Laboratoriediagnose af tuberkulose

Tuberkulose er en sygdom, der er let at diagnosticere under moderne forhold og videnskabelige landvindinger. Laboratoriediagnostik af tuberkulose indtager en central plads blandt andre diagnostiske metoder, kun overgået af røntgenundersøgelsesmetoder.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ]

Klinisk blodprøve

Hos patienter med tuberkulose er ændringer i den generelle blodprøve ikke patognomoniske. Ved begrænsede og lavaktive former for tuberkulose er hypokromi af erytrocytter med et normalt antal karakteristisk. Ved massive infiltrater eller caseøs lungebetændelse, med udbredt caseøs lymfadenitis, specifik tarmskade, samt ved store pulmonale eller postoperative blødninger, observeres erythropeni og mikrocytose, oligokromasi og polykromasi. Makrocytose, og især poikilocytose, forekommer meget sjældnere, normalt ved svær anæmi. Antallet af retikulocytter i det kompenserede stadie af tuberkulose varierer fra 0,1 til 0,6%, i det subkompenserede stadie - fra 0,6 til 1,0%, og for det dekompenserede stadie er 1% retikulocytter karakteristisk.

I nogle tilfælde af tuberkulose kan moderat leukocytose (op til 15 tusind leukocytter) observeres, sjældnere leukopeni, som forekommer i 2-7% af tilfældene hos patienter med begrænsede og milde former af processen og i 12,5% ved destruktiv og progressiv lungetuberkulose.

Oftest forekommer der forskydninger i leukocytformlen. Både relativ og absolut neutrofili observeres, et moderat skift i leukocytformlen til venstre mod promyelocytter. Myelocytter ses meget sjældent i tilfælde af ukompliceret tuberkulose. En stigning i antallet af neutrofiler med patologisk granularitet i hæmogrammet hos en patient med tuberkulose indikerer altid processens varighed: hos patienter med svær tuberkulose indeholder næsten alle neutrofiler patologisk granularitet. Når et tuberkuloseudbrud aftager, vender nuklearskiftet relativt hurtigt tilbage til normalen. Neutrofilernes patologiske granularitet varer normalt længere end andre ændringer i hæmogrammet.

Indholdet af eosinofiler i det perifere blod svinger også afhængigt af processens fase og organismens allergiske tilstand. Deres antal falder til aneosinofili ved alvorlige og langvarige udbrud af sygdommen og stiger omvendt under resorption af infiltrater og pleural effusion, såvel som i tidlige former for primær tuberkulose.

De fleste former for primær tuberkulose ledsages af lymfopeni, som undertiden observeres i flere år, selv efter ardannelse af specifikke forandringer. Sekundær tuberkulose i den akutte fase kan, afhængigt af processens sværhedsgrad, ledsages af enten et normalt antal lymfocytter eller lymfopeni.

Blandt testene til vurdering af tuberkuloseprocessen indtager bestemmelsen af erytrocytsedimentationshastigheden (ESR) en særlig plads, hvilket er vigtigt for at vurdere forløbet af tuberkuloseprocessen og identificere dens aktive former. En stigning i ESR indikerer tilstedeværelsen af en patologisk proces (infektiøs og inflammatorisk, purulent, septisk, hæmoblastose, lymfogranulomatose osv.) og tjener som en indikator for dens sværhedsgrad, men normale ESR-værdier indikerer ikke altid fravær af patologi. Acceleration af erytrocytsedimentation fremmes af en stigning i indholdet af globuliner, fibrinogen, kolesterol i blodet og et fald i blodets viskositet. En langsommere erytrocytsedimentation er karakteristisk for tilstande ledsaget af hæmokoncentration, en stigning i indholdet af albuminer og galdesyrer.

Hæmogrammet hos tuberkulosepatienter ændrer sig under behandlingen. Jo mere vellykket den terapeutiske intervention er, desto hurtigere forsvinder de hæmatologiske forandringer. Samtidig bør man være opmærksom på effekten af forskellige antibakterielle lægemidler på hæmatopoiesen. De forårsager ofte eosinofili, i nogle tilfælde leukocytose og oftere leukopeni op til agranulocytose og lymfoid-retikulær reaktion. Systematisk hæmatologisk overvågning og korrekt analyse af de opnåede data er afgørende for at vurdere patientens kliniske tilstand, processens dynamik og behandlingens effektivitet.

[ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ]

Klinisk urinanalyse

Ved tuberkulose i urinvejene er urinanalyse den primære laboratoriediagnostiske metode. Leukocyturi, erytrocyturi, proteinuri, hypoisostenuri, tuberkuløs mykobakteriuri og uspecifik bakteriuri kan observeres.

Leukocyturi er det mest almindelige symptom på urinvejstuberkulose før specifik kemoterapi og er kun fraværende i særlige tilfælde, såsom fuldstændig udslettelse af urinlederlumen. Nechiporenkos test (bestemmelse af antallet af leukocytter i 1 ml urin) hjælper med at vurdere graden af leukocyturi ved nefrotuberkulose mere objektivt og i nogle tilfælde med at detektere den med en normal generel urinanalyse. Det skal dog tages i betragtning, at leukocyturi kan forekomme ved akut og kronisk pyelonefritis, blærebetændelse, urethritis, nyresten og urinledere.

Erythrocyturi, ligesom leukocyturi, betragtes som et af de mest almindelige laboratorietegn på urogenital tuberkulose. Hyppigheden af hæmaturi afhænger af processens forekomst; den stiger, efterhånden som den destruktive tuberkuløse proces i nyrerne udvikler sig. Erythrocyturi uden leukocyturi er mere typisk for de tidlige stadier af nyretuberkulose. Hæmaturi, der er mere fremherskende end leukocyturi, er et vigtigt argument for nyretuberkulose, når man skal differentiere den fra uspecifik pyelonefritis.

[ 10 ], [ 11 ], [ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ], [ 16 ]

Biokemisk blodprøve

Ved tuberkulose afhænger ændringer i nogle biokemiske indekser primært af processens fase, komplikationer og forskellige ledsagende sygdomme. Hos patienter med inaktiv tuberkulose i lungerne og andre organer ændres det samlede protein og proteinfraktionerne i blodserumet ikke og bestemmer deres normale indhold.

I akutte former af sygdommen, såvel som ved forværring og progression af kroniske former for tuberkulose, falder albumin-globulin-koefficienten.

Af væsentlig betydning for vurderingen af den funktionelle tilstand og organiske skader på leveren ved tuberkulose og dens komplikationer er bestemmelsen af direkte og total bilirubin, aspartataminotransferase (AST), alaninaminotransferase (ALT) i blodserum. Dynamisk bestemmelse af niveauet af aminotransferaser. Bilirubin i behandlingen af patienter med tuberkulose, især i dens alvorlige former, er en obligatorisk del af den biokemiske undersøgelse af patienter med tuberkulose og udføres månedligt.

Evaluering af nyrernes funktionelle tilstand omfatter bestemmelse af serumkreatinin og beregning af glomerulærfiltrationshastighed ved hjælp af Cockcroft-Gault-formlen. Beregning af glomerulærfiltrationshastighed ved hjælp af Reberg-testen giver mindre nøjagtige resultater.

Hovedformålet med dynamiske biokemiske undersøgelser af patienter med tuberkulose er at overvåge processens forløb, rettidig påvisning af bivirkninger af lægemidler og tilstrækkelig korrektion af nye homeostaseforstyrrelser.

[ 17 ], [ 18 ], [ 19 ]

Anvendelse af biokemiske forskningsmetoder i ekstrapulmonal tuberkulose

Den mest informative indikator anses for at være indholdet af tuberkulostearinsyre i biologiske væsker, men dens bestemmelse er forbundet med tekniske vanskeligheder (behovet for at anvende gaskromatografi og massespektrometri).

Det er lovende at måle aktiviteten af adenosindeaminase - et enzym bestemt i væsker: synovial, perikardial, ascites eller cerebrospinal. De vigtigste producenter af adenosindeaminase er lymfocytter og monocytter. Bestemmelse af aktiviteten af adenosindeaminase i biologiske væsker letter diagnosen af tuberkuløs synovitis, tuberkulose i lymfeknuderne, tuberkuløs meningitis og tuberkuløs serositis.

Nogle biokemiske indikatorer bestemmes på grund af deres manglende specificitet kun i biologiske væsker tæt på læsionen. Indikatorniveauet måles som reaktion på subkutan eller intradermal administration af tuberkulin (normalt før administration og 48 og 72 timer efter). Derefter beregnes graden af stigning i markørniveauet (i %) i forhold til det oprindelige niveau.

Optimalt set bestemmes aktiviteten af det organspecifikke enzym transamidinase i urin; dets forekomst ses ved nyreskader af forskellig oprindelse. Undersøgelsen af transamidinase er kun berettiget under subkutan administration af tuberkulin for at forværre den lokale inflammatoriske proces. Transamidinaseaktivitet bestemmes i urin initialt og 24-72 timer efter administration af 50 TE tuberkulin. En stigning i fermenturi på 2 gange eller mere gør det i 82% af tilfældene muligt at differentiere aktiv nyretuberkulose fra forværring af kronisk pyelonefritis.

Ved tuberkulose i kvindelige kønsorganer bestemmes koncentrationerne af haptoglobin og malondialdehyd i blodet under provokerende tuberkulintest. Tuberkulin administreres subkutant i en dosis på 50 TE, og en gentagen biokemisk undersøgelse udføres efter 72 timer. Ved tuberkuløs ætiologi er graden af stigning i haptoglobinniveauet mindst 28%, og niveauet af malondialdehyd er 39% eller mere. Bestemmelse af adenosindeaminaseaktiviteten i peritonealvæsken fra Douglas-posen anvendes også. Punkturen undersøges igen 72 timer efter intradermal administration af tuberkulin i doser på 0,1 TE og 0,01 TE i området for projektion af de indre kønsorganer på den forreste bugvæg. En stigning i adenosindeaminaseaktiviteten på 10% eller mere sammenlignet med den oprindelige værdi indikerer en tuberkuløs proces.

I tilfælde af øjenskade undersøges den fokale reaktion, der opstår i øjet som reaktion på antigenstimulering. I dette tilfælde er udviklingen af en skarpt udtalt reaktion ledsaget af et fald i visuelle funktioner uønsket. Da vurderingen af minimale fokale reaktioner ofte er vanskelig, anbefales det at fokusere parallelt på graden af stigning i haptoglobin eller adenosindeaminase i blodserum for at objektivere konklusionen.

Alle biokemiske undersøgelser bør udføres i kombination med andre metoder.

[ 20 ], [ 21 ], [ 22 ], [ 23 ]

Undersøgelse af blodkoagulationssystemet

Relevansen af at studere blodkoagulationssystemets tilstand i fthisiologi skyldes tilstedeværelsen af hæmoptyse eller lungeblødninger hos en række patienter med lungetuberkulose, samt hæmokoagulationskomplikationer ved kirurgisk behandling af tuberkulose. Derudover påvirker den naturligt ledsagende latente intravaskulære hæmokoagulation sygdomsforløbet og effektiviteten af kemoterapi.

Hos patienter med lungetuberkulose med en overvejende ekssudativ komponent af inflammation observeres et fald i blodets antikoagulerende aktivitet. Hos patienter med lav forekomst af specifik lungeskade med en overvejende produktiv komponent af inflammation udtrykkes intravaskulær hæmokoagulation ubetydeligt. Hos patienter med lungetuberkulose med hæmoptyse og lungeblødninger er tilstanden af blodkoagulationssystemet anderledes: hos patienter med mindre blodtab på højdepunktet af hæmoptoe eller umiddelbart efter dets ophør observeres en kraftig stigning i blodets koagulationskapacitet på grund af en udtalt intensivering af trombindannelsesprocesser, samtidig med at øget "strukturel" koagulation opretholdes. Hos patienter med massivt blodtab observeres et fald i koagulationspotentialet på grund af et fald i koncentrationen af fibrinogen, faktor XIII-aktivitet og blodpladetælling. I den kirurgiske behandlingsfase hos patienter med begrænsede former for lungetuberkulose forekommer der ikke signifikante forstyrrelser i homeostasesystemet. Hos patienter med udbredte processer, når der udføres pneumonektomi eller pleuropneumonektomi, udvikles DIC-syndrom ofte, hvilket kan have form af en "anden sygdom".

For at overvåge blodkoagulationssystemets tilstand hos patienter med lungetuberkulose er det nødvendigt at bestemme den aktiverede partielle tromboplastintid (APTT), fibrinogen, trombintid, protrombinindeks samt blødningstid og blodkoagulationstid.

[ 24 ], [ 25 ], [ 26 ], [ 27 ], [ 28 ]

Hormonelle undersøgelser

Moderne eksperimentelle og kliniske observationer indikerer tilstedeværelsen af ændringer i hormonstatus ved specifik tuberkuløs inflammation i lungerne. Det er blevet bevist, at korrektion af dysfunktion i hypofyse-binyre-, hypofyse-skjoldbruskkirtelsystemerne og bugspytkirtelfunktionen i kombination med antituberkulosebehandling bidrager til aktivering af fibrogenese og reparationsprocesser i fokus for specifik inflammation.

Hypofyse-skjoldbruskkirtelsystemets funktionelle tilstand bedømmes ud fra indholdet af triiodothyronin (T3), thyroxin (T4) og hypofysisk thyreoideastimulerende hormon (TSH) i blodserumet _. Det _er blevet fastslået, at subklinisk hypothyroidisme påvises hos 38-45% af patienter med lungetuberkulose, og det diagnosticeres oftest i disseminerede og fibrøse-kavernøse former af processen. I disse former er niveauerne af både T3 og T4 mest reduceret _, og der opstår _en ubalance af disse hormoner i form af en stigning i T4 _/ T3 _-forholdet.

