Begrænsninger, farer og komplikationer ved celletransplantation

Regenerativ plastisk medicin er baseret på den kliniske implementering af de toti- og pluripotente egenskaber hos embryonale og progenitorstamceller, som muliggør in vitro og in vivo oprettelse af specificerede cellelinjer, der genopbygger beskadigede væv og organer hos en syg person.

Den reelle mulighed for at bruge embryonale stamceller og stamceller fra definitive væv (de såkaldte "voksne" stamceller) fra mennesker til terapeutiske formål er ikke længere i tvivl. Eksperter fra de nationale og medicinske akademier i USA (Stem cells and the future regenerative medicine National Academy Press) og National Institute of Health i USA (Stem cells and the future research directions. Nat. Inst, of Health USA) anbefaler dog en mere detaljeret undersøgelse af stamcellers egenskaber i eksperimenter på tilstrækkelige biologiske modeller og en objektiv vurdering af alle konsekvenserne af transplantation, og først derefter brug af stamceller i klinikken.

Det er blevet fastslået, at stamceller er en del af vævsderivaterne fra alle tre kimlag. Stamceller findes i nethinden, hornhinden, hudens epidermis, knoglemarven og perifert blod, i blodkar, tandpulpa, nyrer, gastrointestinalt epitel, bugspytkirtel og lever. Ved hjælp af moderne metoder er det blevet bevist, at neurale stamceller er lokaliseret i hjernen og rygmarven hos en voksen. Disse sensationelle data tiltrak særlig opmærksomhed fra forskere og medierne, da neuroner i hjernen tjente som et klassisk eksempel på en statisk cellepopulation, der ikke genoprettes. Både i de tidlige og sene perioder af ontogenesen dannes neuroner, astrocytter og oligodendrocytter i hjernen hos dyr og mennesker på grund af neurale stamceller (Stem cells: scientific progress and future research directions. Nat. Inst, of Health USA).

Under normale forhold manifesterer plasticiteten af stamceller fra definitive væv sig dog ikke. For at realisere det plastiske potentiale af stamceller fra definitive væv skal de isoleres og derefter dyrkes i medier med cytokiner (LIF, EGF, FGF). Desuden indpodes stamcellederivater kun med succes, når de transplanteres ind i kroppen af et dyr med et svækket immunforsvar (γ-bestråling, cytostatika, busulfan osv.). Til dato er der ikke opnået overbevisende beviser for implementering af stamcelleplasticitet hos dyr, der ikke har været udsat for stråling eller andre effekter, der forårsager dyb immunsuppression.

Under sådanne forhold manifesterer ESC'ers farlige potentiale sig først og fremmest under deres transplantation til ektopiske områder - under subkutan injektion af ESC'er i immundefekte mus dannes teratocarcinomer på injektionsstedet. Derudover er hyppigheden af kromosomafvigelser højere under udviklingen af det menneskelige embryo end ved embryogenese hos dyr. I blastocyststadiet består kun 20-25% af menneskelige embryoner af celler med en normal karyotype, og langt de fleste tidlige menneskelige embryoner opnået efter in vitro-fertilisering udviser kaotisk kromosomal mosaicisme og støder meget ofte på numeriske og strukturelle afvigelser.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ]

Stamcellers gavnlige virkninger

Foreløbige resultater af kliniske forsøg bekræfter stamcellers gavnlige effekt på patienten, men der er stadig ingen information om de langsigtede virkninger af celletransplantation. Litteraturen var i starten domineret af rapporter om positive resultater af transplantation af embryonale hjernefragmenter ved Parkinsons sygdom, men derefter begyndte data at dukke op, der benægtede den effektive terapeutiske effekt af embryonalt eller føtalt nervevæv transplanteret ind i patienters hjerne.

I midten af det 20. århundrede blev genoprettelsen af hæmatopoiese hos dødeligt bestrålede dyr efter intravenøs transfusion af knoglemarvsceller først opdaget, og i 1969 udførte den amerikanske forsker D. Thomas den første knoglemarvstransplantation hos mennesker. Manglende viden om mekanismerne for immunologisk inkompatibilitet mellem donor- og modtagerknoglemarvsceller førte på det tidspunkt til høj dødelighed på grund af hyppig transplantationssvigt og udvikling af graft-versus-host-reaktion. Opdagelsen af det store histokompatibilitetskompleks, som inkluderer humane leukocytantigener (HbA), og forbedringen af deres typningsmetoder gjorde det muligt at øge overlevelsen efter knoglemarvstransplantation betydeligt, hvilket førte til den udbredte anvendelse af denne behandlingsmetode i onkohæmatologi. Et årti senere blev de første transplantationer af hæmatopoietiske stamceller (HSC'er) opnået fra perifert blod ved hjælp af leukaferese udført. I 1988 blev navlestrengsblod for første gang brugt som kilde til HSC'er i Frankrig til behandling af et barn med Fanconi-anæmi, og siden slutningen af 2000 er der i pressen blevet rapporteret om HSC'ers evne til at differentiere sig til celler af forskellige vævstyper, hvilket potentielt udvider omfanget af deres kliniske anvendelse. Det viste sig imidlertid, at transplantationsmaterialet sammen med HSC'er indeholder et betydeligt antal ikke-hæmatopoietiske celleurenheder af forskellig art og egenskaber. I denne forbindelse udvikles metoder til oprensning af transplantatet og kriterier for vurdering af dets cellulære renhed. Især anvendes positiv immunselektion af CD34+ celler, hvilket muliggør isolering af HSC'er ved hjælp af monoklonale antistoffer.

