bør laboratorier deltage i systemet med ekstern evaluering af kvaliteten af laboratorieforskningen.

Deltagere i kvalitetsstyringssystemet modtager; 12 hætteglas frysetørrede bakterielle cellesuspensioner, hvoraf to indeholder E. Coli E. Kokos, 3 hætteglas med Mycobacterium tuberculosis (avirulent stamme) ved 10 ² / ml; 3 ampuller med celler af en lignende stamme i en koncentration på 10 ⁴ / ml; 2 ampuller med ikke-tuberkulose mykobakterier M. Avium-intracellulare og M. Kansasii i en koncentration på 10 ⁵ / ml.

Distribuerede prøver til ekstern kvalitetsvurdering er forprøvet i to uafhængige laboratorier med stor erfaring på dette område.

[125], [126], [127], [128]