Binyrebarkens funktion vurderes ud fra serumkortisolniveauet, og bugspytkirtlens endokrine funktion vurderes ud fra koncentrationen af immunreaktiv insulin. I den akutte fase af en infektionssygdom øges behovet for endogent kortisol og insulin. Hyperinsulinæmi indikerer også insulinresistens i kroppens væv, hvilket er typisk for enhver aktiv inflammatorisk proces, især en specifik. Bestemmelse af binyrernes glukokortikoidfunktion ved aktiv lungetuberkulose giver os mulighed for at detektere tilstedeværelsen af hyperkorticisme hos de fleste patienter. Normale kortisolkoncentrationer i blodet hos en patient med infektiøs inflammation i den akutte periode bør betragtes som en relativ insufficiens af binyrebarkens glukokortikoidfunktion, hvilket kan tjene som grundlag for erstatningsterapi med tilstrækkelige doser glukokortikoider.

Næsten en tredjedel af patienter med lungetuberkulose har et lavt insulinæminiveau, der nærmer sig den nedre grænse for normen, mens 13-20% har betydelig hyperinsulinisme. Både relativ hypo- og hyperinsulinisme er højrisikofaktorer for udvikling af kulhydratstofskifteforstyrrelser af varierende sværhedsgrad. Disse ændringer i den funktionelle aktivitet af bugspytkirtel-B-celler kræver regelmæssig glykæmiovervågning hos patienter med tuberkulose og rettidig forebyggelse af diabetes mellitus. Derudover tjener dette som en yderligere begrundelse for det hensigtsmæssige i at anvende fysiologiske doser af insulin i den komplekse behandling af tuberkulose.

Generelt er faldet i skjoldbruskkirtelhormonniveauer, deres ubalance, hyperkortisolæmi og hyperinsulinisme mest udtalt hos patienter med et alvorligt forløb af tuberkuloseprocessen, med omfattende lungelæsioner og udtalte symptomer på tuberkuloseforgiftning.

Mikrobiologisk diagnostik af tuberkulose

Mikrobiologiske undersøgelser er nødvendige for at identificere patienter med tuberkulose, verificere diagnosen, overvåge og korrigere kemoterapi, vurdere behandlingsresultater, med andre ord fra det øjeblik en patient med tuberkulose registreres, indtil vedkommende fjernes fra registeret.

Alle epidemiologiske programmer og projekter er baseret på en vurdering af antallet af bakterieudskillere, hvilket er umuligt uden brug af laboratoriemetoder til at detektere tuberkulosemykobakterier. Når man undersøger tiltrækningskraften hos den såkaldte uorganiserede befolkning, når procentdelen af bakterieudskillere op på 70 eller mere, hvilket gør laboratoriemetoder til et ret effektivt middel til at identificere tuberkulosepatienter blandt denne befolkningsgruppe.

Traditionelle mikrobiologiske metoder til diagnosticering af tuberkulose er bakterioskopiske og kulturelle undersøgelser. Moderne metoder omfatter dyrkning af tuberkulosemykobakterier i automatiserede systemer og PCR. Alle disse metoder kombineres dog nødvendigvis med klassiske bakteriologiske metoder.

Indsamling af diagnostisk materiale

Effektiviteten af laboratorietests afhænger i høj grad af kvaliteten af det diagnostiske materiale. Overholdelse af reglerne for indsamling, opbevaring og transport af diagnostisk materiale og den præcise implementering af patientundersøgelsesalgoritmen påvirker direkte resultatet og sikrer biologisk sikkerhed.

En række forskellige materialer bruges til at teste for tuberkulose. Da lungetuberkulose er den mest almindelige form for tuberkuløs infektion, anses det primære materiale til testning for at være sputum og andre typer af trakeobronkial træudflåd: udflåd fra øvre luftveje opnået efter aerosolinhalationer: bronkialskyllevand; bronkoalveolær udskylning; materiale opnået under bronkoskopi, transtrakeal og intrapulmonal biopsi: bronkial aspirat, larynxudstryg, ekssudater, sårudstryg osv.

Forskningens effektivitet øges, hvis der udføres kontrolleret indsamling af materiale fra patienten. Til dette formål afsættes et specielt udstyret rum, eller der anskaffes særlige båse. Indsamling af materiale er en farlig procedure, derfor skal materiale til forskning indsamles i overensstemmelse med reglerne for infektionssikkerhed.

Materiale til test for Mycobacterium tuberculosis opsamles i sterile hætteglas med tæt skruede låg for at forhindre kontaminering af miljøet og beskytte det indsamlede materiale mod kontaminering.

Hætteglas til opsamling af diagnostisk materiale skal opfylde følgende krav:

• skal være lavet af slagfast materiale;
• bør smelte let ved autoklavering;
• have tilstrækkelig volumen (40-50 ml):
• have en bred åbning til opsamling af sputum (diameter ikke mindre end 30 mm);
• være let at håndtere, gennemsigtig eller halvgennemsigtig, således at mængden og kvaliteten af den indsamlede prøve kan vurderes uden at åbne låget.

For at opnå optimale forskningsresultater skal følgende betingelser være opfyldt:

• Indsamling af materiale bør udføres inden påbegyndelse af kemoterapi;
• Materialet til undersøgelsen skal indsamles inden måltider eller indtagelse af medicin om morgenen;
• Til undersøgelsen anbefales det at indsamle mindst 3 morgenprøver af sputum. Sputum indsamles i 3 på hinanden følgende dage;
• Det indsamlede materiale skal leveres til laboratoriet så hurtigt som muligt:
• I tilfælde hvor det er umuligt at levere materialet til laboratoriet med det samme, opbevares det i køleskab ved en lufttemperatur på 4 °C i højst 48 timer.
• Ved transport af materialet er det nødvendigt at være særlig opmærksom på flaskernes integritet.

Korrekt opsamlet sputum har en mukøs eller mukopurulent karakter. Det optimale volumen af den undersøgte portion sputum er 3-5 ml.

Sputum opsamles under opsyn af en sundhedsperson. Personer, der er ansvarlige for opsamling af sputum, skal sikre, at visse regler følges:

• Det er nødvendigt at forklare patienten formålet med undersøgelsen og behovet for at hoste op, ikke spyt eller nasopharyngeal slim, men indholdet af de dybe dele af luftvejene. Dette kan opnås som følge af en produktiv hoste, der opstår efter flere (2-3) dybe vejrtrækninger. Det er også nødvendigt at advare patienten om, at han først skal skylle munden med kogt vand for at fjerne hoveddelen af mikrofloraen, der vokser i mundhulen, og madrester, der komplicerer undersøgelsen af sputum;
• Den læge, der er involveret i opsamling af spyt, skal udover kittel og hætte også bære maske, gummihandsker og et gummiforklæde;
• Når patienten står bagved, rådes han til at holde flasken så tæt på læberne som muligt og straks adskille sputumet i den, mens han hoster det op, mens det er nødvendigt at sikre, at luftstrømmen rettes væk fra sundhedspersonalet:
• Når opsamlingen af spyt er færdig, skal sundhedspersonalet forsigtigt lukke flasken med låget og vurdere mængden og kvaliteten af det opsamlede spyt. Flasken mærkes derefter og placeres i en særlig kasse til transport til laboratoriet.

Hvis patienten ikke producerer sputum, skal patienten aftenen før og tidligt om morgenen på dagen for materialetindsamling gives et slimløsende middel: ekstrakt af skumfidusrødder (mucaltin), bromhexin, ambroxol osv. - eller der skal anvendes en irriterende inhalation ved hjælp af udstyr installeret i rummet til opsamling af sputum. Materialet, der indsamles på denne måde, skal ikke konserveres og bør undersøges på indsamlingsdagen. For at undgå "afvisning" i laboratoriet skal der gøres en særlig note i henvisningen.

Hvis der ikke udføres mikrobiologiske undersøgelser på en given institution, skal det indsamlede diagnostiske materiale leveres centralt til laboratoriet, forudsat at materialet opbevares i køleskab eller med konserveringsmidler mellem leverancerne. Materialet leveres til laboratoriet i transportkasser, der let kan desinficeres. Hver prøve skal være forsynet med en passende etiket, og hele partiet skal have en udfyldt ledsagende formular.

[ 29 ], [ 30 ], [ 31 ]

Metoder og hyppighed af undersøgelse af patienter

Under den indledende, såkaldte diagnostiske, undersøgelse af en patient for tuberkulose er det nødvendigt at undersøge mindst 3 portioner sputum indsamlet under opsyn af medicinsk personale i løbet af 2 eller 3 dage, hvilket øger mikroskopiens effektivitet.

Primær screening for tuberkulose bør udføres af alle medicinske og diagnostiske institutioner i sundhedsvæsenet. For nylig er der for at øge effektiviteten af den primære undersøgelse blevet organiseret såkaldte mikroskopicentre på basis af kliniske diagnostiske laboratorier udstyret med moderne mikroskoper og udstyr for at sikre epidemisikkerhed.

Antituberkuloseinstitutioner bruger en undersøgelsesordning, der sikrer mindst 3-dobbelt undersøgelse af sputum eller andet diagnostisk materiale inden for 3 dage. Under behandlingen udføres mikrobiologiske undersøgelser regelmæssigt mindst én gang om måneden i den intensive kemoterapifase. Når man går over til opfølgningsfasen, udføres undersøgelserne sjældnere - med intervaller på 2-3 måneder, mens hyppigheden af undersøgelserne reduceres til to.

Funktioner ved indsamling af diagnostisk materiale til ekstrapulmonal tuberkulose

Et træk ved patologisk materiale i ekstrapulmonale former for tuberkulose er den lave koncentration af mycobakterier tuberkulose i den, hvilket kræver mere følsomme metoder til mikrobiologisk forskning, primært metoder til såning på et næringsmedium.

Ved urogenital tuberkulose er urin det lettest tilgængelige materiale til undersøgelse. Urinopsamling bør udføres af en specialuddannet sygeplejerske.

De ydre kønsorganer vaskes med vand og sæbe eller en svag opløsning af kaliumpermanganat. Urinrørets ydre åbning behandles omhyggeligt. Den midterste del af morgenurinen opsamles i en steril flaske: hos mænd - naturligvis, hos kvinder - ved hjælp af et kateter. Urin fra nyrebækkenet opsamles i sterile reagensglas under kateterisering af en eller to nyrer, i sidstnævnte tilfælde - nødvendigvis separat fra hver nyre. En lille mængde af denne urin centrifugeres, og bundfaldet undersøges.

Hos mænd centrifugeres sædceller, testikelpunkturer og prostatasekreter for at opnå et sediment. Ved enhver lokalisering af en specifik proces i kønsområdet hos mænd kan prostatamassage fremme frigivelsen af sekreter, der indeholder tuberkulosemykobakterier.

Menstruationsblod opsamles fra kvinder ved sugning eller ved brug af en Kafka-hætte. Det resulterende materiale befries for erytrocytter ved at vaske det med destilleret vand og derefter centrifugere det. Sedimentet undersøges.

Udflåd fra livmoderhalskanalen opsamles i en beholder eller Kafka-hætte, det vil sige, det er ønskeligt at akkumulere 1-2 ml patologisk materiale.

Materiale fra kirurgiske indgreb på nyrer, kønsorganer, biopsier og skrab fra endometriet homogeniseres. For at gøre dette placeres det i en steril morter og knuses grundigt med en steril saks. Sterilt flodsand tilsættes den resulterende suspension i en mængde svarende til dens masse, derefter tilsættes 0,5-1,0 ml isotonisk natriumchloridopløsning, og alt formales, indtil der dannes en grødet masse, ved tilsætning af isotonisk natriumchloridopløsning (4-5 ml). Derefter får massen lov at bundfælde sig i 1-1,5 minutter, og supernatanten undersøges.

Tuberkulose i knogler og led. Punkturen (pus fra bylder) taget med en steril sprøjte placeres i en steril beholder og leveres straks til laboratoriet. Ved hjælp af en steril pipette, der forinden er fugtet med en steril isotonisk natriumkloridopløsning, udtages 2-5 ml pus, overføres til en flaske med perler, og yderligere 2-3 ml isotonisk natriumkloridopløsning tilsættes. Flasken lukkes med en prop og rystes i en rystemaskine i 8-10 minutter. Den homogeniserede suspension undersøges.

Ved fistuløse former for osteoartikulær tuberkulose tages pus fra fistlen. Rigelig udflåd opsamles direkte i et reagensglas. Ved sparsom pusudflåd vaskes fistelkanalen med en steril isotonisk natriumkloridopløsning, og skyllevæsken opsamlet i et reagensglas eller et stykke tampon dyppet i pus sendes til undersøgelse.

Kirurgisk materiale, der opnås under kirurgiske indgreb på knogler og led, kan bestå af purulent-nekrotiske masser, granulat, arvæv, knoglevæv, synovialmembranvæv og andre substrater. Behandlingen udføres som i tilfælde af nyretuberkulose.

Mikrobiologisk undersøgelse af synovialvæske i en 3% natriumcitratopløsning (i forholdet 1:1) for at forhindre koagulering udføres umiddelbart efter punktering.

Tuberkulose i lymfekirtlerne. Pus udtaget under punktering af lymfekirtlerne undersøges på samme måde som pus fra bylder. Lymfeknudevæv fra kirurgiske indgreb og biopsier undersøges som ved andre former for tuberkulose.

