Kunstige hjerteklapper

Moderne biologiske kunstige hjerteklapper, der er tilgængelige til klinisk brug, er, med undtagelse af pulmonal autograft, ikke-levedygtige strukturer, der mangler potentiale for vækst og vævsreparation. Dette pålægger betydelige begrænsninger for deres anvendelse, især hos børn, til korrektion af klappatologi. Vævsteknologi har udviklet sig i løbet af de sidste 15 år. Målet med denne videnskabelige retning er at skabe strukturer under kunstige forhold såsom kunstige hjerteklapper med en tromboseresistent overflade og levedygtigt interstitium.

[ 1 ], [ 2 ]

Hvordan udvikles kunstige hjerteklapper?

Det videnskabelige koncept for vævsteknologi er baseret på ideen om at populere og dyrke levende celler (fibroblaster, stamceller osv.) i et syntetisk eller naturligt absorberbart stillads (matrix), som er en tredimensionel ventilstruktur, samt brugen af signaler, der regulerer genekspression, organisering og produktivitet af transplanterede celler i perioden med dannelse af den ekstracellulære matrix.

Sådanne kunstige hjerteklapper integreres i patientens væv for den endelige restaurering og yderligere vedligeholdelse af deres struktur og funktion. I dette tilfælde dannes et nyt kollagen-elastin-rammeværk eller mere præcist en ekstracellulær matrix på den oprindelige matrix som følge af cellernes funktion (fibroblaster, myofibroblaster osv.). Som et resultat bør optimale kunstige hjerteklapper, der er skabt ved hjælp af vævsteknologi, være tæt på de oprindelige med hensyn til anatomisk struktur og funktion, og også have biomekanisk tilpasningsevne, evne til reparation og vækst.

Vævsteknologi udvikler kunstige hjerteklapper ved hjælp af forskellige kilder til celleindsamling. Således kan xenogene eller allogene celler anvendes, selvom førstnævnte er forbundet med risikoen for at overføre zoonoser til mennesker. Det er muligt at reducere antigenicitet og forhindre kroppens afstødningsreaktioner ved genetisk modifikation af allogene celler. Vævsteknologi kræver en pålidelig kilde til celler. En sådan kilde er autogene celler taget direkte fra patienten og producerer ikke immunreaktioner under reimplantation. Effektive kunstige hjerteklapper produceres på basis af autologe celler udtaget fra blodkar (arterier og vener). En metode baseret på brugen af fluorescensaktiveret cellesortering - FACS - er blevet udviklet for at opnå rene cellekulturer. En blandet cellepopulation udtaget fra et blodkar mærkes med en acetyleret lavdensitetslipoproteinmarkør, som selektivt absorberes på overfladen af endotelocytter. Endotelcellerne kan derefter let adskilles fra hovedparten af cellerne udtaget fra karrene, som vil være en blanding af glatte muskelceller, myofibroblaster og fibroblaster. Cellernes kilde, hvad enten det er arterie eller vene, vil påvirke egenskaberne af den endelige konstruktion. Kunstige hjerteklapper med en matrix podet med venøse celler er således bedre i kollagendannelse og mekanisk stabilitet end konstruktioner podet med arterielle celler. Valget af perifere vener synes at være en mere bekvem kilde til celleindsamling.

Myofibroblaster kan også høstes fra halspulsårer. Imidlertid har karafledte celler signifikant forskellige karakteristika fra naturlige interstitielle celler. Autologe navlestrengsceller kan bruges som en alternativ cellekilde.

Kunstige hjerteklapper baseret på stamceller

I de senere år er fremskridt inden for vævsteknologi blevet fremmet af stamcelleforskning. Brugen af røde knoglemarvsstamceller har sine fordele. Især gør enkelheden ved indsamling af biomateriale og in vitro-dyrkning med efterfølgende differentiering til forskellige typer mesenkymale celler det muligt at undgå brugen af intakte kar. Stamceller er pluripotente kilder til cellelinjer og har unikke immunologiske egenskaber, der bidrager til deres stabilitet under allogene forhold.