[ 8 ], [ 9 ], [ 10 ], [ 11 ], [ 12 ]

Komplikationer ved stamcellebehandling

Komplikationer ved knoglemarvstransplantation er oftest hæmatologiske og forbundet med en lang periode med iatrogen pancytopeni. Infektiøse komplikationer, anæmi og blødninger udvikles oftest. I denne henseende er det yderst vigtigt at vælge den optimale metode til knoglemarvsindsamling, -behandling og -opbevaring for maksimal bevarelse af stamceller, hvilket vil sikre hurtig og stabil genoprettelse af hæmatopoiesen. Ved karakterisering af en transplantation vurderes følgende parametre i øjeblikket almindeligvis: antallet af mononukleære og/eller nukleerede celler, kolonidannende enheder og indholdet af CD34-positive celler. Desværre giver disse indikatorer kun en indirekte vurdering af den reelle hæmatopoietiske kapacitet af transplantatets stamcellepopulation. I dag findes der ingen absolut nøjagtige parametre til at bestemme et transplantats tilstrækkelighed til langsigtet genoprettelse af hæmatopoiesen hos patienter, selv med autolog knoglemarvstransplantation. Udviklingen af generelle kriterier er ekstremt vanskelig på grund af manglen på strenge standarder for behandling, kryopræservering og testning af transplantatet. Derudover er det nødvendigt at tage højde for alle de forskellige faktorer, der påvirker parametrene for vellykket genoprettelse af hæmatopoiesen hos hver enkelt patient. Ved autolog knoglemarvstransplantation er de vigtigste antallet af tidligere kemoterapikure, karakteristikaene for konditioneringsregimet, sygdomsperioden, hvor knoglemarven blev indsamlet, og ordningerne for anvendelse af kolonistimulerende faktorer i perioden efter transplantationen. Derudover bør man ikke glemme, at kemoterapi forud for transplantationsindsamlingen kan have en negativ effekt på knoglemarvsstamceller.

Forekomsten af alvorlige toksiske komplikationer stiger betydeligt under allogen knoglemarvstransplantation. I denne forbindelse er statistiske data om allogen knoglemarvstransplantation ved thalassæmi af interesse. Rapporterne fra European Bone Marrow Transplantation Group har registreret omkring 800 knoglemarvstransplantationer til patienter med thalassæmi major. Allogen transplantation ved thalassæmi udføres i langt de fleste tilfælde fra HLA-identiske søskende, hvilket er forbundet med alvorlige komplikationer og høj dødelighed under transplantation af stamcellemateriale fra delvist kompatible beslægtede eller kompatible ubeslægtede donorer. For at minimere risikoen for fatale infektiøse komplikationer placeres patienterne i isolerede aseptiske kasser med laminar luftstrøm og modtager en lav- eller abakteriel diæt. Til bakteriel dekontaminering af tarmen ordineres ikke-resorberbare former for antibiotika og svampedræbende lægemidler per os. Til profylakse administreres amphotericin B intravenøst. Forebyggelse af systemiske infektioner forstærkes med amikacin og ceftazidim, som ordineres dagen før transplantation, og behandlingen fortsætter indtil patienten udskrives. Alle blodprodukter bestråles med en dosis på 30 Gy før transfusion. Parenteral ernæring under transplantation er en nødvendig betingelse og begynder umiddelbart efter begrænsning af fødeindtaget på en naturlig måde.

En række komplikationer er forbundet med den høje toksicitet af immunsuppressive lægemidler, som ofte forårsager kvalme, opkastning og mucositis, nyreskade og interstitiel lungebetændelse. En af de mest alvorlige komplikationer ved kemoterapi er veno-okklusiv leversygdom, der fører til død i den tidlige periode efter transplantation. Risikofaktorer for trombose i venerne i leverens portalsystem inkluderer patienternes alder, tilstedeværelsen af hepatitis og leverfibrose samt immunsuppressiv behandling efter knoglemarvstransplantation. Veno-okklusiv sygdom er især farlig ved thalassæmi, som ledsages af leverhæmosiderose, hepatitis og fibrose - hyppige ledsagere af transfusionsbehandling. Trombose i venerne i leverens portalsystem udvikler sig 1-2 uger efter transplantation og er karakteriseret ved en hurtig stigning i indholdet af bilirubin og transaminaseaktivitet i blodet, progression af hepatomegali, ascites, encefalopati og smerter i den øvre del af maven. Histologisk afslører obduktionsmateriale endotelskader, subendotelblødninger, skader på centrilobulære hepatocytter, trombotisk obstruktion af venoler og centrale levervener. Tilfælde af fatalt hjertestop forbundet med cytostatikas toksiske virkninger er blevet beskrevet hos patienter med thalassæmi.

I perioden før transplantation forårsager cyclophosphamid og busulfan ofte toksisk-hæmoragisk blærebetændelse med patologiske forandringer i uroepitelceller. Brugen af cyclosporin A i knoglemarvstransplantation ledsages ofte af nefro- og neurotoksicitet, hypertensionsyndrom, væskeretention i kroppen og hepatocytcytolyse. Seksuel og reproduktiv dysfunktion observeres oftere hos kvinder. Hos små børn påvirkes pubertetsudviklingen normalt ikke efter transplantation, men hos ældre børn kan patologien i udviklingen af den seksuelle sfære være meget alvorlig - op til sterilitet. Komplikationer, der er direkte relateret til selve transplantationen, omfatter afstødning af allogene knoglemarvsceller, ABO-inkompatibilitet, akutte og kroniske former for graft-versus-host-sygdom.

Hos patienter med ABO-inkompatibel knoglemarvstransplantation produceres vært-versus-ABO-donorisoagglutininer i 330-605 dage efter transplantationen, hvilket kan føre til forlænget hæmolyse og dramatisk øge behovet for blodtransfusioner. Denne komplikation forebygges ved kun at transfundere type 0-røde blodlegemer. Efter transplantation oplever nogle patienter autoimmun neutropeni, trombocytopeni eller pancytopeni, hvilket kræver splenektomi for at korrigere.

Hos 35-40% af patienterne udvikles akut graft-versus-host-sygdom inden for 100 dage efter allogen HLA-identisk knoglemarvstransplantation. Graden af hud-, lever- og tarmpåvirkning varierer fra udslæt, diarré og moderat hyperbilirubinæmi til hudafskalning, tarmobstruktion og akut leversvigt. Hos patienter med thalassæmi er forekomsten af grad I akut graft-versus-host-sygdom efter knoglemarvstransplantation 75%, og grad II og højere er 11-53%. Kronisk graft-versus-host-sygdom som et systemisk multiorgansyndrom udvikles normalt inden for 100-500 dage efter allogen knoglemarvstransplantation hos 30-50% af patienterne. Hud, mundhule, lever, øjne, spiserør og øvre luftveje er påvirket. Der skelnes mellem en begrænset form for kronisk graft-versus-host-sygdom, hvor hud og/eller lever er påvirket, og en udbredt form, hvor generaliserede hudlæsioner kombineres med kronisk aggressiv hepatitis, læsioner i øjne, spytkirtler eller andre organer. Døden skyldes ofte infektiøse komplikationer som følge af alvorlig immundefekt. Ved thalassæmi forekommer en mild form for kronisk graft-versus-host-sygdom hos 12%, en moderat form hos 3% og en alvorlig form hos 0,9% af modtagerne af allogen HLA-kompatibel knoglemarv. En alvorlig komplikation ved knoglemarvstransplantation er graftafstødning, som udvikler sig 50-130 dage efter operationen. Hyppigheden af afstødning afhænger af konditioneringsregimet. Især hos patienter med thalassæmi, der kun modtog methotrexat i forberedelsesperioden, blev der observeret afstødning af knoglemarvstransplantationen i 26% af tilfældene, med en kombination af methotrexat og cyclosporin A - i 9% af tilfældene, og med administration af kun cyclosporin A - i 8% af tilfældene (Gaziev et al., 1995).

Infektiøse komplikationer efter knoglemarvstransplantation er forårsaget af virus, bakterier og svampe. Deres udvikling er forbundet med dyb neutropeni induceret af kemoterapimedicin i konditioneringsperioden, beskadigelse af slimhinder forårsaget af cytostatika og graft-versus-host-reaktionen. Afhængigt af udviklingstidspunktet skelnes der mellem tre faser af infektiøse komplikationer. I den første fase (udvikles i den første måned efter transplantation) dominerer beskadigelse af slimhinder og neutropeni, ofte ledsaget af virusinfektioner (herpes, Epstein-Barr-virus, cytomegalovirus, Varicella zoster), samt infektioner forårsaget af grampositive og gramnegative bakterier, Candida-svampe, aspergilli. I den tidlige posttransplantationsperiode (den anden og tredje måned efter transplantation) er den mest alvorlige infektion cytomegalovirus, som ofte fører til patienternes død i den anden fase af infektiøse komplikationer. Ved thalassæmi udvikles cytomegalovirusinfektion efter knoglemarvstransplantation hos 1,7-4,4% af modtagerne. Den tredje fase observeres i den sene periode efter transplantationen (tre måneder efter operationen) og er karakteriseret ved svær kombineret immundefekt. Infektioner forårsaget af Varicella zoster, streptokokker, Pneumocystis carinii, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae og hepatotrope vira er almindelige i denne periode. Ved thalassæmi er dødeligheden hos patienter efter knoglemarvstransplantation forbundet med bakteriel og svampesepsis, idiopatisk interstitiel og cytomegalovirus-pneumoni, akut respiratorisk distresssyndrom, akut hjertesvigt, hjertetamponade, cerebral blødning, veno-okklusiv leversygdom og akut graft-versus-host-sygdom.

Der er i øjeblikket opnået visse succeser med udviklingen af metoder til isolering af rene populationer af hæmatopoietiske stamceller fra knoglemarv. Teknikken til at udvinde føtalt blod fra navlestrengen er blevet forbedret, og der er udviklet metoder til isolering af hæmatopoietiske celler fra navlestrengsblod. Der er rapporter i den videnskabelige presse om, at hæmatopoietiske stamceller er i stand til at formere sig, når de dyrkes i medier med cytokiner. Når der anvendes specialdesignede bioreaktorer til ekspansion af hæmatopoietiske stamceller, øges biomassen af hæmatopoietiske stamceller isoleret fra knoglemarv, perifert eller navlestrengsblod betydeligt. Muligheden for at ekspandere hæmatopoietiske stamceller er et vigtigt skridt i retning af den kliniske udvikling af celletransplantation.

Før in vitro-formering af hæmatopoietiske stamceller er det imidlertid nødvendigt at isolere en homogen population af hæmatopoietiske stamceller. Dette opnås normalt ved hjælp af markører, der muliggør selektiv mærkning af hæmatopoietiske stamceller med monoklonale antistoffer kovalent bundet til et fluorescerende eller magnetisk mærke og deres isolering ved hjælp af en passende cellesorterer. Samtidig er spørgsmålet om fænotypiske egenskaber ved hæmatopoietiske stamceller ikke endeligt løst. A. Petrenko, V. Grishchenko (2003) betragter celler med CD34-, AC133- og Thyl-antigener på deres overflade og ingen CD38-, HLA-DR- eller andre differentieringsmarkører (celler med CD34+Liir-fænotypen) som kandidater til hæmatopoietiske stamceller. Lineage (Lin)-markører inkluderer glycophorin A (GPA), CD3, CD4, CD8, CD10, CD14, CD16, CD19, CD20 (Muench, 2001). Celler med CD34+CD45RalüW CD71low-fænotypen, såvel som CD34+Thyl+CD38low/c-kit/low-fænotypen, anses for at være lovende til transplantation.

Spørgsmålet om antallet af hæmatopoietiske stamceller, der er tilstrækkeligt til effektiv transplantation, er fortsat problematisk. I øjeblikket er kilderne til hæmatopoietiske stamceller knoglemarv, perifert blod og navlestrengsblod samt embryonal lever. Ekspansion af hæmatopoietiske stamceller opnås ved at dyrke dem i nærvær af endotelceller og hæmatopoietiske vækstfaktorer. I forskellige protokoller anvendes myeloproteiner, SCF, erythropoietin, insulinlignende vækstfaktorer, kortikosteroider og østrogener til at inducere HSC-proliferation. Når man bruger kombinationer af cytokiner in vitro, er det muligt at opnå en signifikant stigning i HSC-puljen med en top i deres output ved udgangen af den anden uge af dyrkningen.

Traditionelt anvendes transplantation af hæmatopoietiske stamceller fra navlestrengsblod primært til behandling af hæmoblastoser. Den minimale dosis af hæmatopoietiske celler, der kræves til vellykket transplantation af navlestrengsblod, er dog 3,7 x 107 ^kerneholdige celler pr. 1 kg recipientens kropsvægt. Brug af et mindre antal hæmatopoietiske stamceller fra navlestrengsblod øger risikoen for transplantatsvigt og tilbagefald af sygdommen betydeligt. Derfor anvendes transplantation af hæmatopoietiske stamceller fra navlestrengsblod primært til behandling af hæmoblastoser hos børn.

Desværre findes der stadig ingen standarder for indkøb eller standardiserede protokoller for klinisk brug af hæmatopoietiske celler fra navlestrengsblod. Derfor er stamceller fra navlestrengsblod i sig selv ikke en juridisk anerkendt kilde til hæmatopoietiske celler til transplantation. Derudover findes der ingen etiske eller juridiske normer for navlestrengsblodbankers aktiviteter og organisering, som findes i udlandet. I mellemtiden skal alle navlestrengsblodprøver overvåges nøje for at sikre sikker transplantation. Før blodopsamling fra en gravid kvinde skal hendes samtykke indhentes. Hver gravid kvinde skal undersøges for HBsAg-bærerskab, tilstedeværelsen af antistoffer mod hepatitis C, HIV og syfilisvirus. Hver navlestrengsblodprøve skal testes som standard for antallet af kerneholdige celler, CD34+ og kolonidannende kapacitet. Derudover udføres HbA1c-typning, bestemmelse af blodgruppen ved ABO og dens tilhørsforhold ved Rh-faktoren. De nødvendige testprocedurer er bakteriologisk dyrkning for sterilitet, serologisk test for HIV-1- og HIV-2-infektioner, HBsAg, viral hepatitis C, cytomegalovirusinfektion, HTLY-1 og HTLY-II, syfilis og toxoplasmose. Derudover udføres polymerasekædereaktion for at detektere cytomegalovirus- og HIV-infektioner. Det synes tilrådeligt at supplere testprotokollerne med en analyse af navlestrengsblod GSC for at detektere sådanne genetiske sygdomme som α-thalassæmi, seglcelleanæmi, adenosindeaminase-mangel, Brutons agammaglobulinæmi, Hurlers og Ponters sygdomme.

Den næste fase i forberedelsen til transplantation er spørgsmålet om at bevare de hæmatopoietiske stamceller. De farligste procedurer for cellernes levedygtighed under deres fremstilling er frysning og optøning. Ved frysning af hæmatopoietiske celler kan en betydelig del af dem blive ødelagt på grund af krystaldannelse. Specielle stoffer - kryoprotektorer - anvendes til at reducere procentdelen af celledød. Oftest anvendes DMSO som kryoprotektor i en slutkoncentration på 10%. DMSO i en sådan koncentration er dog karakteriseret ved en direkte cytotoksisk effekt, som manifesterer sig selv under forhold med minimal eksponering. Et fald i den cytotoksiske effekt opnås ved streng opretholdelse af nultemperatur i eksponeringstilstanden samt overholdelse af reglerne for behandling af materialet under og efter optøning (hastighed af alle manipulationer, brug af flere vaskeprocedurer). DMSO-koncentrationer på mindre end 5% bør ikke anvendes, da dette forårsager massiv død af hæmatopoietiske celler i fryseperioden.

Tilstedeværelsen af erytrocyturenheder i suspensionsblandingen af hæmatopoietiske stamceller skaber en risiko for at udvikle en inkompatibilitetsreaktion for erytrocytantigener. Samtidig øges tabet af hæmatopoietiske celler betydeligt, når erytrocytter fjernes. I denne henseende er en metode til ufraktioneret isolering af hæmatopoietiske stamceller blevet foreslået. I dette tilfælde anvendes en 10% DMSO-opløsning og konstant afkøling (GS/min) til -80°C for at beskytte kerneholdige celler mod de skadelige virkninger af lave temperaturer, hvorefter cellesuspensionen fryses i flydende nitrogen. Det antages, at denne kryopræserveringsmetode resulterer i delvis lysis af erytrocytter, så blodprøver ikke kræver fraktionering. Før transplantation optøs cellesuspensionen, vaskes fra frit hæmoglobin og DMSO i en opløsning af humant albumin eller i blodserum. Bevarelsen af hæmatopoietiske forstadier ved hjælp af denne metode er ganske vist højere end efter fraktionering af navlestrengsblod, men risikoen for transfusionskomplikationer på grund af transfusion af ABO-inkompatible erytrocytter forbliver.

Etablering af et banksystem til opbevaring af HLA-testede og typede HSC-prøver kunne løse ovenstående problemer. Dette kræver dog udvikling af etiske og juridiske normer, som i øjeblikket kun diskuteres. Før der oprettes et banknetværk, er det nødvendigt at vedtage en række regler og dokumenter om standardisering af procedurer for indsamling, fraktionering, testning og typening samt kryopræservering af HSC. En obligatorisk betingelse for effektiv drift af HSC-banker er organiseringen af en computerbase til interaktion med registrene fra World Marrow Donor Association (WMDA) og National Marrow Donor Program of the United States (NMDP).

Derudover er det nødvendigt at optimere og standardisere metoderne til in vitro HSC-ekspansion, primært hæmatopoietiske celler fra navlestrengsblod. Ekspansion af HSC fra navlestrengsblod er nødvendig for at øge antallet af potentielle recipienter, der er kompatible med HLA-systemet. På grund af de små mængder navlestrengsblod er antallet af HSC'er indeholdt i det normalt ikke i stand til at sikre knoglemarvsrepopulation hos voksne patienter. Samtidig er det nødvendigt at have adgang til et tilstrækkeligt antal typede HSC-prøver (fra 10.000 til 1.500.000 pr. recipient) for at udføre uafhængige transplantationer.

Transplantation af hæmatopoietiske stamceller eliminerer ikke de komplikationer, der følger med knoglemarvstransplantation. Analyser viser, at der ved transplantation af navlestrengsblodstamceller udvikles alvorlige former for akut graft-versus-host-sygdom hos 23% af modtagerne og kroniske former hos 25% af modtagerne. Hos onkohæmatologiske patienter observeres tilbagefald af akut leukæmi i løbet af det første år efter transplantation af navlestrengsblodstamceller i 26% af tilfældene.

I de senere år har metoder til transplantation af perifere hæmatopoietiske stamceller været under intensiv udvikling. Indholdet af HSC i perifert blod er så lavt (1 HSC pr. 100.000 blodceller), at deres isolering uden særlig forberedelse ikke giver mening. Derfor får donoren først et lægemiddelstimulerende forløb, der frigiver hæmatopoietiske celler fra knoglemarven til blodet. Til dette formål anvendes så langt fra harmløse lægemidler som cyclophosphamid og granulocytkolonistimulerende faktor. Men selv efter proceduren med mobilisering af HSC i det perifere blod overstiger indholdet af CD34+ celler i det ikke 1,6%.

Til mobilisering af hæmatopoietiske stamceller i klinikken anvendes oftest S-SEC, som er karakteriseret ved relativt god tolerance, med undtagelse af den næsten naturlige forekomst af knoglesmerter. Det skal bemærkes, at brugen af moderne blodseparatorer muliggør effektiv isolering af hæmatopoietiske stamceller. Under normale hæmatopoieseforhold skal der dog udføres mindst 6 procedurer for at opnå et tilstrækkeligt antal hæmatopoietiske stamceller, der i repopulationskapacitet kan sammenlignes med en knoglemarvssuspension. Hver sådan procedure kræver, at 10-12 liter blod behandles på separatoren, hvilket kan forårsage trombocytopeni og leukopeni. Separationsproceduren involverer introduktion af et antikoagulant (natriumcitrat) til donoren, hvilket dog ikke udelukker kontaktaktivering af blodplader under ekstrakorporal centrifugering. Disse faktorer skaber betingelser for udvikling af infektiøse og hæmoragiske komplikationer. En anden ulempe ved metoden er den betydelige variation i mobiliseringsresponset, hvilket kræver overvågning af indholdet af HSC'er i donorernes perifere blod, hvilket er nødvendigt for at bestemme deres maksimale niveau.

Autogen transplantation af hæmatopoietiske stamceller eliminerer, i modsætning til allogen transplantation, fuldstændigt udviklingen af afstødningsreaktioner. En betydelig ulempe ved autotransplantation af hæmatopoietiske stamceller, som begrænser indikationerne for dens implementering, er imidlertid den høje sandsynlighed for reinfusion af leukæmiske klonceller med transplantatet. Derudover øger fraværet af den immunmedierede "graft versus tumor"-effekt signifikant hyppigheden af tilbagefald af maligne blodsygdomme. Derfor forbliver den eneste radikale metode til at eliminere neoplastisk klonal hæmatopoiese og genoprette normal polyklonal hæmatopoiese ved myelodysplastiske syndromer intensiv polykemoterapi med transplantation af allogen hæmatopoiese.