Undersøgelsen af afføring for Mycobacterium tuberculosis udføres ekstremt sjældent på grund af den næsten fuldstændige mangel på positive resultater.

[ 32 ], [ 33 ], [ 34 ], [ 35 ], [ 36 ]

Mikroskopi af mykobakterier

Sputummikroskopi er en relativt hurtig, enkel og billig metode, der bør anvendes i alle tilfælde, hvor der er mistanke om tuberkulose. Derudover udføres denne undersøgelse for at vurdere effektiviteten af kemoterapi og for at bekræfte helbredelse eller behandlingssvigt i mangel af dyrkningsresultater.

To metoder til mikroskopisk undersøgelse anvendes:

• direkte mikroskopimetode, når et udstrygning fremstilles direkte fra det diagnostiske materiale;
• en metode til mikroskopi af sediment fremstillet af materiale behandlet med dekontamineringsmidler til kulturforskning.

Den første metode anvendes i de laboratorier, hvor der kun udføres mikroskopiske undersøgelser (kliniske diagnostiske laboratorier i det generelle medicinske netværk).

De bedste resultater af mikroskopisk undersøgelse opnås ved at koncentrere det diagnostiske materiale (for eksempel ved centrifugering).

For at kunne påvise Mycobacterium tuberculosis med 50% sandsynlighed ved mikroskopi, skal 1 ml sputum indeholde mere end 5.000 mikrobielle celler. Sputum fra patienter med pulmonale former for tuberkulose indeholder normalt et betydeligt antal syrefaste bakterier, hvilket gør det muligt at påvise dem pålideligt ved bakterioskopi. Den diagnostiske følsomhed af denne metode kan øges ved at undersøge flere sputumprøver fra én patient. Et negativt bakterioskopisk undersøgelsesresultat udelukker ikke diagnosen tuberkulose, da sputumet hos nogle patienter indeholder færre Mycobacterium, end der kan påvises ved mikroskopi. Dårlig forberedelse af sputumudstryg kan også være årsag til et negativt bakterioskopisk undersøgelsesresultat.

Den mest almindelige metode til at detektere syrefaste mykobakterier i et smear er Ziehl-Neelsen-farvning. Metoden er baseret på penetration af carbolfuchsin ind i en mikrobiel celle gennem en membran, der omfatter et voks-lipidlag, med samtidig effekt af opvarmning og phenols stærke ætsningsvirkning. Efterfølgende affarvning af smearet med en 25% opløsning af svovlsyre eller 3% saltsyre fører til affarvning af alle ikke-syrefaste strukturer. De affarvede elementer i smearet farves med en 0,3% opløsning af methylenblåt. Mykobakterier opfatter ikke konventionelle anilinfarvestoffer, hvilket resulterer i, at syrefaste mykobakterier farves hindbærrøde, og andre mikrober og cellulære elementer farves blå.

For at undersøge udstrygninger farvet efter Ziehl-Neelsen anvendes et lyskikkertmikroskop med et immersionsobjektiv (90- eller 100-dobbelt forstørrelse) og et okular med 7- eller 10-dobbelt forstørrelse. 100 synsfelter undersøges, hvilket er tilstrækkeligt til at detektere enkelte mykobakterier i udstrygningen. Hvis resultatet af en sådan undersøgelse er negativt, anbefales det at undersøge yderligere 200 synsfelter for bekræftelse. Resultaterne registreres med angivelse af antallet af detekterede syrefaste mykobakterier (AFB).

Ud over denne metode anvendes fluorokromfarvning til luminescerende mikroskopi, hvilket giver mulighed for at opnå de bedste resultater. Brugen af denne metode øger mikroskopiens effektivitet med 10-15%. Når mykobakterier behandles med luminescerende farvestoffer (auramin, rhodamin osv.), binder disse stoffer sig også til de vokslignende strukturer i den mikrobielle celle. Når farvede celler bestråles med en exciterende lyskilde (et bestemt spektrum af ultraviolet stråling), begynder de at gløde orange eller klar rødt mod en sort eller mørkegrøn baggrund. På grund af den høje lysstyrke og kontrast i det synlige billede kan mikroskopets samlede forstørrelse reduceres med 4-10 gange, hvilket udvider synsfeltet og reducerer præparatets visningstid. Samtidig kan undersøgelsens komfort øges på grund af den betydeligt større dybdeskarphed.

Når man bruger fluorescensmikroskopi, tager det betydeligt kortere tid at undersøge det samme område af et udstrygningsprodukt end lysmikroskopi af udstrygningsprodukter farvet ifølge Ziehl-Neelsen. Hvis en mikroskopist undersøger cirka 20-25 sådanne udstrygningsprodukter i løbet af en arbejdsdag, kan vedkommende ved hjælp af fluorescensmikroskopi undersøge mere end 60-80 prøver på samme tid. Erfarne mikroskopister ved, at farvning af celler med en blanding af auramin og rhodamin på en eller anden måde er specifik for syrefaste mykobakterier, som i dette tilfælde har udseende af gyldne stave. Saprofytter farves grønlige.

En anden vigtig fordel ved fluorescensmikroskopimetoden er evnen til at detektere ændrede mykobakterier, der har mistet deres syreresistente egenskaber under påvirkning af en række ugunstige faktorer, især intensiv kemoterapi, og derfor ikke detekteres ved Ziehl-Neelsen-farvning.

Ulemperne ved fluorescensmikroskopimetoden omfatter den relativt høje pris for mikroskopet og dets drift. I centraliserede eller andre store laboratorier, hvor arbejdsbyrden overstiger normen for tre laboratorieteknikere, der arbejder med tre konventionelle mikroskoper, er det dog billigere at bruge ét fluorescensmikroskop i stedet.

Bakterioskopiske metoder har en forholdsvis høj specificitet (89-100%). Omkring 97% af de positive resultater opnået ved enhver mikroskopimetode bekræftes tydeligt af resultaterne af såning.

Det skal bemærkes, at mikroskopisk undersøgelse af et udstrygningsprodukt af patologisk materiale ikke tillader artbestemmelse af de fundne syreresistente mykobakterier. Den mikroskopiske metode tillader kun at drage en konklusion om tilstedeværelsen eller fraværet af syreresistente mikroorganismer i præparatet, hvilket forklares af eksistensen i naturen af et stort antal ikke-tuberkuløse syreresistente mikroorganismer, der morfologisk ligner mykobakterier af tuberkulosekomplekset.

Evalueringen af mikroskopiresultater udføres i semi-kvantitative enheder.

For at kunne sammenligne resultaterne af forskellige mikroskopimetoder introduceres empiriske koefficienter. For eksempel, for at sammenligne resultaterne af en udstrygning farvet med fluorescerende farvestoffer med dataene fra en lysmikroskopiundersøgelse (1000-fold forstørrelse), er det nødvendigt at dividere antallet af syrefaste mykobakterier detekteret ved hjælp af et fluorescerende mikroskop med den tilsvarende koefficient: ved 250-fold forstørrelse af mikroskopet - med 10, ved 450-fold - med 4, ved 630-fold - med 2.

Funktioner ved mikroskopi i ekstrapulmonal tuberkulose

Direkte mikroskopi udføres, såvel som mikroskopi af udstrygningsprøver fremstillet efter berigelse med efterfølgende farvning ifølge Ziehl-Neelsen eller fluorescerende farvestoffer. Direkte mikroskopi af udstrygningsprøver er ineffektiv på grund af den lave koncentration af mykobakterier i materialet, og derfor er det mere rationelt at anvende berigelsesmetoder. Centrifugering er den mest effektive. Hvis det biologiske materiale er viskøst, anvendes centrifugering med samtidig homogenisering og likvefaktion af materialet, hvilket udføres ved hjælp af højhastighedscentrifuger med en centrifugeringskraft på 3000 g og hypokloritopløsninger. Andre berigelsesmetoder, såsom mikroflotation, anvendes ikke i øjeblikket på grund af dannelsen af biologisk farlige aerosoler.

[ 37 ]

Dyrkningsmetode til diagnosticering af tuberkulose

Såmetoden, eller dyrkningsmetoden, er mere følsom end smearmikroskopi og har en række fordele i forhold til sidstnævnte. Den gør det muligt at detektere flere dusin levedygtige mykobakterier i det materiale, der undersøges, og har en høj diagnostisk værdi. Dette er især vigtigt, når man undersøger materiale fra nydiagnosticerede eller behandlede patienter, der udskiller et lille antal mykobakterier.

Sammenlignet med mikroskopi giver kulturforskning mulighed for at øge antallet af påviste tuberkulosepatienter med mere end 15-25%, samt at verificere tuberkulose på tidligere stadier, hvor sygdommen stadig er let behandlelig. En meget vigtig fordel ved kulturforskning anses for at være muligheden for at opnå en patogenkultur, som kan identificeres og studeres i forhold til lægemiddelfølsomhed, virulens og andre biologiske egenskaber.

Ulemperne ved dyrkningsmetoder inkluderer deres varighed (ventetiden for materialer når 10 uger), højere omkostninger og kompleksiteten ved behandling af diagnostisk materiale.

Principper for behandling af diagnostisk materiale før såning

Konventionelle mikrobiologiske metoder kan ikke anvendes til at udføre tuberkulosetest. Dette skyldes, at tuberkulosemykobakterier vokser meget langsomt, og de fleste kliniske prøver indeholder hurtigtvoksende pyogene og putrefaktive mikroorganismer og svampe. Deres hurtige vækst på rige næringsmedier forstyrrer udviklingen af mykobakterier og tillader ikke isolering af tuberkulosepatogenet, så det diagnostiske materiale skal forbehandles før såning. Derudover er mykobakterier, der frigives fra patientens luftveje, normalt omgivet af en stor mængde slim, hvilket gør det vanskeligt at koncentrere dem. I denne henseende skal de flydendegøres og dekontamineres før såning af sputum og andre lignende materialer.

Alle rengøringsmidler og dekontamineringsmidler har en mere eller mindre udtalt toksisk effekt på mykobakterier. Som følge af behandlingen kan op til 90% af mykobakterierne dø. For at bevare en tilstrækkelig del af mykobakteriepopulationen er det nødvendigt at anvende skånsomme behandlingsmetoder, der på den ene side gør det muligt at undertrykke hurtigtvoksende pyogene og forrådnende mikroorganismer, og på den anden side at bevare levedygtigheden af de mykobakterier, der er til stede i materialet, maksimalt.

Afhængigt af materialet, dets homogenitet og kontamineringsniveau anvendes forskellige dekontamineringsmidler til behandling før såning: til sputum - 4% natriumhydroxidopløsning, 10% trinatriumphosphatopløsninger, benzalkoniumchlorid trinatriumphosphat, NALC-NaOH (N-acetyl-L-cystein-natriumhydroxid) med en endelig NaOH-koncentration på 1%, til urin og andre flydende materialer - 3% svovlsyreopløsning, til kontaminerede prøver, fedtholdige materialer - oxalsyreopløsning op til 5%. Derudover anvendes der i nogle tilfælde enzymer og overfladeaktive stoffer (detergenter). Brugen af Tween og nogle andre detergenter ledsages af mindre død af mykobakterielle celler (40-50% overlever). De kan dog kun bruges til flydende materialer. NALC-NaOH, produceret i kit, er den mest anvendte i verden. Denne metode gør det muligt at isolere mere end 85% af mykobakteriecellepopulationen. Dekontaminering af vævsholdige faste materialer er vanskeligere, da det er vanskeligt at gætte graden af materialets dispersion under homogenisering. For eksempel er behandling af lymfeknudebiopsier ofte ledsaget af en øget hyppighed af kontaminering med fremmed flora. I dette tilfælde kan 1% etonium anvendes.

Ikke-homogent materiale homogeniseres ved hjælp af glasperler i nærvær af dekontamineringsmidler. Flydende materialer forcentrifugeres, og kun sedimentet behandles.

Teknik til såning og inkubation

Efter den indledende bearbejdning centrifugeres materialet, hvilket udfælder mykobakterierne og øger deres indhold i sedimentet ("sedimentberigelse"). Det resulterende sediment neutraliseres og inokuleres på overfladen af tætte næringsmedier eller reagensglas med flydende (halvflydende) medier. Udstrygninger til mikroskopisk undersøgelse fremstilles fra det resterende sediment. Såningsteknikken skal forhindre krydskontaminering af det diagnostiske materiale.

For pålidelig klinisk fortolkning af resultaterne af mikrobiologisk forskning skal følgende regel overholdes: mikroskopiske og kulturelle undersøgelser skal udføres parallelt fra den samme prøve af diagnostisk materiale.

De inokulerede rør placeres i en termostat ved 37 ^° C i 2 dage i vandret position. Dette sikrer en mere ensartet absorption af materialet i næringsmediet. Efter 2 dage flyttes rørene til en lodret position og forsegles hermetisk med gummi- eller silikonepropper for at forhindre, at det podede medie tørrer ud.

Afgrøderne opbevares i en termostat ved 37 ^° C i 10-12 uger med regelmæssig ugentlig inspektion. Følgende parametre registreres ved hver kontrolinspektion:

• periode med visuelt observerbar vækst fra sådagen;
• vækstrate (antal CFU);
• kontaminering af kulturen med fremmed mikrobiel flora eller svampe (sådanne reagensglas fjernes);
• ingen synlig vækst. Rørene bliver siddende i termostaten indtil næste inspektion.

Næringsmedier

Forskellige næringsmedier bruges til at dyrke mykobakterier: faste, halvflydende, flydende. Imidlertid har ingen af de kendte næringsmedier egenskaber, der sikrer væksten af alle mykobakterielle celler. I denne henseende anbefales det at bruge 2-3 næringsmedier med forskellig sammensætning samtidigt for at forbedre effektiviteten.