Humane røde knoglemarvsstamceller udvindes ved sternumpunktur eller iliac kampunktur. De isoleres fra 10-15 ml sternumaspirat, separeres fra andre celler og dyrkes. Når det nødvendige antal celler er nået (normalt inden for 21-28 dage), podes (koloniseres) de på matricer og dyrkes i et næringsmedium i en statisk position (i 7 dage i en befugtet inkubator ved 37 °C i nærvær af 5% CO2). Derefter stimuleres cellevæksten gennem det kopturale medium (biologiske stimuli) eller ved at skabe fysiologiske betingelser for vævsvækst under dets isometriske deformation i et reproduktionsapparat med en pulserende strømning - en bioreaktor (mekaniske stimuli). Fibroblaster er følsomme over for mekaniske stimuli, der fremmer deres vækst og funktionelle aktivitet. Den pulserende strømning forårsager en stigning i både radiale og cirkumferentielle deformationer, hvilket fører til orientering (forlængelse) af de populerede celler i retning af sådanne belastninger. Dette fører igen til dannelsen af orienterede fiberstrukturer i klapperne. En konstant strømning forårsager kun tangentielle belastninger på væggene. Den pulserende strømning har en gavnlig effekt på cellulær morfologi, proliferation og sammensætningen af den ekstracellulære matrix. Næringsmediets strømnings natur, fysisk-kemiske forhold (pH, pO2 og pCO2) i bioreaktoren påvirker også kollagenproduktionen betydeligt. Således øger laminær strømning og cykliske hvirvelstrømme kollagenproduktionen, hvilket fører til forbedrede mekaniske egenskaber.

En anden tilgang til dyrkning af vævsstrukturer er at skabe embryonale forhold i en bioreaktor i stedet for at simulere fysiologiske forhold i menneskekroppen. Vævsbioklapper dyrket på basis af stamceller har mobile og fleksible klapper, der er funktionelt i stand til at fungere under påvirkning af højt tryk og en strømning, der overstiger det fysiologiske niveau. Histologiske og histokemiske undersøgelser af klapperne i disse strukturer viste tilstedeværelsen af aktive processer til matrixbiodestruktion og dens erstatning med levedygtigt væv. Vævet er organiseret i henhold til lagtypen med karakteristika for ekstracellulære matrixproteiner svarende til dem i nativt væv, tilstedeværelsen af kollagen type I og III og glycosaminoglycaner. Den typiske trelagsstruktur af klapperne - ventrikulære, svampede og fibrøse lag - blev dog ikke opnået. ASMA-positive celler, der udtrykker vimentin, fundet i alle fragmenter, havde karakteristika svarende til myofibroblasters. Elektronmikroskopi afslørede cellulære elementer med træk, der er karakteristiske for levedygtige, sekretoriske aktive myofibroblaster (actin/myosinfilamenter, kollagentråde, elastin) og endotelceller på vævsoverfladen.

Kollagen type I, III, ASMA og vimentin blev påvist på vævsfligene. De mekaniske egenskaber af vævsfligenes og de native strukturers flige var sammenlignelige. Kunstige hjerteklapper i væv viste fremragende ydeevne over 20 uger og lignede naturlige anatomiske strukturer i deres mikrostruktur, biokemiske profil og proteinmatrixdannelse.

Alle kunstige hjerteklapper fremstillet ved vævsteknologi blev implanteret i dyr i pulmonal position, da deres mekaniske egenskaber ikke svarer til belastningerne i aortapositionen. De vævsklapper, der er eksplanteret fra dyr, har en struktur, der ligner de naturlige klapper, hvilket indikerer deres videre udvikling og omstrukturering in vivo. Hvorvidt processen med vævsomstrukturering og modning vil fortsætte under fysiologiske forhold efter implantation af de kunstige hjerteklapper, som det blev observeret i dyreforsøg, vil blive vist ved yderligere undersøgelser.

Ideelle kunstige hjerteklapper bør have en porøsitet på mindst 90%, da dette er afgørende for cellevækst, næringsstoftilførsel og fjernelse af cellulære metaboliske produkter. Ud over biokompatibilitet og bionedbrydelighed bør kunstige hjerteklapper have en kemisk gunstig overflade til cellepodning og matche de mekaniske egenskaber af naturligt væv. Niveauet af matrixbiologisk nedbrydning bør være kontrollerbart og proportionalt med niveauet af ny vævsdannelse for at sikre mekanisk stabilitet over tid.

I øjeblikket udvikles syntetiske og biologiske matricer. De mest almindelige biologiske materialer til fremstilling af matricer er donoranatomiske strukturer, kollagen og fibrin. Kunstige hjerteklapper af polymerer designes til at bionedbrydes efter implantation, når de implanterede celler begynder at producere og organisere deres eget ekstracellulære matrixnetværk. Dannelsen af nyt matrixvæv kan reguleres eller stimuleres af vækstfaktorer, cytokiner eller hormoner.

[ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ]

Kunstige donorhjerteklapper

Kunstige donorhjerteklapper, der er udtaget fra mennesker eller dyr og tømt for cellulære antigener ved decellularisering for at reducere deres immunogenicitet, kan anvendes som matricer. De konserverede proteiner fra den ekstracellulære matrix er grundlaget for efterfølgende adhæsion af podede celler. Følgende metoder til fjernelse af cellulære elementer (acellularisering) findes: frysning, behandling med trypsin/EDTA, detergenter - natriumdodecylsulfat, natriumdeoxycolat, Triton X-100, MEGA 10, TnBR CHAPS, Tween 20, samt flertrins enzymatiske behandlingsmetoder. I dette tilfælde fjernes cellemembraner, nukleinsyrer, lipider, cytoplasmatiske strukturer og opløselige matrixmolekyler, mens kollagen og elastin bevares. Der er dog endnu ikke fundet en ideel metode. Kun natriumdodecylsulfat (0,03-1%) eller natriumdeoxycolat (0,5-2%) resulterede i fuldstændig cellefjernelse efter 24 timers behandling.

Histologisk undersøgelse af fjernede decellulariserede bioklapper (allograft og xenograft) i et dyreforsøg (hund og gris) viste delvis endotelisering og indvækst af recipient-myofibroblaster i basen uden tegn på forkalkning. Moderat inflammatorisk infiltration blev observeret. Imidlertid udviklede der sig tidlig svigt under kliniske forsøg med den decellulariserede SynerGraft™-klap. En udtalt inflammatorisk reaktion blev påvist i bioprotese-matrixen, som i starten var uspecifik og ledsaget af en lymfocytisk reaktion. Dysfunktion og degeneration af bioprotesen udviklede sig i løbet af et år. Der blev ikke observeret nogen cellekolonisering af matrixen, men forkalkning af klapperne og præimplantationscellerester blev påvist.

Cellefrie matricer podet med endotelceller og dyrket in vitro og in vivo dannede et sammenhængende lag på overfladen af hjerteklapperne, og podede interstitielle celler med den native struktur demonstrerede deres evne til at differentiere. Det var imidlertid ikke muligt at opnå det nødvendige fysiologiske niveau af cellekolonisering på matricen under dynamiske forhold i bioreaktoren, og de implanterede kunstige hjerteklapper blev ledsaget af en forholdsvis hurtig (tre måneder) fortykkelse på grund af accelereret celleproliferation og dannelse af en ekstracellulær matrix. Således har brugen af donorcellefrie matricer til deres kolonisering med celler på dette stadie en række uløste problemer, herunder immunologiske og infektiøse; arbejdet med decellulariserede bioproteser fortsætter.

Det skal bemærkes, at kollagen også er et af de potentielle biologiske materialer til produktion af matricer, der er bionedbrydelige. Det kan anvendes i form af skum, gel eller plader, svampe og som en fiberbaseret blank. Brugen af kollagen er dog forbundet med en række teknologiske vanskeligheder. Især er det vanskeligt at få fra en patient. Derfor er de fleste kollagenmatricer i øjeblikket af animalsk oprindelse. Langsom bionedbrydning af animalsk kollagen kan medføre en øget risiko for infektion med zoonoser og forårsage immunologiske og inflammatoriske reaktioner.

Fibrin er et andet biologisk materiale med kontrolleret bionedbrydningsevne. Da fibringeler kan fremstilles ud fra patientens blod til efterfølgende produktion af en autolog matrix, vil implantation af en sådan struktur ikke forårsage toksisk nedbrydning og inflammatorisk reaktion. Fibrin har imidlertid ulemper som diffusion og udvaskning til miljøet samt lave mekaniske egenskaber.

[ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ], [ 11 ]

Kunstige hjerteklapper lavet af syntetiske materialer

Kunstige hjerteklapper er også lavet af syntetiske materialer. Adskillige forsøg på at fremstille klapmatricer var baseret på brugen af polyglactin, polyglykolsyre (PGA), polymælkesyre (PLA), PGA- og PLA-copolymer (PLGA) og polyhydroxyalkanoater (PHA). Meget porøst syntetisk materiale kan opnås fra flettet eller ikke-flettet fiber og ved hjælp af saltudvaskningsteknologi. Et lovende kompositmateriale (PGA/P4HB) til fremstilling af matricer opnås fra ikke-flettede løkker af polyglykolsyre (PGA) overtrukket med poly-4-hydroxybutyrat (P4HB). Kunstige hjerteklapper fremstillet af dette materiale steriliseres med ethylenoxid. Den betydelige indledende stivhed og tykkelse af løkkerne i disse polymerer, deres hurtige og ukontrollerede nedbrydning, ledsaget af frigivelse af sure cytotoksiske produkter, kræver dog yderligere forskning og en søgning efter andre materialer.