Men selv i dette tilfælde er behandlingen af de fleste hæmoblastoser kun rettet mod at øge patienternes overlevelsestid og forbedre deres livskvalitet. Ifølge flere store undersøgelser opnås langvarig tilbagefaldsfri overlevelse efter allotransplantation af HSC'er hos 40% af onkohæmatologiske patienter. Ved brug af stamceller fra en HLA-kompatibel søskende observeres de bedste resultater hos unge patienter med en kort sygdomshistorie, et blastcelletælling på op til 10% og gunstig cytogenetik. Desværre er dødeligheden forbundet med proceduren for allotransplantation af HSC'er hos patienter med myelodysplastiske sygdomme fortsat høj (i de fleste rapporter - ca. 40%). Resultaterne af 10-årigt arbejde fra National Bone Marrow Donor Program i USA (510 patienter, medianalder - 38 år) indikerer, at den tilbagefaldsfri overlevelse i to år er 29% med en relativt lav sandsynlighed for tilbagefald (14%). Dødeligheden forbundet med proceduren med allotransplantation af HSC'er fra en ubeslægtet donor er imidlertid ekstremt høj og når 54% over en toårig periode. Lignende resultater blev opnået i et europæisk studie (118 patienter, medianalder - 24 år, toårig tilbagefaldsfri overlevelse - 28%, tilbagefald - 35%, dødelighed - 58%).

Under intensive kemoterapiforløb med efterfølgende genoprettelse af hæmatopoiesen med allogene hæmatopoietiske celler opstår der ofte immunhæmatologiske og transfusionskomplikationer. Disse skyldes i høj grad, at menneskelige blodgrupper nedarves uafhængigt af MHC-molekyler. Derfor kan deres erytrocytter, selvom donor og modtager er kompatible med de vigtigste HLA-antigener, have forskellige fænotyper. Der skelnes mellem "større" inkompatibilitet, når modtageren har præeksisterende antistoffer mod donorens erytrocytantigener, og "mindre" inkompatibilitet, når donoren har antistoffer mod modtagerens erytrocytantigener. Tilfælde af en kombination af "større" og "mindre" inkompatibilitet er mulige.

Resultaterne af en sammenlignende analyse af den kliniske effektivitet af allotransplantation af hæmatopoietiske stamceller fra knoglemarv og navlestrengsblod ved hæmoblastoser indikerer, at risikoen for at udvikle en graft-versus-host-reaktion er signifikant reduceret hos børn efter allotransplantation af hæmatopoietiske stamceller fra navlestrengsblod, men der observeres en længere periode med genopretning af antallet af neutrofiler og blodplader med en højere forekomst af dødelighed 100 dage efter transplantation.

Undersøgelsen af årsagerne til tidlig dødelighed gjorde det muligt at afklare kontraindikationerne for allogen HSC-transplantation, hvoraf de vigtigste er:

• tilstedeværelsen af positive tests for cytomegalovirusinfektion hos recipienten eller donoren (uden forebyggende behandling);
• akut strålesyge;
• tilstedeværelsen af eller endda mistanke om tilstedeværelsen af en svampeinfektion hos en patient (uden at udføre systemisk tidlig profylakse med svampedræbende lægemidler);
• hæmoblastoser, hvor patienterne fik langvarig behandling med cytostatika (på grund af den høje sandsynlighed for pludseligt hjertestop og multiorgansvigt);
• transplantation fra HLA-ikke-identiske donorer (uden profylakse af akut graft-versus-host-reaktion med cyclosporin A);
• kronisk viral hepatitis C (på grund af den høje risiko for udvikling af venookklusiv leversygdom).

HSC-transplantation kan således forårsage alvorlige komplikationer, som ofte fører til døden. I den tidlige periode (op til 100 dage efter transplantation) omfatter disse infektiøse komplikationer, akut graft-versus-host-sygdom, transplantatafstødning (svigt af donor-HSC'er), veno-okklusiv leversygdom samt vævsskade forårsaget af toksiciteten af konditioneringsregimet, som er karakteriseret ved en høj remodelleringsrate (hud, vaskulært endotel, tarmepitel). Komplikationer i den sene posttransplantationsperiode omfatter kronisk graft-versus-host-sygdom, tilbagefald af den underliggende sygdom, væksthæmning hos børn, dysfunktion i reproduktionssystemet og skjoldbruskkirtlen samt øjenskader.

For nylig, i forbindelse med publikationer om knoglemarvscellers plasticitet, er ideen om at bruge HSC'er til behandling af hjerteanfald og andre sygdomme opstået. Selvom nogle dyreforsøg understøtter denne mulighed, skal konklusionerne om knoglemarvscellers plasticitet bekræftes. Denne omstændighed bør tages i betragtning af de forskere, der mener, at transplanterede humane knoglemarvsceller let omdannes til skeletmuskulatur, myokardieceller eller CNS-celler. Hypotesen om, at HSC'er er en naturlig cellulær kilde til regenerering af disse organer, kræver seriøs evidens.

Især er de første resultater af et åbent, randomiseret studie af V. Belenkov (2003) blevet offentliggjort. Formålet var at undersøge effekten af C-SvK (dvs. mobilisering af autologe HSC'er i blodet) på den kliniske, hæmodynamiske og neurohumorale status hos patienter med moderat til svær kronisk hjertesvigt, samt at evaluere dets sikkerhed på baggrund af standardbehandling (angiotensin-konverterende enzymhæmmere, betablokkere, diuretika, hjerteglykosider). I den første publikation af studieresultaterne bemærker programmets forfattere, at det eneste argument til fordel for O-SvK er resultaterne af behandling af én patient, som viste en ubestridelig forbedring i alle kliniske og hæmodynamiske parametre på baggrund af behandling med dette lægemiddel. Teorien om HSC-mobilisering i blodbanen med efterfølgende myokardiel regenerering i postinfarktzonen blev dog ikke bekræftet - selv hos en patient med positiv klinisk dynamik afslørede stressekkokardiografi med dobutamin ikke forekomsten af zoner med levedygtigt myokardium i arområdet.

Det skal bemærkes, at der på nuværende tidspunkt tydeligvis ikke er tilstrækkelige data til at anbefale erstatningscelleterapi til udbredt implementering i den daglige kliniske praksis. Veldesignede og højkvalitets kliniske studier er nødvendige for at bestemme effektiviteten af forskellige muligheder for regenerativ celleterapi, udvikle indikationer og kontraindikationer for den, samt retningslinjer for kombineret brug af regenerativ-plastisk terapi og traditionel kirurgisk eller konservativ behandling. Der er stadig intet svar på spørgsmålet om, hvilken specifik population af knoglemarvsceller (stamme hæmatopoietiske eller stromale), der kan give anledning til neuroner og kardiomyocytter, og det er også uklart, hvilke forhold der bidrager til dette in vivo.

Der arbejdes på disse områder i mange lande. I opsummeringen af symposiet om akut leversvigt fra de amerikanske National Institutes of Health nævnes blandt de lovende behandlingsmetoder, udover levertransplantation, transplantation af xeno- eller allogene hepatocytter og ekstrakorporal forbindelse af bioreaktorer med leverceller. Der er direkte bevis for, at kun fremmede funktionelt aktive hepatocytter er i stand til at yde effektiv støtte til recipientens lever. Til klinisk brug af isolerede hepatocytter er det nødvendigt at oprette en cellebank, hvilket vil reducere tiden mellem isolering af celler og deres anvendelse betydeligt. Den mest acceptable metode til at oprette en bank af isolerede hepatocytter er kryopræservering af leverceller i flydende nitrogen. Ved brug af sådanne celler i klinikken hos patienter med akut og kronisk leversvigt er der blevet påvist en forholdsvis høj terapeutisk effekt.

Trods de optimistiske og opmuntrende resultater af levercelletransplantation i eksperimenter og klinisk praksis er der stadig mange problemer, der langt fra er løst. Disse omfatter et begrænset antal organer, der er egnede til at opnå isolerede hepatocytter, utilstrækkeligt effektive metoder til deres isolering, fraværet af standardiserede metoder til konservering af leverceller, uklare ideer om mekanismerne for vækst- og proliferationsregulering af transplanterede celler, fraværet af tilstrækkelige metoder til vurdering af indpodning eller afstødning af allogene hepatocytter. Dette omfatter også tilstedeværelsen af transplantationsimmunitet ved brug af allogene og xenogene celler, dog mindre end ved ortotopisk levertransplantation, men kræver brug af immunsuppressive midler, indkapsling af isolerede hepatocytter eller deres særlige behandling med enzymer. Hepatocyttransplantation fører ofte til en immunkonflikt mellem modtageren og donoren i form af en afstødningsreaktion, hvilket kræver brug af cytostatika. En løsning på dette problem kan være brugen af polymere mikroporøse bærere til at isolere leverceller, hvilket vil forbedre deres overlevelse, da kapselmembranen effektivt beskytter hepatocytter på trods af værtens immunisering.

Ved akut leversvigt er en sådan hepatocyttransplantation imidlertid ineffektiv på grund af den relativt lange tid, det tager for leverceller at indpode sig i et nyt miljø og nå stadiet med optimal funktion. En potentiel begrænsning er udskillelsen af galde under ektopisk transplantation af isolerede hepatocytter, og ved anvendelse af bioreaktorer er en betydelig fysiologisk barriere artsmismatchen mellem humane proteiner og de proteiner, der produceres af xenogene hepatocytter.

Der findes rapporter i litteraturen om, at lokal transplantation af stromale stamceller fra knoglemarv muliggør effektiv korrektion af knogledefekter, og at knoglevævsrestaurering i dette tilfælde forløber mere intensivt end ved spontan reparativ regenerering. Adskillige prækliniske studier af eksperimentelle modeller viser overbevisende muligheden for at anvende stromale celletransplantationer fra knoglemarv i ortopædi, selvom der er behov for yderligere arbejde for at optimere disse metoder, selv i de enkleste tilfælde. Især er optimale betingelser for ekspansion af osteogene stromale celler ex vivo endnu ikke fundet, og strukturen og sammensætningen af deres ideelle bærer (matrix) forbliver uudviklet. Det minimale antal celler, der kræves til volumetrisk knogleregenerering, er ikke blevet bestemt.

Det er blevet bevist, at mesenkymale stamceller udviser transgermal plasticitet, dvs. evnen til at differentiere til celletyper, der fænotypisk ikke er beslægtede med cellerne i den oprindelige linje. Under optimale dyrkningsbetingelser kan polyklonale stromale stamcellelinjer fra knoglemarv modstå mere end 50 delinger in vitro, hvilket gør det muligt at opnå milliarder af stromale celler fra 1 ml knoglemarvsaspirat. Populationen af mesenkymale stamceller er imidlertid heterogen, hvilket manifesterer sig både ved variation i kolonistørrelser, forskellige dannelseshastigheder og morfologisk diversitet af celletyper, fra fibroblastlignende spindelformede til store flade celler. Fænotypisk heterogenitet observeres efter blot 3 ugers dyrkning af stromale stamceller: nogle kolonier danner knuder af knoglevæv, andre danner klynger af adipocytter, og andre, mere sjældne, danner øer af bruskvæv.

Transplantation af embryonalt nervevæv blev oprindeligt brugt til behandling af degenerative sygdomme i centralnervesystemet. I de senere år er cellulære elementer fra neurosfærer udvundet fra neurale stamceller blevet transplanteret i stedet for embryonalt hjernevæv (Poltavtseva, 2001). Neurosfærer indeholder dedikerede forstadier til neuroner og neuroglia, hvilket giver håb om genoprettelse af tabte hjernefunktioner efter deres transplantation. Efter transplantation af dispergerede neurosfæreceller i striatumregionen af rottehjernen blev deres proliferation og differentiering til dopaminerge neuroner observeret, hvilket eliminerede motorisk asymmetri hos rotter med eksperimentel hemiparkinsonisme. I nogle tilfælde udviklede der sig dog tumorer fra neurosfæreceller, hvilket førte til dyrenes død (Bjorklund, 2002).

I klinikken gav omhyggelige undersøgelser af to patientgrupper, hvor hverken patienterne eller de læger, der observerede dem, vidste (dobbeltblindet studie), at den ene gruppe patienter fik transplanteret embryonalt væv med neuroner, der producerede dopamin, og den anden gruppe patienter gennemgik en simuleret operation, uventede resultater. Patienter, der fik transplanteret embryonalt nervevæv, havde det ikke bedre end patienterne i kontrolgruppen. Derudover udviklede 5 ud af 33 patienter vedvarende dyskinesi 2 år efter transplantation af embryonalt nervevæv, hvilket ikke var til stede hos patienterne i kontrolgruppen (Stamceller: videnskabelige fremskridt og fremtidige forskningsretninger. Nat. Inst, of Health. USA). Et af de uløste problemer i klinisk forskning af neurale stamceller i hjernen forbliver analysen af de reelle muligheder og begrænsninger ved transplantation af deres derivater til korrektion af CNS-lidelser. Det er muligt, at neuronogenese i hippocampus induceret af langvarig anfaldsaktivitet, der fører til dens strukturelle og funktionelle reorganisering, kan være en faktor i den progressive udvikling af epilepsi. Denne konklusion fortjener særlig opmærksomhed, da den peger på mulige negative konsekvenser af dannelsen af nye neuroner i den modne hjerne og dannelsen af afvigende synaptiske forbindelser af dem.

Det bør ikke glemmes, at dyrkning i medier med cytokiner (mitogener) bringer stamcellernes egenskaber tættere på tumorcellernes, da lignende ændringer i reguleringen af cellecyklusser forekommer i dem, hvilket bestemmer evnen til ubegrænset deling. Det er uforsvarligt at transplantere tidlige derivater af embryonale stamceller ind i en person, da risikoen for at udvikle maligne neoplasmer i dette tilfælde er meget høj. Det er meget sikrere at bruge deres mere engagerede afkom, dvs. forløberceller fra differentierede linjer. Imidlertid er der på nuværende tidspunkt endnu ikke udviklet en pålidelig teknik til at opnå stabile linjer af humane celler, der differentierer i den ønskede retning.

Brugen af molekylærbiologiske teknologier til korrektion af arvelig patologi og menneskelige sygdomme ved at modificere stamceller er af stor interesse for praktisk medicin. Stamcellegenomets egenskaber gør det muligt at udvikle unikke transplantationsordninger til at korrigere genetiske sygdomme. Der er dog en række begrænsninger på dette område, der skal overvindes, før den praktiske anvendelse af stamcellegenteknologi kan finde sted. Først og fremmest er det nødvendigt at optimere processen med ex vivo stamcellegenommodifikation. Det er kendt, at langvarig (3-4 uger) proliferation af stamceller reducerer deres transfektion, så flere transfektionscyklusser er nødvendige for at opnå et højt niveau af deres genetiske modifikation. Hovedproblemet er dog forbundet med varigheden af terapeutisk genekspression. Indtil nu har ingen undersøgelser overskredet perioden med effektiv ekspression efter transplantation af modificerede celler. I 100% af tilfældene falder ekspressionen af transfekterede gener over tid på grund af inaktivering af promotorer og/eller død af celler med et modificeret genom.

Et vigtigt spørgsmål er omkostningerne ved at bruge celleteknologier inden for medicin. For eksempel er det anslåede årlige behov for kun at finansiere de medicinske udgifter til en knoglemarvstransplantationsenhed, der er designet til at udføre 50 transplantationer om året, omkring 900.000 amerikanske dollars.

Udviklingen af celleteknologier i klinisk medicin er en kompleks og flertrinnet proces, der involverer et konstruktivt samarbejde mellem tværfaglige videnskabelige og kliniske centre og det internationale samfund. Samtidig kræver spørgsmål om videnskabelig organisering af forskning inden for celleterapi særlig opmærksomhed. De vigtigste af disse er udviklingen af kliniske forskningsprotokoller, kontrol over pålideligheden af kliniske data, dannelsen af et nationalt register over studier, integration i internationale programmer for multicenter kliniske studier og implementering af resultater i klinisk praksis.

Som afslutning på introduktionen til problemerne inden for celletransplantation vil jeg gerne udtrykke håb om, at en forening af indsatsen fra førende ukrainske specialister fra forskellige videnskabelige områder vil sikre betydelige fremskridt inden for eksperimentel og klinisk forskning og vil gøre det muligt i de kommende år at finde effektive måder at yde bistand til alvorligt syge mennesker, der har brug for organ-, vævs- og celletransplantation.

[ 13 ], [ 14 ], [ 15 ], [ 16 ], [ 17 ], [ 18 ]