Som standardmedium til primær isolering af tuberkulosepatogenet og bestemmelse af dets lægemiddelfølsomhed anbefaler WHO Lowenstein-Jensen-mediet. Dette er et tæt ægmedium, hvor mykobakterievækst opnås på den 20.-25. dag efter såning af bakterioskopisk positivt materiale. Såning af bakterioskopisk negativt materiale kræver en længere inkubationsperiode (op til 10-12 uger).

I vores land er Finn-II-ægmediet, som er foreslået af ER Finn, blevet udbredt. Det adskiller sig ved, at det i stedet for L-asparagin bruger natriumglutamat, som udløser andre veje til syntesen af aminosyrer i mykobakterier. Væksten forekommer på dette medium noget tidligere, og hyppigheden af mykobakterieisolering er 6-8 % højere end på Lowenstein-Jensen-mediet.

For at øge effektiviteten af den bakteriologiske diagnostik af ekstrapulmonal tuberkulose anbefales det at inkludere modificerede Finn-II-medier i næringsmediekomplekset. For at accelerere væksten tilsættes yderligere 0,05% natriumthioglycolat til Finn-II-næringsmediet, hvilket reducerer iltkoncentrationen. For at beskytte mykobakteriernes enzymsystemer mod giftige produkter fra lipidperoxidation tilsættes antioxidanten α-tocopherolacetat til Finn-II-næringsmediet i en koncentration på 0,001 μg/ml. Det diagnostiske materiale podes ved hjælp af standardmetoden.

I anti-tuberkuloselaboratorier i Rusland anvendes også andre modifikationer af tætte næringsmedier: næringsmediet "Novaya" foreslået af GG Mordovsky, næringsmedierne A-6 og A-9 udviklet af VA Anikin osv.

Da der under kemoterapi opstår skader på forskellige metaboliske systemer i den mikrobielle celle, mister en del af den mykobakterielle population evnen til at udvikle sig normalt på konventionelle næringsmedier og kræver osmotisk afbalancerede (halvflydende eller flydende) næringsmedier.

Evaluering og registrering af resultaterne af diagnostisk materialekultur

Nogle stammer og typer af mykobakterier vokser langsomt, vækst kan forekomme selv på den 90. dag. Antallet af sådanne kulturer er lille, men dette tvinger såningerne til at blive opbevaret i en termostat i 2,5-3 måneder.

Virulente kulturer af Mycobacterium tuberculosis vokser normalt på faste ægmedier som R-formede kolonier af varierende størrelse og udseende. Kolonierne er tørre, rynkede, elfenbensfarvede og let pigmenterede. På andre medier kan Mycobacterium tuberculosis-kolonier være mere fugtige. Efter en kemoterapibehandling eller under behandling kan glatte kolonier med fugtig vækst (S-former) isoleres.

Ved isolering af kulturer anvendes en række særlige undersøgelser til at skelne tuberkulose-mykobakterier fra ikke-tuberkuløse mykobakterier og syrefaste saprofytter.

Et positivt svar gives efter en obligatorisk mikroskopisk undersøgelse af et udstryg fra de dyrkede kolonier farvet efter Ziehl-Neelsen. I tilfælde af mykobakterievækst findes klare røde stave i udstrygningen, der ligger enkeltvis eller i grupper og danner klynger i form af filt eller fletninger. I unge kulturer, især dem, der er isoleret fra patienter, der er behandlet med kemoterapi i lang tid, er mykobakterier kendetegnet ved udtalt polymorfi, op til tilstedeværelsen af korte, næsten kokoide eller aflange varianter, der ligner svampemycelium, sammen med stavformede former.

Intensiteten af mykobakteriel vækst angives i henhold til følgende skema: (+) - 1-20 CFU i et reagensglas (lav bakteriel udskillelse); (++) - 20-100 CFU i et reagensglas (moderat bakteriel udskillelse); (+++) - >100 CFU i et reagensglas (rigelig bakteriel udskillelse). Ved laboratoriediagnostik af tuberkulose er det ikke tilstrækkeligt at give et svar på, om mykobakterier er blevet påvist ved en bestemt metode. Det er også nødvendigt at have en detaljeret idé om mængden og arten af mykobakteriepopulationen, dens sammensætning og egenskaber. Det er disse data, der gør det muligt at fortolke processens tilstand korrekt, planlægge taktikker og hurtigt justere behandlingen.

I de senere år er agarbaserede næringsmedier med forskellige vækstadditiver og brugen af en speciel gasblanding blevet foreslået for at accelerere væksten af mykobakterier. For at opnå vækst af mykobakterier på disse medier skabes en atmosfære med et forhøjet indhold af kuldioxid (4-7%) under dyrkningen. Til dette formål anvendes specielle CO2-inkubatorer _. Imidlertid har automatiserede mykobakteriedyrkningssystemer modtaget den største udvikling: MGIT-BACTEC-960 og MB/Bact.

Et af disse systemer er MGIT-systemet (mycobacteria growth indicating tube), som er en højteknologisk udvikling og er designet til accelereret bakteriologisk diagnostik af tuberkulose og bestemmelse af mykobakteriers følsomhed over for førstelinjemedicin og nogle andenlinjemediciner. MGIT er designet til brug som en del af VASTEC-960-enheden. Mikroorganismer dyrkes i specielle reagensglas med et flydende næringsmedium baseret på et modificeret Middlebrook-7H9-medium. For at stimulere væksten af mykobakterier og undertrykke væksten af fremmed mikroflora anvendes MGIT Growth Supplement og en blanding af PANTA-antibakterielle lægemidler.

Mikroorganismers vækst registreres optisk. Det er baseret på fluorescens, som opstår, når mykobakterier forbruger ilt under deres vækst. Et iltafhængigt fluorokromfarvestof er indeholdt i bunden af et specielt reagensglas og dækket af et lag silikone. Reproduktion af mykobakterier fører til et fald i mængden af ilt i reagensglasset og et fald i dets koncentration, hvilket forårsager en stigning i fluorescens, som bliver synlig, når reagensglasset bestråles med ultraviolet lys, og registreres automatisk af fotosensorer indbygget i VASTES-960-enheden. Luminescensintensiteten registreres i vækstenheder (GU). Vækstdata indtastes automatisk i en computer, hvor de kan gemmes. Computeranalyse af vækstkurver kan give information om tilstedeværelsen af forskellige puljer af mykobakterier, inklusive ikke-tuberkuløse, og hjælper også med at evaluere mykobakteriernes vækstegenskaber.

Som følge af introduktionen af sådanne systemer er væksttiden for mykobakterier blevet betydeligt reduceret, med et gennemsnit på 11 dage på VASTEC-960 og 19 dage på MB/Bact versus 33 dage på et standard tæt næringsmedium. Det skal bemærkes, at disse systemer kræver højt kvalificeret personale. Såning af materiale på flydende medier ledsages nødvendigvis af såning på Lowenstein-Jensen-medium, som fungerer som backup i tilfælde, hvor tuberkulosemykobakterier ikke vokser på andre medier.

[ 38 ], [ 39 ], [ 40 ], [ 41 ], [ 42 ], [ 43 ]

Bestemmelse af mykobakteriers lægemiddelfølsomhed

Bestemmelse af mykobakteriers spektrum og grad af følsomhed over for tuberkulosemedicin er af stor klinisk betydning, såvel som for den epidemiologiske vurdering af spredningen af lægemiddelresistent tuberkulose. Derudover giver overvågning af lægemiddelresistens os mulighed for at vurdere effektiviteten af anti-tuberkuloseprogrammet som helhed, da det er en integreret indikator for arbejdet med alle komponenter i anti-tuberkuloseforanstaltningerne.

Hyppighed og tidspunkt for lægemiddelfølsomhedstestning:

• før behandlingsstart, én gang for at bestemme behandlingsstrategi og -taktik:
• Ved isolering af kulturer fra forskellige materialer fra en patient (sputum, BAL, urin, ekssudater, cerebrospinalvæske osv.) undersøges alle isolerede stammer:
• ved afslutningen af den intensive behandlingsfase i fravær af klinisk og radiologisk dynamik:
• hvis det er nødvendigt at ændre behandlingsregimet i tilfælde af:
  • fravær af sputum-negativitet;
  • gendyrkning efter negativ sputumprøve;
  • en kraftig stigning i mængden af AFB i et smear efter et initialt fald. Det er velkendt, at stammer af Mycobacterium tuberculosis med forskellig lægemiddelfølsomhed isoleres fra materiale fra en patient med tuberkulose. Stammernes følsomhed over for antituberkuloselægemidler kan variere i lægemiddelspektret, graden, hyppigheden og hastigheden af resistensudviklingen.

Graden af lægemiddelresistens hos Mycobacterium tuberculosis bestemmes i overensstemmelse med etablerede kriterier, som fokuserer på den kliniske betydning af resistens og afhænger af lægemidlets antituberkuloseaktivitet, dets farmakokinetik, koncentrationen i læsionen, den maksimale terapeutiske dosis osv.

Bestemmelse af mykobakteriers lægemiddelfølsomhed udføres i øjeblikket ved hjælp af mikrobiologiske metoder:

• absolutte koncentrationer (fortyndingsmetode på faste eller flydende næringsmedier)
• proportioner,
• modstandskoefficient.

Resistens manifesterer sig normalt i form af visuelt observeret vækst af kolonier af mycobakterier tuberkulose, men der findes metoder, der inducerer vækst i de tidlige stadier af mycobakteriel celledeling i form af farvereaktioner. Disse metoder reducerer testtiden fra 3-4 til 2 uger.

Den absolutte koncentrationsmetode, som anbefales af WHO's kemoterapikomité, er blevet udbredt i Rusland som en samlet metode. Fra et metodologisk synspunkt er det den enkleste, men kræver høj standardisering og præcision i laboratorieprocedurerne. Lægemiddelfølsomhedstesten består af et sæt reagensglas med et næringsmedium modificeret med anti-tuberkuloselægemidler. Sættet består af 2-3 reagensglas med forskellige koncentrationer af hvert af de anvendte lægemidler, et kontrolreagensglas med et medium uden lægemidlet og et reagensglas indeholdende 1000 μg/ml natriumsalicylat eller 500 μg/ml paranitrobenzoesyre til at detektere væksten af ikke-tuberkuløse mykobakterier.

For at forberede et sæt medier med præparater anvendes et modificeret Lowenstein-Jensen-medium (uden stivelse), som hældes i kolber. En vis mængde af den tilsvarende fortynding af anti-tuberkulosemedicinen tilsættes til hver af kolberne. Kolbernes indhold blandes grundigt, hældes i reagensglas og koaguleres i en skrå position i 40 minutter ved en temperatur på 85 °C. Det anbefales at koagulere mediet i en elektrisk koagulator med automatisk temperaturkontrol. Medium med anti-tuberkulosemedicin

1. række kan opbevares i køleskab ved 2-4 °C i 1 måned, med lægemidler fra 2. række - højst 2 uger. Opbevaring af medier med lægemidler ved stuetemperatur er uacceptabelt. Ved fremstilling af opløsninger af antituberkuloselægemidler tages deres aktivitet i betragtning, idet koncentrationen beregnes med en justering for molekylvægten af den ikke-specifikke del af lægemidlet, renhed osv. For at bestemme lægemidlets følsomhed anvendes kun kemisk rene stoffer.

Metodens princip er at bestemme koncentrationen af et antituberkuloselægemiddel, der undertrykker væksten af en betydelig del af mykobakteriepopulationen. Når den udføres korrekt, har denne metode god pålidelighed.

Før testen udføres, er det nødvendigt at sikre, at den isolerede kultur af Mycobacterium tuberculosis ikke indeholder fremmed mikroflora. En homogen suspension indeholdende 500 millioner mikrobielle legemer i 1 ml (optisk turbiditetsstandard 5 enheder) fremstilles fra mykobakteriekulturen i en 0,9% natriumkloridopløsning. Den resulterende suspension fortyndes med 0,9% natriumkloridopløsning (1:10), og 0,2 ml af suspensionen tilsættes hvert reagensglas i næringsmediesættet. De inokulerede reagensglas placeres i en termostat ved 37 °C og holdes vandret i 2-3 dage, så den skrå overflade af næringsmediet inokuleres ensartet med suspensionen af Mycobacterium tuberculosis. Derefter flyttes reagensglassene til en lodret position og inkuberes i 3-4 uger. Resultaterne registreres efter 3-4 uger.

Da det tager mindst 1-1,5 måneder at isolere patogenet fra klinisk materiale på næringsmedier, kan resultaterne af bestemmelse af lægemiddelfølsomhed ved hjælp af denne metode tidligst opnås 2-2,5 måneder efter såning af materialet. Dette er en af de største ulemper ved metoden.

Resultaterne af mykobakteriel lægemiddelfølsomhedstestning fortolkes ud fra bestemte kriterier. På fast medium betragtes en kultur som følsom over for koncentrationen af lægemidlet i mediet, hvis antallet af mykobakterielle kolonier dyrket på et givet reagensglas med lægemidlet ikke overstiger 20 med rigelig vækst på et kontrolreagensglas uden lægemidler. Kun hvis der er mere end 20 kolonier, betragtes kulturen som resistent over for en given koncentration. I praksis er det nødvendigt at underrette den kliniske enhed, når der opnås vækstresultater i reagensglas tæt på 20 CFU, om, at følsomheden eller resistensen i dette tilfælde er grænsetilfælde, da dette nogle gange kan forklare den uklare dynamik i kliniske indikatorer.

For forskellige præparater fastsættes en bestemt koncentration, hvor reproduktionen af en kritisk andel af mykobakteriepopulationen observeres. Disse koncentrationer kaldes "kritiske". Størrelsen af væksten af mykobakteriepopulationen på et næringsmedium med præparatet i en kritisk koncentration anvendes som et kriterium for stabilitet.

I den indenlandske ftisiologipraksis er de ikke begrænset til kun at bestemme kritiske koncentrationer, når de bestemmer lægemiddelresistens. Dette skyldes, at en udvidet definition af patogenets niveau af lægemiddelresistens gør det muligt for klinikeren at formulere kemoterapitaktikker mere korrekt ved hjælp af viden om den potentierende effekt af lægemiddelkombinationer, for at forudse krydsresistens eller at anvende mere effektive lægemidler fra den anvendte gruppe af antituberkuloselægemidler.

Den absolutte koncentrationsmetode er den enkleste, men også den mest følsomme over for fejl, der begås i dens implementering. Mere pålidelig, især når man bestemmer følsomhed over for andenlinjelægemidler, og udbredt uden for Rusland er proportionsmetoden. Den tager højde for manglerne ved den absolutte koncentrationsmetode, men den er mere arbejdskrævende at implementere.

Metoden minder meget om den absolutte koncentrationsmetode. Forberedelse af reagensglas med lægemidler er den samme som ved den absolutte koncentrationsmetode. Imidlertid reduceres frødosis af tuberculosis mycobacterium-suspensionen med 10 gange, hvilket eliminerer hyppigheden af spontan resistens hos nogle tuberculosis mycobacterium-stammer over for lægemidler såsom ethambutol, prothionamid, capreomycin. Som kontroller anvendes 2 eller 3 rør med en frødosis svarende til den i reagensglassene, successivt fortyndet 10 og 100 gange. Kriteriet for resistens er andelen af visuelt observeret vækst af tuberculosis mycobacterium. For 1.-linjelægemidler er kriteriet for resistens en overskydende vækst på 1 % af den oprindelige population, for 2.-linjelægemidler - en vækst på 1 eller mere end 10 % af den oprindelige, afhængigt af den valgte kritiske koncentration.

I 1997 foretog WHO og Den Internationale Union mod Tuberkuloses arbejdsgruppe vedrørende påvisning af resistens mod tuberkuloselægemidler justeringer af disse kriterier og foreslog at betragte mykobakterier, der vokser på det tætte Lowenstein-Jensen-ægmedium i følgende koncentrationer, som resistente:

• dihydrostreptomycin - 4 μg/ml;
• isoniazid - 0,2 µg/ml:
• rifampicin - 40 mcg/ml:
• Ethambutol - 2 mcg/ml.

I 2001 blev der foreslået kritiske koncentrationer for følgende andenlinjelægemidler (for en kritisk andel på 1%):

• capreomycin - 40 mcg/ml;
• protionamid - 40 mcg/ml;
• kanamycin - 30 μg/ml;
• viomycin - 30 μg/ml;
• cycloserin - 40 mcg/ml;
• aminosalicylsyre - 0,5 mcg/ml;
• ofloxacin - 2 mcg/ml.

Vækstresultaterne vurderes efter 4 uger som foreløbige og efter 6 ugers dyrkning som endelige.

Til bestemmelse af lægemiddelfølsomhed over for pyrazinamid, som er meget anvendt i moderne tuberkulosekemoterapi, er den anbefalede kritiske koncentration 200 μg/ml. Der findes dog stadig ingen generelt accepteret metode til bestemmelse af lægemiddelresistens over for dette lægemiddel på faste næringsmedier, da dets antibakterielle aktivitet kun manifesterer sig i et surt miljø (pH <6), hvilket er teknisk vanskeligt at opretholde. Derudover er mange kliniske kulturer af Mycobacterium tuberculosis tilbageholdende med at dyrke på ægmedier med et surt miljø.

For at vurdere kvaliteten af resultaterne af bestemmelsen af mykobakteriers lægemiddelfølsomhed anbefales det at kontrollere hver ny batch af Lowenstein-Jensen-mediet ved parallel bestemmelse af følsomheden af standard museumsstammen H37Rv. Derudover er der visse mikrobiologiske kriterier, der skal opfyldes, for at metoderne giver et velreproducerbart og korrekt fortolket resultat. Disse omfatter levedygtigheden af tuberkulose-mykobakteriekulturen, reglerne for at opnå en homogen suspension og suspension, reglerne for udvælgelse af tuberkulose-mykobakteriekulturer og repræsentativiteten af den udvalgte bakteriemasse. Pålideligheden af bestemmelsen af lægemiddelresistens falder ved ekstremt dårlig bakterieudskillelse.

For nylig er metoden til bestemmelse af lægemiddelfølsomhed ved hjælp af automatiserede systemer blevet anerkendt som lovende. De mest avancerede på dette område er udviklinger baseret på VASTEC MGIT-960. I dette tilfælde bestemmes lægemiddelfølsomheden for tuberkulosemykobakterier baseret på en modificeret proportionsmetode. Under bestemmelsen sammenlignes vækstraten for tuberkulosemykobakterier i kontrolrøret og i rør med lægemidler. For at bestemme følsomheden over for streptomycin, isoniazid, rifampicin og ethambutol anvendes berigelsesadditiver og antibiotika inkluderet i SIRE-kittet. For at bestemme følsomheden over for pyrazinamid anvendes PZA-kittet. Under testen inokuleres reagensglas med lægemidler med en suspension af tuberkulosemykobakterier, samt kontrolglas med en 100-dobbelt fortynding af suspensionen for alle lægemidler, med undtagelse af pyrazinamid, hvor suspensionsfortyndingen er 10 gange. Kriteriet for stabilitet er mykobakterievækstindikatoren på 100 GU, når væksten i kontrolrøret når 400 GU (se "Kulturelle metoder til isolering af mykobakterier"). Resultaterne registreres og fortolkes automatisk og indstilles af det indtastede eller valgte program.

De endelige koncentrationer i reagensglasset med flydende næringsmedium anvendes som kritiske koncentrationer. I øjeblikket er der udviklet kritiske koncentrationer for både førstelinjelægemidler og nogle andenlinjelægemidler. Det skal bemærkes, at bestemmelsen af tuberkulosemykobakteriers følsomhed over for cycloserin og aminosalicylsyre kun udføres på æggenæringsmedier.

En detaljeret protokol for arbejde med det beskrevne system muliggør følsomhedstestning for lægemidler både på en isoleret kultur (med et tæt næringsmedium) og ved brug af den primære vækst af mykobakterier i et MGIT-reagensglas. Sidstnævnte mulighed reducerer betydeligt den tid, der kræves til at udføre kulturstudier, hvilket giver mulighed for at opnå fulde resultater af kulturen af tuberkulosemykobakterier (inklusive information om lægemiddelfølsomhed) inden for 3 uger efter indsamling af materialet, mens den traditionelle metode først kan give dette inden for den 3. måned. Rettidige resultater, når patienten er i den intensive behandlingsfase, kan kompensere for de relativt høje omkostninger ved studierne.

[ 44 ], [ 45 ], [ 46 ], [ 47 ], [ 48 ], [ 49 ], [ 50 ]

Differentiering af mykobakterier

I betragtning af at de anvendte næringsmedier ikke er strengt selektive, anses efterfølgende differentiering af de isolerede mykobakterier for obligatorisk. Behovet for differentiering af mykobakterier skyldes en række træk ved patologiske processer forårsaget af repræsentanter for slægten: forskelligt forløb og udfald af tuberkulose og mykobakteriose, tilstedeværelsen af naturlig lægemiddelresistens over for nogle antituberkuloselægemidler.

Det er anerkendt, at den primære identifikation af mykobakterier af M. tuberculosis-komplekset fra ikke-tuberkuløse mykobakterier udføres i henhold til følgende karakteristika: væksthastighed på tætte næringsmedier, pigmentdannelse, kolonimorfologi, tilstedeværelsen af syreresistens og den optimale temperatur for vækst.

Desværre findes der ingen enkelt laboratoriemetode, der pålideligt kan skelne mykobakterier af M. tuberculosis-komplekset fra andre syrefaste mykobakterier; en kombination af de ovenfor beskrevne tegn med resultaterne af en række biokemiske tests, der er angivet nedenfor, muliggør dog identifikation af mykobakterier af M. tuberculosis-komplekset med en sandsynlighed på op til 95%.

For at skelne mykobakterier af M. tuberculosis-komplekset (M. tuberculosis, M. bovis, M. bovisBCG, M. africanum, M. microti, M. canettii og andre) fra langsomt voksende ikke-tuberkuløse mykobakterier, anvendes grundlæggende biokemiske tests til at detektere tilstedeværelsen af følgende tegn:

• evne til at producere nikotinsyre (niacintest):
• nitratreduktaseaktivitet;
• termostabil katalase;
• vækst på et medium med natriumsalicylat (1 mg/ml).

Som en yderligere test kan væksttest på et medium indeholdende 500 μg/ml para-nitrobenzoesyre eller 5% natriumchlorid også anvendes.

Mange bakteriologiske laboratorier identificerer kun disse mikroorganismer på det komplekse niveau, hvilket skyldes laboratoriernes begrænsede kapacitet og specialisternes metodologiske evner.

I de fleste tilfælde i praksis er følgende tests tilstrækkelige til at differentiere mellem M. tuberculosis og M. bovis: niacin, nitratreduktase, pyrazinamidase og vækstregistrering på et medium indeholdende 2 μg/ml thiophen-2-carboxylsyrehydrazid. Det tages i betragtning, at mykobakterier i M. tuberculosis-komplekset er karakteriseret ved følgende sæt af karakteristika:

• langsom vækst (mere end 3 uger);
• væksttemperatur inden for 35-37 ^o C;
• fravær af pigmentering (elfenbensfarve);
• udtalt syrefast farvning;
• positiv niacintest;
• positiv nitratreduktasetest;
• fravær af termostabil katalase (68 ^° C).
• manglende vækst på Lowenstein-Jensen-medium indeholdende:
  • 1000 µg/ml natriumsalicylsyre
  • 500 mcg/ml para-nitrobenzoesyre,
  • 5% natriumklorid:
• vækst i nærvær af 1-5 μg/ml thiophen-2-carboxylsyre.

Relevansen af differentiering af isolerede mykobakterier vil stige betydeligt i takt med stigende hyppighed af registrering af HIV/AIDS-tilfælde forbundet med tuberkulose eller mykobakteriose. På nuværende tidspunkt er der ingen absolut sikkerhed for, om de praktiske regionale laboratorier er parate til korrekt at udføre denne mængde arbejde.

[ 51 ], [ 52 ], [ 53 ], [ 54 ], [ 55 ], [ 56 ], [ 57 ], [ 58 ]

Immunologisk diagnostik af tuberkulose

Der findes en række universelle fænomener, præparater og immunologiske tests, der oprindeligt blev opdaget specifikt i tuberkulose eller i modellen for immunrespons på mykobakterier. Disse omfatter BCG og tuberkulin, et fænomen som hud-DST (tuberkulintest - Pirquet og Mantoux-reaktioner), reaktionen på subkutan administration af tuberkulin til sensibiliserede dyr (Koch-fænomen). Nogle af de første antistoffer mod infektionssygdomme blev også opdaget i tuberkulose. Jo dybere forståelsen af mekanismerne bag antituberkuloseimmunitet og deres genetiske kontrol er, desto bredere kan brugen af immunologiske metoder og præparater, der påvirker immuniteten, naturligvis være til at løse praktiske problemer inden for ftisiologi.

Det vigtigste og mest komplekse praktiske problem i øjeblikket anses for at være påvisning af tuberkulose i forbindelse med massescreening af befolkningen. Trods adskillige rapporter om "succeser" (på begrænset materiale) findes der dog ingen immunologisk metode (reproducerbar i "enhver hånd") eller lægemiddel, der er egnet til disse formål.

Immunologiske metoder, især serologiske undersøgelser (bestemmelse af antigener, antistoffer) og tuberkulinprovokationstest, anvendes i vid udstrækning i klinisk praksis.

Serologiske metoder, som bestemmer antigener og antistoffer i forskellige miljøer i kroppen, er på førstepladsen blandt immunologiske undersøgelser, der anvendes i differentialdiagnostik.

Specificiteten af bestemmelsen af antistoffer mod mykobakterier tuberkulose afhænger af de antigener, der anvendes i immunanalysen. Et betydeligt antal antigener er blevet foreslået, hvoraf det første er tuberkulin PPD:

• PPD og andre komplekse præparater fra kulturvæske;
• ultralydsdesintegreringsmiddel;
• Triton-ekstrakt og andre komplekse cellevægspræparater;
• 5-antigen (Daniel);
• 60-antigen (Coccito);
• lipoarabinomannan;
• navlestrengsfaktor (trehalose-6,6-di-mycolat);
• phenoliske og andre glykolipider;
• lipopolysaccharider;
• fibronektinbindende antigen;
• proteiner (oftest rekombinante); 81, 65, 38, 34, 30, 19, 18, 16, 15,12 KDA osv.

Som et resultat af mange års forskning udført af russiske og udenlandske forskere er de vigtigste mønstre for antistofdannelse og effektiviteten af serologisk diagnostik af tuberkulose blevet identificeret: jo mere komplekst antigenet er, desto højere er følsomheden og desto lavere er testenes specificitet. Specificiteten varierer i forskellige lande afhængigt af befolkningens infektion med M. tuberculosis og ikke-tuberkuløse mykobakterier, BCG-vaccination osv. Hos børn er informativiteten af serodiagnostik lavere end hos voksne. Ved primær tuberkulose (oftere hos børn) er bestemmelsen af IgM mere informativ; ved sekundær tuberkulose - IgG. Hos HIV-inficerede personer er informativiteten af serodiagnostik i bestemmelsen af antistoffer reduceret. Effektiviteten af antistofbestemmelse afhænger af en række "kliniske momenter": processens aktivitet (tilstedeværelsen eller fraværet af "isolering" af mykobakterier, tilstedeværelsen af karies, graden af infiltration), processens forekomst, dens varighed.

Enzymimmunoassay-metodens (EIA) følsomhed er omkring 70 %. Undersøgelsens utilstrækkelige effektivitet skyldes dens lave specificitet. Tidligere blev mulighederne for at anvende serologisk screening i højrisikogrupper overvejet, især blandt personer med posttuberkuloseforandringer i lungerne.

For at øge specificiteten af ELISA søges der efter mere specifikke antigener, herunder dem, der er opnået ved genteknologi: ESAT-6 osv. (se ovenfor). Brugen af strengt specifikke antigener (38 kDa, ESAT) øger specificiteten, men reducerer analysens følsomhed betydeligt. Sammen med ELISA (eksperimentelle laboratorietestsystemer, såsom Pathozyme ELISA-kit) tilbydes også immunokromatografiske kits med lateral filtrering (Mycodot), såvel som andre lignende tests (membranpunktanalyse) med visuel vurdering af testresultatet. Ved udførelse af disse tests tager analysen 10-30 minutter; de kræver ikke specielt udstyr, de kræver visuel vurdering af resultaterne, hvilket er forbundet med en vis subjektivitet. Disse metoder har omtrent samme følsomheds- og specificitetskarakteristika (henholdsvis 70% og 90-93%) som traditionel ELISA.

Brugen af immunanalysemetoder har en vis værdi som en supplerende metode, der tages i betragtning i det kompleks af metoder, der anvendes i differentialdiagnosen af tuberkulose, især i diagnosticeringen af dens ekstrapulmonale former. ELISA-metoden er mest effektiv til diagnosticering af tuberkuløs meningitis ved undersøgelse af cerebrospinalvæsken. I dette tilfælde er analysens sensitivitet 80-85%, og specificiteten er 97-98%. Der findes information om effektiviteten af at bestemme antistoffer mod Mycobacterium tuberculosis i tårevæske i diagnosticeringen af tuberkuløs uveitis.

Induktion af gamma-interferonsyntese in vitro

Gamma-interferon (IFN-γ) er en faktor for specifik immunbeskyttelse, der opnås ved at aktivere makrofagernes enzymsystemer. Induktion af IFN-γ-syntese af sensibiliserede T-lymfocytter forårsages af deres interaktion med mykobakterielle antigener.

Både tuberkulin PPD og specifikke antigener opnået ved genteknologi anvendes som antigener, især ESAT-6-antigenet (tidligt secerneret antigen med en molekylvægt på 6 kDa) og CFP-10 (kulturfiltratprotein, 10 kDa). Genetisk manipulerede eller rekombinante antigener er fraværende i cellerne i BCG-vaccinen og andre mykobakterier. Ved brug af tuberkulin er resultaterne af IFN-γ-induktionstesten sammenlignelige med resultaterne af tuberkulin-hudtesten (direkte korrelation). Ved brug af genetisk manipulerede antigener er testresultaterne mere specifikke og afhænger ikke af tidligere BCG-vaccination. Ved undersøgelse af vaccinerede personer, der ikke har været i kontakt med tuberkuloseinfektion, er testens specificitet 99%. Testens følsomhed blandt tuberkulosepatienter varierer fra 81 til 89%.

Der er udviklet test og diagnostik baseret på korttidsdyrkning af fuldblodsceller eller mononukleære celler isoleret fra blod med tuberkulose-mykobakterieantigener in vitro, efterfulgt af bestemmelse af IFN-γ-koncentrationen eller tælling af antallet af T-lymfocytter, der syntetiserer IFN-γ. Koncentrationen af interferon syntetiseret i et reagensglas bestemmes ved ELISA ved hjælp af monoklonale antistoffer, der binder IFN-γ. Derefter bestemmes dens koncentration i reagensglasset eller pladens brønde ved hjælp af kalibrering af standard IFN-γ.

I Elispot-testen tælles antallet af T-celler, der syntetiserer IFN-γ, på overfladen af en skål belagt med antistoffer mod IFN-γ.

Udviklerne af in vitro IFN-γ induktionsdiagnostikken, som er godkendt af den amerikanske fødevare- og lægemiddelstyrelse (FDA), hævder, at testen ikke kan skelne latent tuberkuloseinfektion fra aktiv tuberkulose. Derfor har testen ingen direkte diagnostisk værdi i regioner med en høj infektionsrate. I vores land kan den dog bruges til at skelne tuberkuloseinfektion hos børn fra postvaccinationsallergi, samt til at vurdere niveauet af specifik immunitet under behandling.

I øjeblikket undersøges et indenlandsk testsystem til bestemmelse af induktionen af IFN-γ-syntese ved specifikke tuberkuloseantigener in vitro.

Immunstatus og forløb af tuberkulose, immunkorrektion

Under behandlingen af tuberkulose forekommer der ændringer i antigenæmi og immunsystemets tilstand hos mennesker.

Dataene om ændringer i ekssudater og væv er i vid udstrækning modstridende. Det eneste, der med fuld berettigelse kan bemærkes, er, at tuberkuløse granulomer som regel indeholder et betydeligt antal aktiverede T-lymfocytter.

Det giver mening at dvæle ved to punkter mere, der er nødvendige for at forstå immunologiske mekanismers rolle i behandlingen af tuberkulose hos mennesker:

• AIDS-patienter har en særlig høj forekomst af at udvikle multipel lægemiddelresistens;
• I tilfælde af multipel lægemiddelresistens (og i fravær af HIV-infektion) er immunforstyrrelser (primært T-celleimmunitet) særligt betydningsfulde.

Ved tuberkulose anvendes forskellige metoder til immunkorrektion i vid udstrækning: først og fremmest er det lægemidler, der primært virker på T-celleimmunitet og det mononukleære fagocytsystem (thymushormoner, isofon, likopid, polyoxidonium osv.), såvel som hele (svækkede) mykobakterier og deres komponenter.

Molekylærbiologisk diagnostik af tuberkulose

Molekylærbiologiske metoder i diagnostik af infektionssygdomme omfatter primært metoder baseret på manipulation af genomisk materiale fra bakterielle og virale patogener for at identificere specifikt genetisk materiale - DNA-sektioner med en nukleotidsekvens specifik for en given art eller stamme af patogen, til analyse af specifikke DNA-sekvenser i gener, der bestemmer patogenets følsomhed over for bestemte lægemidler, samt til analyse af den funktionelle aktivitet af bestemte gener i patogenet. Molekylærbiologiske metoder er blevet udbredt inden for videnskabelig forskning og praktisk anvendelse i diagnostik og overvågning af forskellige bakterielle og virale infektioner efter opdagelsen af polymerasekædereaktionen i 1985 af Carrie Mullis (nobelprismodtager 1989).

Principper og egenskaber ved polymerasekædereaktionsmetoden

PCR muliggør amplifikation (multiplikation) af en nukleotidsekvens (et fragment af patogen-DNA) i et reagensglas på få timer millioner af gange. Udførelsen af reaktionen i nærvær af enkelte DNA-kæder bestemmer analysens usædvanligt høje følsomhed.

Nukleotidsekvensen af visse sektioner af DNA-kæden bestemmer mikroorganismens genetiske unikhed, hvilket forklarer PCR's høje specificitet.

Betydningen af denne metode til påvisning og undersøgelse af Mycobacterium tuberculosis' karakteristika skyldes mikroorganismens biologiske karakteristika, som har en meget langsom vækst: fordoblingstiden for Mycobacterium tuberculosis-DNA'et under dyrkning er 12-24 timer.

Princippet for PCR-metoden er amplifikation - multipel, millionvis multiplikation af sektioner af en specifik DNA-sekvens i et reagensglasmikrovolumen med cyklisk gentagelse af de følgende tre reaktionstrin, som hver især finder sted i et forskelligt temperaturregime:

• Trin I - denaturering af dobbeltstrenget DNA ved opvarmning med divergens af dets kæder;
• Trin II - komplementær binding (hybridisering) af primere (primende oligonukleotider) med endeafsnittene af kæderne i et strengt specifikt DNA-fragment udvalgt til amplifikation;
• Trin III – færdiggørelse af DNA-fragmentkæden ved hjælp af termostabil DNA-polymerase.

Til amplifikation skal reagensglasset indeholde matrix-DNA-molekyler. Fire typer deoxynukleosidtrifosfater (nukleotider) indeholdende de tilsvarende nitrogenholdige baser: adenin (A), thymin (T), guanin (G), cytosin (C); kunstigt syntetiserede priming-oligonukleotider (primere) bestående af 18-20 basepar; et termostabilt enzym, DNA-polymerase, med et temperaturoptimum på 68-72 ^° C, og magnesiumioner.

PCR's specificitet afhænger af valget af DNA-fragment. I overensstemmelse hermed syntetiseres flankerende primer-oligonukleotider. Specificiteten af hybridisering og færdiggørelse af DNA-kæden bestemmes af princippet om komplementaritet af følgende par af nitrogenholdige baser: adenin-thymin, guanin-cytosin.

For at bestemme genomet for tuberkulose-kompleksmykobakterierne er det mest effektive amplifikationsmål i de fleste testsystemer IS6110-DNA-fragmentet, som i de fleste tuberkulose-mykobakteriestammer har et betydeligt antal (10-20) gentagelser i genomet, hvilket sammen med specificitet sikrer høj analysefølsomhed. Samtidig er tuberkulose-mykobakteriestammer med et lille antal gentagelser eller fravær af IS6110-fragmentet blevet beskrevet.

Ekstraktion af DNA-molekyler fra en biologisk prøve

For at udføre PCR skal patogenets DNA-molekyler isoleres fra det biologiske materiale i et minimalt volumen med en minimal mængde uspecifikt DNA og forskellige inhibitorer af enzymet - DNA-polymerase.

Prøveforberedelse skal udføres under forhold, der forhindrer krydskontaminering af de prøver, der undersøges, med isolerede DNA-molekyler. Dette kræver forudgående behandling af rummet med ultraviolet lys, gulve og arbejdsflader på borde og apparater - med klorholdige opløsninger. Det er også nødvendigt at bruge rene handsker, engangsreagensglas og spidser til automatiske pipetter.

For at isolere DNA'et fra Mycobacterium tuberculosis fra kliniske prøver (cerebrospinalvæske, bronkial lavage), der ikke indeholder et stort antal leukocytter, cellulært affald eller salte, er det tilstrækkeligt at centrifugere prøven ved 3-4 tusinde omdrejninger i minuttet, tilsætte 20-30 µl af en 2% opløsning af Triton X-100 til sedimentet og opvarme ved 90 ^° C i 30 minutter.

Forberedelse af sputumprøver kræver effektiv likvefaktion, typisk ved brug af 4% natriumhydroxid og N-acetyl-L-cystein (NALC) med 50-80 mg pr. prøve, afhængigt af prøvens viskositet. NALC-opløsningen bør fremstilles ex tempore, eller NALC-pulver kan tilsættes tørt direkte til prøven. Efter likvefaktion bør prøverne centrifugeres i 15 minutter ved 3.500-4.000 rpm (3.000 g) i 50 ml skruelågsrør, dvs. under de samme betingelser, der anbefales til prækulturforberedelse af sputum.

For at udvinde DNA fra sediment anvendes oftest en metode baseret på brugen af en 5-6 molær opløsning af guanidinisothiocyanat som lyseringsreagens og mikroporøse siliciumoxidpartikler ("diatoméjord"), der sorberer DNA-molekyler. Uspecifikke stoffer, herunder mulige inhibitorer, vaskes derefter i en 2,5 molær opløsning af guanidinisothiocyanat og en ethanolopløsning, hvorefter DNA-molekylerne desorberes i vand, og disse prøver bruges til at udføre PCR. For at forenkle DNA-ekstraktionsteknologien erstattes "diatoméjord" ofte af magnetiske mikropartikler belagt med siliciumoxid. I dette tilfælde anvendes et specielt magnetisk stativ til mikrorør til at udfælde partiklerne i stedet for centrifugering.

En original metode til immunomagnetisk separation af mykobakterier med efterfølgende ekstraktion af patogen-DNA er blevet udviklet i Rusland. Til immunomagnetisk separation af tuberkulosemykobakterier anvendes ferropartikler på 3-5 μm i størrelse, belagt med siliciumoxid, hvortil polyklonale (kanin) antistoffer mod tuberkulosemykobakterier er bundet ved hjælp af en kemisk binding. Sputumprøver neutraliseres efter alkalisk lysis med en sur Tris-HCl-opløsning og inkuberes med et immunomagnetisk sorbent. Derefter opsamles immunferropartiklerne ved hjælp af en magnetisk stang med en udskiftelig spids, overføres til et mikrorør og udfældes. 20-30 μl af en 2% Triton X-100-opløsning tilsættes og opvarmes i 30 minutter ved 90 ^° C. Supernatanten anvendes som DNA-matrix til PCR-analyse.

Et vanskeligt problem er ekstraktion af tuberculosis mycobacterium-DNA fra biopsiprøver. Til biopsilyse anvendes enzymet proteinase K i en slutkoncentration på 200-500 mg/l ved en temperatur på 56 ^° C natten over. Derefter ekstraheres det ved hjælp af en af de kendte metoder. Overskydende uspecifik DNA i PCR-analyse af biopsiprøver forårsager ofte hæmning af reaktionen, hvilket kræver gentagen DNA-ekstraktion.

Metoder til resultatdetektion

Efter afslutningen af reaktionen identificeres de amplificerede fragmenter af patogen-DNA ved hjælp af forskellige metoder.

Gelelektroforesemetoden er velkendt. I dette tilfælde identificeres det opnåede DNA-fragment ved hjælp af en positiv kontrol, der indeholder det ønskede specifikke DNA-fragment, eller ved hjælp af en på forhånd kendt størrelse (antal nukleotidpar) af fragmentet, som bestemmes ved hjælp af en standard molekylær markør.

I nærvær af et specifikt farvestof - ethidiumbromid, som er inkluderet i dobbeltstrenget DNA, afsløres det syntetiserede DNA-fragment som et bånd, der lyser under påvirkning af ultraviolet lys.

Størrelsen af DNA-fragmentet, bestemt ved elektroforese baseret på den tilbagelagte afstand fra starten, skal svare til en kendt molekylvægtmarkør eller positiv kontrol.

Andre metoder til bestemmelse af PCR-resultater er baseret på hybridisering af enkeltstrengede PCR-produkter med et komplementært oligonukleotid - en DNA-probe mærket med biotin, efterfulgt af detektion ved hjælp af en enzymatisk reaktion ved for eksempel at binde et streptavidin-alkalisk fosfatase-konjugat til biotin.

Baseret på denne type detektion er der blevet skabt PCR-analysatorer, hvor detektionen af PCR-resultater udføres automatisk som et resultat af aflæsning af den optiske densitet i prøverne, efter at den enzymatiske reaktion har fundet sted.

Ulemperne ved disse metoder omfatter muligheden for intralaboratoriekontaminering med forholdsvis korte fragmenter af DNA-molekyler. Når disse molekyler kommer ind i nyligt testede prøver, bliver de en matrix for PCR og fører til falsk positive resultater.

I denne henseende indføres der strenge regler for adskillelse og isolering af rum for at forhindre falsk positive resultater: rum til DNA-ekstraktion fra biologiske prøver; rum til detektion af resultater (elektroforese) fra den rene zone. Disse rum repræsenterer en zone med sandsynlig kontaminering. En anden isoleret zone er et rent rum til indføring af de undersøgte DNA-prøver i reagensglas med reaktionsblandingen til PCR. Og endelig antages det, at hovedenheden - DNA-forstærkeren - skal tages ud til et separat rum, muligvis kontorrum.

For at forhindre kontaminering med produkter fra tidligere reaktioner - amplikoner - indeholder nogle PCR-testsystemer deoxynukleosid uridin i stedet for deoxynukleosid thymidin, som opbygges i den tilsvarende position under in vitro-kædesyntese, dvs. den nitrogenholdige base thymin, der er til stede i nativt DNA, erstattes af uracil. Uracil-DNA-glykosylase tilsat reaktionsblandingen af det analyserede materiale ødelægger kun kontaminerende fragmenter med deoxyuridin, men ikke det native analyserede DNA, der indeholder deoxythymidin. Efterfølgende opvarmning ved 94 ^° C inaktiverer dette enzym og interfererer ikke med amplifikationen i PCR.

Der findes et testsystem baseret på isotermisk amplifikation af rRNA, hvor revers transkription og syntese af DNA-molekyler først udføres, som igen danner matrixen for den efterfølgende syntese af RNA-molekyler. RNA-amplikoner detekteres ved hjælp af en acridinfarvet DNA-probe under hybridisering i en reaktionsrørsopløsning. Denne metode har, udover høj følsomhed, den fordel, at analysen udføres i ét rør, hvilket forhindrer kontaminering. Ifølge forfatterne når følsomheden af denne metode i respirationsprøver 90% med en specificitet på 99-100%.

Nye detektionsmetoder implementeres i realtids-PCR. Disse metoder adskiller sig primært ved, at PCR og detektion af dens resultater udføres samtidigt i et lukket reagensglas. Dette forenkler ikke kun teknologisk analysemetoden, men forhindrer også kontaminering af laboratorielokaler og prøver med produkter fra tidligere PCR.

I realtids-PCR detekteres resultater ved fluorescens, der stammer fra hybridisering af en fluorogen DNA-probe med et specifikt DNA-fragment amplificeret under PCR. Strukturen af fluorogene DNA-prober er konstrueret på en sådan måde, at den fluorescerende markør frigives som følge af en enzymatisk reaktion eller kun distancerer sig fra fluorescensdæmpermolekylet ved specifik hybridisering med det ønskede DNA-molekyle amplificeret under PCR. Efterhånden som antallet af molekyler hybridiseret med proben stiger, er stigningen i fluorescens til et detekterbart niveau proportional med antallet af molekyler af det amplificerede produkt. Da antallet af DNA-fragmentmolekyler fordobles under hver PCR-cyklus, er antallet af cyklusser, hvorfra fluorescens detekteres og stiger, omvendt proportional med antallet af DNA-molekyler i den oprindelige prøve. Hvis flere forskellige kendte koncentrationer af molekyler af det tilsvarende fragment af tuberculosis mycobacterium DNA introduceres i reaktionen som en kalibrator, kan antallet af DNA-genomer i det materiale, der undersøges, beregnes ved hjælp af et computerprogram.

Hver standardprøve duplikeres. Det kvantitative kriterium er det minimale antal PCR-cyklusser, der kræves for at detekterbar fluorescens kan opstå og vokse. Abscisseaksen er antallet af cyklusser; ordinataksen er fluorescensværdien. DNA-koncentrationerne er omvendt proportionale med antallet af cyklusser, der kræves for at fluorescens skal opstå. Vinduerne i højre kolonne (21-32) viser cyklustallene for de tilsvarende koncentrationer. Forskellene mellem 10-dobbelte koncentrationer af DNA-fragmenter på 10² ^- 10³ ^ml er 3,2-3,4 cyklusser. For to patienter var koncentrationerne af IS6110-fragmenter omkring 10³ ^/ ml og ^10³ /ml. Under hensyntagen til antallet af gentagelser (6-20) af de analyserede fragmenter i genomet af Mycobacterium tuberculosis er antallet af Mycobacterium tuberculosis i de kliniske prøver henholdsvis omkring 100 og 1000 celler.

Anvendelse af PCR til diagnosticering af tuberkulose

PCR-metoden anvendes i videst muligt omfang til hurtig diagnose af tuberkulose - påvisning af Mycobacterium tuberculosis i kliniske prøver: sputum, bronkialskylning, pleuraekssudat, urin, cerebrospinalvæske, osteolysepunktioner, aspirater fra kvindelige kønsorganer og forskellige biopsier. I et studie i Holland med omkring 500 prøver af sputum og bronkialskylning fra 340 patienter med en bekræftet diagnose af lungetuberkulose blev den sammenlignende følsomhed af PCR-, dyrknings- og smearmikroskopimetoderne undersøgt. Analysens følsomhed var henholdsvis 92,6, 88,9 og 52,4%. Specificiteten af alle metoder var omkring 99%.

Der blev foretaget en sammenligning af effektiviteten af påvisning af Mycobacterium tuberculosis ved hjælp af smearmikroskopi, såning på Lowenstein-Jensen-medium, VASTES-testsystemet og PCR-analyse. PCR viste en følsomhed på 74,4%, mikroskopi - 33,8%, såning på et fast medium - 48,9% og VASTES - 55,8%. Den gennemsnitlige detektionstid for såning på Lowenstein-Jensen-medium er 24 dage. VASTES - 13 dage, PCR - 1 dag.

Potentialet for at bruge PCR som en følsom og hurtig metode til at overvåge effektiviteten af tuberkulosebehandling diskuteres også.

Påvisning af Mycobacterium tuberculosis-DNA ved PCR-metoden med effektiv kemoterapi bestemmes over en længere periode - i gennemsnit 1,7 måneder sammenlignet med bakteriel udskillelse bestemt ved fluorescensmikroskopi og 2,5 måneder sammenlignet med bakteriologisk undersøgelse.

Diagnose af ekstrapulmonale former for tuberkulose

PCR's betydning som en følsom metode er især stor for ekstrapulmonale former, da det netop er i disse former, at kliniske og radiologiske metoder og traditionelle bakteriologiske metoder til bestemmelse af Mycobacterium tuberculosis i diagnostiske materialer er ineffektive.

Ved undersøgelse af urinprøver var PCR-analyseresultaterne positive hos 16 ud af 17 patienter med aktiv tuberkulose i urinvejene og negative hos 4 patienter med inaktiv nyretuberkuløshed og 39 patienter med ikke-tuberkuløse sygdomme i urinvejene.

Effektiviteten af PCR-analyse i studiet af knoglemarvsaspirater hos patienter med feber af ukendt genese med mistanke om tuberkuløs sygdomsartethed blev demonstreret. Til diagnosticering af tuberkuløs lymfadenitis hos børn blev 102 punkteringsaspirater og biopsiprøver fra 67 børn med mistanke om tuberkuløs lymfadenitis undersøgt. Positive resultater blev opnået: ved realtids-PCR - 71,6%, fluorescensmikroskopi - 46,3%, kulturstudie - 41,8%. I studiet af 50 lymfeknudebiopsier hos patienter med katteskrabesygdom var alle resultater negative. Således blev 100% specificitet af PCR-analysen demonstreret. I samme arbejde blev muligheden for at detektere M. avium vist i punkteringsbiopsi af lymfeknuder.

Diagnose af kvindelig genital tuberkulose i forbindelse med infertilitet er kendt for at være et af de vanskeligste diagnostiske problemer. Positive resultater blev opnået i PCR-undersøgelser af endometriebiopsier, endometrieaspirater og Douglas-posevæskeprøver hos 14 (56%) ud af 25 patienter, der blev undersøgt laparoskopisk med mistanke om tuberkulose. Smearmikroskopi og dyrkningsundersøgelser gav henholdsvis 1 og 2 positive resultater. Disse tilfælde var også PCR-positive. De fleste PCR-positive resultater var i tilfælde med karakteristiske træk ved tuberkulose ifølge histologisk undersøgelse; et mindre antal var i tilfælde med mistanke om tuberkulose ifølge laparoskopi. Kun ét positivt PCR-resultat blev opnået i mangel af laparoskopiske data for tuberkulose.

Ved diagnosticering af ekstrapulmonale former for tuberkulose har klinikere ofte spørgsmål om muligheden for at identificere patogenet ved undersøgelse af blodprøver ved hjælp af PCR-metoden. Litteraturdata tyder på, at detektion af Mycobacterium tuberculosis-DNA fra blodprøver er mulig ved fremskredne former for HIV-infektion. Mycobacterium tuberculosis-DNA blev kun påvist ved generaliseret tuberkulose i forskellige organer hos patienter med transplanteret nyre og immunsuppression.

[ 59 ], [ 60 ], [ 61 ], [ 62 ], [ 63 ]

Artsidentifikation af mykobakterier

PCR-metoden kan være ret effektiv til hurtig identifikation af mykobakterier i tuberkulosekomplekset og nogle typer ikke-tuberkuløse mykobakterier efter at have opnået deres primære vækst. I dette tilfælde kan brugen af PCR spare 7-10 dage, der kræves til efterfølgende kulturidentifikation af et positivt resultat. PCR-undersøgelsen er teknisk set meget enkel, da den ikke kræver kompleks prøveforberedelse af klinisk materiale for at opnå høj følsomhed. Ved undersøgelse af 80 positive kulturer i et sådant testsystem (MB BacT. fra Organon) var alle positive PCR-analyseresultater strengt specifikke og blev udført inden for 1 dag. For at identificere andre typer mykobakterier, når de opnås i kultur, hybridiseres patogen-DNA'et med specifikke DNA-prober mærket med acridin, og stammerne detekteres ved forekomst af kemiluminescens ved hjælp af et kemiluminometer eller på nitrocellulosestrimler med visuel vurdering efter hybridisering. Dette kit identificerer et begrænset antal arter: Mycobacterium tuberculosis complex, M. avium, M. avium complex, M. kansasii og M. gordonae.

A. Telenti et al. udviklede også en relativt simpel og billig metode til artsidentifikation af klinisk vigtige mykobakterier baseret på PCR og efterfølgende behandling med to restriktionsenzymer (enzymer, der har evnen til at skære et DNA-molekyle på specifikke punkter). I dette tilfælde amplificeres et DNA-fragment, der koder for et varmechokprotein (65 kDa), hvorefter det DNA-fragment, der opnås ved PCR, og som er 439 nukleotidpar i størrelse, behandles separat med to enzymer - Bste II og Нае III. Derefter analyseres de to opnåede produkter ved hjælp af agarosegelelektroforese, hvorved deres størrelser (antal nukleotidpar) bestemmes ved hjælp af et sæt standard DNA-fragmenter (molekylære DNA-markører) fra 100 til 1000 nukleotidpar i længden. I hver af de definerede arter (M. tuberculosis, M. avium, M. intracellulare, M. kansasii, M.fortuitum) findes 2 eller 3 DNA-fragmenter af forskellig størrelse for hvert restriktionsenzym. Kombinationen af de resulterende DNA-fragmenter af forskellig størrelse gør det muligt at differentiere disse arter fra hinanden.

En teknologi til biologiske DNA-mikroarrays er under udvikling, som vil hjælpe med at identificere mere end 100 arter af mykobakterier i et enkelt studie.

Artsidentifikation kan også udføres ved hjælp af PCR-amplifikation af den variable region af 16S rRNA efterfulgt af sekventering af amplikonerne i sammenligning med den tilsvarende primære struktur, hvilket muliggør identifikation af mere end 40 arter af mykobakterier.

PCR kan også bruges til at identificere arter inden for tuberculosis mycobacterium-komplekset, herunder differentiering mellem M. bovis og M. bovis BCG. Dette gøres ved at analysere tilstedeværelsen eller fraværet af bestemte gener i de genomiske regioner RD1, RD9 og RD10. RD1 er fraværende i M. bovis BCG, men er til stede i virulente arter, herunder M. bovis.

Bestemmelse af lægemiddelfølsomhed over for Mycobacterium tuberculosis ved hjælp af PCR

Opgaverne for molekylærgenetiske metoder til bestemmelse af lægemiddelfølsomhed eller resistens hos Mycobacterium tuberculosis er reduceret til at identificere mutationer i bestemte nukleotidsekvenser af kendte gener. Hovedmetoderne er baseret enten på direkte aflæsning (sekventering) af disse sekvenser efter amplifikation eller på hybridisering af biotin-mærkede DNA-fragmenter amplificeret under PCR med DNA-prober. Begge muligheder involverer identifikation af substitutioner i nukleotidsekvenser, der, når DNA-prober anvendes, fører til fravær eller ufuldstændig hybridisering på en nitrocellulosemembran ved hjælp af et enzymkonjugat (streptavidin-alkalisk fosfatase) - LIPA-Rif-TB-metoden.

Metoden til måling af fluorescens i lokalt fikserede DNA-prober på mikroregioner, der er komplementære til kendte mutationer i PCR-amplificerede genregioner, der er ansvarlige for lægemiddelfølsomhed eller -resistens, kaldes microbiochips-metoden. Den grundlæggende algoritme til at udføre denne undersøgelse er som følger. Efter at DNA er isoleret fra en klinisk prøve eller mykobakteriel kultur, skal PCR udføres for at amplificere de tilsvarende fragmenter af groB-genet, der er ansvarligt for lægemiddelfølsomhed over for rifampicin, eller katG- og inhA-generne, der koder for mykobakterielle proteiner, der er ansvarlige for følsomhed over for isoniazid. PCR-resultaterne vurderes ved hjælp af agarosegelelektroforese, som bekræfter modtagelsen af de tilsvarende DNA-fragmenter af den ønskede længde. Derefter udføres en 2. runde PCR for at introducere et fluorescerende mærke i DNA'et. PCR-resultaterne bekræftes igen ved gelelektroforese. Derefter udføres hybridisering (inkubation natten over) med efterfølgende vask af det opnåede materiale på en biochip, som er et stort antal korte DNA-kæder (prober) fikseret på en lille glasplade, komplementære til nukleotidsekvenserne af den lægemiddelfølsomme type tuberkulose-mykobakterier på de mulige mutationspunkter, såvel som til mutantsekvenser, der er ansvarlige for lægemiddelresistens. Placeringen af DNA-proberne på pladen er strengt defineret, og niveauet af fluorescens observeret under hybridisering til bestemmelse af resultatet ved hjælp af en speciel aflæsningsenhed fastlægges. I denne henseende bestemmes analyseresultaterne ved hjælp af et specielt computerprogram.

I de senere år er der blevet udviklet alternative metoder til bestemmelse af Mycobacterium tuberculosis' lægemiddelfølsomhed baseret på realtids-PCR-teknologi, hvilket gør det muligt at udføre disse undersøgelser i en lukket reagensglastilstand.

Figur 13-13 viser resultatet af analysen af kliniske kulturer af Mycobacterium tuberculosis til bestemmelse af lægemiddelresistens over for rifampicin ved hjælp af realtids-PCR: 218 - kontrolprøve (følsom over for rifampicin); 93 - positiv kontrol for Ser-Trp TCG-TGG-mutationen; 4482 - positiv kontrol for Ser-Leu TCG-TTG-mutationen; 162-322 - eksperimentelle prøver. Resultatet af beregning af de kinetiske amplifikationskurver for 4 kanaler: kanal 1: 393 - positiv kontrol for Ser-Trp TCG-TGG-mutationen; kanal 2: 4482 - positiv kontrol for Ser-Leu TCG-TTG-mutationen; 162, 163, 172, 295 - eksperimentelle prøver; kanal 4: kinetiske amplifikationskurver for alle prøver, der deltager i eksperimentet. Positiv kontrol af amplifikationsreaktionen. Konklusioner: Analysen afslørede følgende mutationer, der bestemmer resistens over for rifampicin: i prøverne 162, 163, 172, 295 - Ser-Leu TCG-TTG. Det samme princip blev brugt til at bestemme lægemiddelresistens over for isoniazid af katG- og inhA-generne, som bestemmer de hyppigste mutationer.

[ 64 ], [ 65 ], [ 66 ], [ 67 ], [ 68 ], [ 69 ]

Stammeidentifikation af Mycobacterium tuberculosis

Den mest studerede metode til stammeidentifikation af Mycobacterium tuberculosis er en teknologi kaldet restriktionsfragmentlængdepolymorfi (RFLP), som er baseret på fragmentering (restriktion) af Mycobacterium tuberculosis-DNA af enzymet Pvu II og efterfølgende hybridisering af de opnåede fragmenter med bestemte specifikke sekvenser på DNA'et fra dets repeat-element IS6110. Intraspecifik variation opnås på grund af det forskellige antal IS6110-gentagelser og deres placering på DNA'et, samt forskelligheden i afstande mellem bestemte angrebspunkter for restriktionsenzymet (restriktionssteder) og IS6110-elementet. Denne teknologi er meget kompleks og arbejdskrævende. Efter behandling af DNA'et isoleret fra tuberculosis-mycobacterium-kulturen med restriktionsenzym udføres gelelektroforese, hvorefter DNA-fragmenter af forskellig længde overføres til en nitrocellulosemembran, hybridiseres med fragmenter af IS6110-elementet, og resultaterne detekteres ved hjælp af en enzymatisk reaktion. Det resulterende specifikke båndmønster karakteriserer DNA'et fra en specifik tuberculosis-mycobacterium-stamme. Computeranalyse afslører identiteten eller slægtskabet mellem stammerne. Selvom RFLP-metoden er den mest diskriminerende, dvs. den afslører det største antal forskelle i de analyserede stammer, er den ineffektiv med et lille antal (mindre end 5) IS6110-gentagelser, observeret i nogle stammer. Figur 13-14 viser resultaterne af RFLP-typning af stammerne.

Et alternativ kan være spoligotypningsmetoden - analyse af polymorfien af spacer-DNA-sekvenser - mellem direkte gentagelser af DR-regionen. Ved spoligotypning af stammer udføres PCR med primere, der begrænser DR-regionen, hvorefter der dannes fragmenter af forskellig længde, som hybridiserer med variable mellemliggende DNA-regioner. Analyse af spacer-sekvenser af DR-regionen synes ifølge forskere enklere, mere produktiv og egnet til primær screening af stammer og indledende epidemiologisk analyse, samt til direkte undersøgelse af klinisk materiale.

En mere effektiv og teknologisk tilgængelig metode er naturligvis VNTR (forkortelse af engelske ord) eller metoden til bestemmelse af det variable antal nøjagtige tandemgentagelser i DNA'et fra Mycobacterium tuberculosis. Denne metode er udelukkende baseret på brugen af PCR og kræver ikke yderligere manipulationer. Da antallet af tandemgentagelser i forskellige stammer og i forskellige loci er forskelligt, bestemmes og analyseres fragmenter af forskellige størrelser på det resulterende elektroforegram af PCR-produkter. Ifølge forskere opnås en større grad af stammeradskillelse ved hjælp af VNTR end med RFLP-metoden.

I de senere år har der været stor opmærksomhed på spredningen af stammer af Mycobacterium tuberculosis af W-Beijing-familien (undertiden kaldet Beijing-stammen), som i vid udstrækning er lægemiddelresistente.

Grundlæggende krav til kvaliteten af molekylærbiologisk forskning

[ 70 ], [ 71 ], [ 72 ], [ 73 ]

Vigtigste reguleringsdokumenter til udførelse af PCR

Bekendtgørelser fra Den Russiske Føderations Sundhedsministerium: Nr. 45 af 7.02.2000; Nr. 109 af 21.03.2003; Nr. 64 af 21.02.2000. Retningslinjer: 1.3.1888-04 "Organisering af arbejdet under PCR-forskning af materiale inficeret med patogene biologiske agenser af III-IV patogenicitetsgrupper"; 1.3.1794-03 "Organisering af arbejdet under PCR-forskning af materiale inficeret med mikroorganismer af I-II patogenicitetsgrupper". 2003; 3.5.5.1034-01 "Desinfektion af testmateriale inficeret med bakterier af patogenicitetsgrupperne I-IV ved arbejde med PCR-metoden", 2001. Bilag 11 til instruktionerne om ensartede metoder til mikrobiologisk forskning i påvisning, diagnose og behandling af tuberkulose.

[ 74 ], [ 75 ], [ 76 ]

Personale

Molekylærbiologiske undersøgelser kan udføres af klinisk diagnostiske læger, bakteriologer, virologer, klinisk diagnostiske laboratoriebiologer samt specialister med sekundær medicinsk uddannelse, der har gennemgået specialisering og videreuddannelse på den etablerede måde.

Indretning af laboratorielokaler

Følgende laboratoriefaciliteter er nødvendige:

• Prøvebehandlingsområde - et laboratorium tilpasset til arbejde med infektiøse agenser i patogenicitetsgrupperne III-IV, i overensstemmelse med metodologiske retningslinjer 13.1888-04.
• Området til fremstilling af PCR-reaktionsblandinger er et laboratorierum, der beskytter mod intern laboratoriekontaminering - et "rent" område.
• • Hvis elektroforese eller hybridisering anvendes til at analysere PCR-produkter, skal det laboratorierum, hvor de amplificerede DNA-fragmenter ekstraheres fra amplifikationsrøret og dermed kan komme ud i miljøet, i overensstemmelse med kravene til PCR-laboratorier (Metodologiske retningslinjer 1.3.1794-03, Metodologiske retningslinjer 1.3.1888-04), være fuldstændig isoleret fra de rum, der er angivet i de foregående afsnit. Bevægelse af personale, udstyr, materialer og genstande fra elektroforeseområdet til prøvebehandlingsområdet og det "rene" område, samt luftoverførsel gennem ventilationssystemet eller som følge af træk, skal udelukkes. Dette område er ikke påkrævet til fluorimetrisk detektion af PCR-produkter.
• Rummet til dokumentation og behandling af resultater er udstyret med computere og det nødvendige kontorudstyr. Dette rum kan indeholde udstyr, der sikrer detektion af PCR-produkter uden at åbne røret. - fluorescerende PCR-detektorer og termiske cyklere til realtids-PCR.

De sanitære og epidemiologiske krav til den primære behandling af sputum svarer til de mikrobiologiske standardkrav til arbejde med Mycobacterium tuberculosis.

[ 77 ], [ 78 ], [ 79 ], [ 80 ]

Komplet sæt laboratorieudstyr til PCR-diagnostik

Laboratoriekittet indeholder udstyr til følgende rum.

• Prøveforberedelsesrum, indeholder følgende udstyr: laminar flowhætte af beskyttelsesklasse II "SP-1.2": faststoftermostat med opvarmet låg til Eppendorf-reagensglas; mikrocentrifuge ved 13.000 o/min; centrifuge ("Vortex"); køleskab med et temperaturområde fra -20 ^° C til +10 ^° C; pipetter med variabelt volumen i "Proline"-serien; pumpe med en fældekolbe OM-1; pipettestativ; arbejdsstationsstativ 200x0,5 ml; arbejdsstationsstativ 50x1,5 ml; stativer til opbevaring af reagensglas 80x1,5 ml;
• Reaktionsblandingsforberedelsesrum: PCR-boks med beskyttelseskammer ("Laminar-C. 110 cm); centrifuge "Vortex"; pipetter med variabelt volumen i "Proline"-serien; pipettestativ; arbejdsstationsstativ 200x0,2 ml; stativer til opbevaring af reagensglas 80x1,5 ml; køleskab med et temperaturområde fra -20 ^° C til +10 ^° C;
• Elektroforeserum: vandret elektroforesekammer; strømkilde; transilluminator;
• DNA-forstærker eller nukleinsyreanalysator (realtids-PCR) med computer og software; kan placeres i ethvert tilgængeligt rum. Hvis der anvendes realtids-PCR-teknologi, er et elektroforeserum ikke nødvendigt.

[ 81 ], [ 82 ], [ 83 ], [ 84 ]

Ekstern kvalitetskontrol

For at sikre, at de opnår objektivt pålidelige resultater, skal laboratorierne deltage i et system til ekstern vurdering af kvaliteten af laboratorieforskningen.

Deltagerne i kvalitetskontrolsystemet modtager: 12 ampuller med frysetørrede suspensioner af bakterieceller, hvoraf to indeholder E. coli, 3 ampuller med tuberkulosemykobakterier (avirulent stamme) i en koncentration på 102 ^/ ml; 3 ampuller med celler af en lignende stamme i en koncentration på 104 ^/ ml; 2 ampuller hver med ikke-tuberkuløse mykobakterier M. avium-intracellulare og M. kansasii i en koncentration på 105 ^/ ml.

De tests, der sendes ud til ekstern kvalitetsvurdering, er fortestet i to uafhængige laboratorier med omfattende erfaring på dette område.

[ 85 ], [ 86 ]