Brugen af autologe myofibroblastvævskulturplader dyrket på et stillads for at danne støttematricer ved at stimulere produktionen af disse celler har gjort det muligt at opnå klapprøver med aktive levedygtige celler omgivet af en ekstracellulær matrix. De mekaniske egenskaber af vævene i disse klapper er dog stadig utilstrækkelige til deres implantation.

Det nødvendige niveau af proliferation og vævsregenerering af den klappe, der skabes, kan muligvis ikke opnås ved at kombinere celler og matrix alene. Cellegenekspression og vævsdannelse kan reguleres eller stimuleres ved at tilsætte vækstfaktorer, cytokiner eller hormoner, mitogene faktorer eller adhæsionsfaktorer til matricer og scaffolds. Muligheden for at introducere disse regulatorer i matrixbiomaterialer undersøges. Samlet set er der en betydelig mangel på forskning i reguleringen af vævsklappdannelse ved hjælp af biokemiske stimuli.

Den acellulære xenogene lungebioprotese fra svin, Matrix P, består af decellulariseret væv, der er behandlet ved en særlig patenteret procedure fra AutoTissue GmbH, herunder behandling med antibiotika, natriumdeoxycholat og alkohol. Denne behandlingsmetode, der er godkendt af Den Internationale Standardiseringsorganisation, eliminerer alle levende celler og postcellulære strukturer (fibroblaster, endotelceller, bakterier, vira, svampe, mycoplasma), bevarer arkitekturen af den ekstracellulære matrix, reducerer niveauet af DNA og RNA i vævet til et minimum, hvilket reducerer sandsynligheden for overførsel af den porcine endogene retrovirus (PERV) til mennesker til nul. Matrix P bioprotesen består udelukkende af kollagen og elastin med bevaret strukturel integration.

I forsøg med får blev der registreret minimal reaktion fra det omgivende væv 11 måneder efter implantation af Matrix P-bioprotesen med gode overlevelsesrater, hvilket var særligt tydeligt i den skinnende indre overflade af dens endokardium. Inflammatoriske reaktioner, fortykkelse og forkortelse af klapbladene var stort set fraværende. Lave vævskalciumniveauer i Matrix P-bioprotesen blev også registreret, hvor forskellen var statistisk signifikant sammenlignet med dem, der blev behandlet med glutaraldehyd.

Matrix P kunstige hjerteklapper tilpasser sig den enkelte patients tilstand inden for få måneder efter implantationen. Undersøgelsen ved afslutningen af kontrolperioden afslørede en intakt ekstracellulær matrix og konfluent endotel. Matrix R xenograftet, der blev implanteret i 50 patienter med medfødte defekter under Ross-proceduren mellem 2002 og 2004, udviste overlegen ydeevne og lavere transvalvulære trykgradienter sammenlignet med kryopræserverede og decellulariserede SynerGraftMT-allografter og glutaraldehydbehandlede stilladsløse bioproteser. Matrix P kunstige hjerteklapper er beregnet til udskiftning af pulmonalklapper under rekonstruktion af den højre ventrikeludstrømningskanal i kirurgi for medfødte og erhvervede defekter og under udskiftning af pulmonalklapper under Ross-proceduren. De fås i 4 størrelser (efter indvendig diameter): til nyfødte (15-17 mm), til børn (18-21 mm), mellemstore (22-24 mm) og voksne (25-28 mm).

Fremskridt i udviklingen af vævsmanipulerede klapper vil afhænge af fremskridt inden for klapcellebiologi (herunder spørgsmål om genekspression og regulering), studier af embryogen og aldersrelateret klapudvikling (herunder angiogene og neurogene faktorer), præcis viden om biomekanikken i hver klap, identifikation af passende celler til podning og udvikling af optimale matricer. Yderligere udvikling af mere avancerede vævsklapper vil kræve en grundig forståelse af forholdet mellem de mekaniske og strukturelle egenskaber ved native klapper og de stimuli (biologiske og mekaniske) til at genskabe disse egenskaber in vitro.

[ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ]