Den rolle, som enzymer og cytokiner spiller i patogenesen af slidgigt

I de senere år har en stor del af undersøgelsen fokuseret på identifikation af proteaser, der er ansvarlige for nedbrydningen af ECM i leddbrusk i slidgigt. Ifølge moderne ideer spilles en vigtig rolle i patogenesen af slidgigt ved matrixmetalloproteaser (MMP). Patienter med slidgigt har et forhøjet niveau på tre repræsentanter for MMP-collagenaser, stromelysiner og gelatinaser. Collagenase er ansvarlig for nedbrydningen af nativt collagen, stromelysin - collagen type IV, laminin og proteoglycaner, azhelatinaza - for nedbrydningen af gelatine, collagen IV, Vh XI typer elastin. Derudover er tilstedeværelsen af et andet enzym - aggrecanase, som har egenskaberne af MMP'er og er ansvarlig for proteolysen af bruskede proteoglycanaggregater.

Ledbrusken af humane collagenaser identificeret tre typer af niveauer, som er forhøjet i patienter med slidgigt - collagenase-1 (MMP-1), collagenase-2 (MMP-8), collagenase-3 (MMP-13). Den sameksistens mellem tre forskellige typer af kollagenase i ledbrusken viser, at hver af dem spiller en særlig rolle. Ja, collagenase-1 og -2 er lokaliseret primært i den overfladiske og øvre mellemliggende zone af ledbrusken, mens collagenase-3 findes i bunden af de mellemliggende og dybe zoner. Endvidere har resultaterne af immunohistokemiske undersøgelser vist, at under progression af osteoarthritis niveau af collagenase-3 når et plateau eller endda falder, mens niveauet af collagenase-1 forøges gradvist. Der er beviser for, at for slidgigt collagenase-1 er primært involveret i den inflammatoriske proces i ledbrusken, mens collagenase-3 - i vævsomdannelse. Udtrykt i brusk fra patienter med OA collagenase 3 udfører nedbrydningen af type II kollagen mere intensivt end collagenase-1.

Af repræsentanterne for den anden gruppe metalloproteaser Humant stromelizinovu identificeret som tre - stromelysin-1 (MMP-3), stromelysin-2 (MMP-10) og stromelysin-3 (MMP-11). I dag er det kendt, at kun stromelysin-1 er involveret i den patologiske proces i slidgigt. I synovialmembranen af patienter med osteoarthritis er ikke bestemt stromelysin-2, men det er fundet i meget små mængder i synovialfibroblaster af patienter med reumatoid arthritis. Stromelysin-3 findes også i den synoviale membran hos patienter med rheumatoid arthritis nær fibroblasterne, især i fibrosisoner.

I gelatinase-gruppen er kun to blevet identificeret i det menneskelige bruskvæv: 92 kD gelatinase (gelatinase B eller MMP-9) og gelatine ved 72 kD (gelatinase A eller MMP-2); hos patienter med slidgigt er en stigning i niveauet af 92 kD gelatinase bestemt.

Ikke så længe siden blev der identificeret en anden gruppe MMP'er, der er lokaliseret på cellemembranernes overflade og kaldes MMP-membran type (MMP-MT). Til denne gruppe tilhører fire enzymer - MMP-MT1-MMP-MT-4. MMP-MT-ekspression findes i den humane artikulære brusk. Selv om MMP-MT-1 besidder egenskaberne af collagenase, er både MMP-MT-1 og MMP-MT-2 i stand til at aktivere gelatinase-72 kD og collagenase-3. Denne gruppes MMP's rolle i patogenesen af OA kræver forfining.

Proteinaser udskilles i form af en zymogen, som aktiveres af andre proteinaser eller organiske forbindelser af kviksølv. Den katalytiske aktivitet af MMP afhænger af tilstedeværelsen af zink i enzymets aktive zone.

Den biologiske aktivitet af MMP styres af specifikke TIMP'er. Hidtil er der identificeret tre typer TIMP, som findes i det humane ledvæv, TIMP-1-TIMP-3. Den fjerde type TIMP er identificeret og klonet, men den er endnu ikke blevet detekteret i det humane ledvæv. Disse molekyler binder specifikt til det aktive sted af MMP, skønt nogle af dem er i stand til at binde det aktive sted i 72 kDa progelatinase (TIMP-2, -3, -4) og 92 kDa progelatinase (TIMP-1 og -3). Dataene indikerer, at der med OA i ledbrusk er en ubalance mellem MMP og TIMP, hvilket resulterer i en relativ mangel på inhibitorer, hvilket delvis skyldes en forøgelse i niveauet af aktivt MMP i vævet. TIMP-1 og -2 findes i artikulær brusk, de syntetiseres af chondrocytter. Med slidgigt i den synoviale membran og synovialvæske er kun den første type TIMP blevet detekteret. TIMP-3 registreres udelukkende i ECM. TIMP-4 har en næsten identisk aminosyresekvens med TIMP-2 og-ZINA på ca. 38% -STIMP-1 med næsten 50%. I andre målceller er TIMP-4 ansvarlig for modulerende aktivering af 72 kD progestogenase på celleoverfladen, hvilket indikerer en vigtig rolle som en vævsspecifik regulator for ECM remodeling.

En anden mekanisme til styring af MMP's biologiske aktivitet er deres fysiologiske aktivering. Det menes at enzymer fra familien af serin og cysteinproteaser, såsom henholdsvis AP / plasmin og cathepsin B, er fysiologiske aktivatorer af MMP. I leddbrusk hos patienter med slidgigt blev en forhøjet niveau af urokinase (UAP) og plasmin detekteret.

På trods af at flere typer af cathepsiner findes i det fælles væv, betragtes cathepsin-B som den mest sandsynlige aktivator af MMP i brusk. I vævene i det humane led blev der påvist fysiologiske inhibitorer af serin- og cysteinproteaser. Aktiviteten af inhibitoren AP-1 (IAP-1) såvel som cysteinproteaser reduceres hos patienter med slidgigt. Tilsvarende MMP / TIMP - kan nemlig ubalance mellem serin- og cysteinproteaser og deres inhibitorer forklare den øgede aktivitet af MMP i artikulær hryashe patienter med slidgigt. Derudover kan MMP'er aktivere hinanden. For eksempel aktiverer stromelysin-1 collagenase-1, collagenase-3 og gelatinase 92 kD; Collagenase-3 aktiverer 92 kD gelatinase; MMP-MT aktiverer collagenase-3, og gelatinase-72 kD forstærker denne aktivering; MMP-MT aktiverer også 72 kD gelatinase. Cytokiner kan opdeles i tre grupper - destruktive (proinflammatoriske), regulatoriske (herunder antiinflammatoriske) og anabolske (vækstfaktorer).

Typer af cytokiner (ifølge van den Berg WB et al)

Destruktiv	Interleukin-1 TNF-alfa Leukæmisk hæmmende faktor Interleukin-17
Lovgivningsmæssige	Interleukin-4 Interleukin-10 Interleukin-13 Enzyminhibitorer
Anabolske	Msulin-lignende vækstfaktorer TFR-b Knoglemorfogenetiske proteiner Morfogenetiske proteiner stammer fra brusk

Destruktive cytokiner, især IL-1-induceret stigning i frigivelsen af proteaser og inhiberer syntesen af proteoglycaner og kollagener chondrocytter. Regulatoriske Cytokiner, især IL-4 og -10, inhibere produktionen af IL-1-receptorantagonist, for at øge produktionen af IL-1 (IL-1 RA), og nedbringe niveauet og NO-syntase-aktivitet i chondrocytter. Således, IL-4 antagoniserer IL-1 i tre måder: 1) reducerer produktionen og forhindrer dens virkninger, 2) øger produktionen af grundlæggende "scavenger" IL-1Pa og 3) reducerer produktionen af primær sekundære "messenger» NO. Derudover reducerer IL-4 enzymatisk vævsforringelse. In vivo betingelser opnås den optimale terapeutiske virkning med kombinationen af IL-4 og IL-10. Anabolske faktorer, såsom kakTFR-p og IGF-1, ikke rigtigt gribe ind i produktionen eller virkningen af IL-1, men som viser den modsatte virkning, for eksempel stimulerer syntesen af proteoglycan og collagen, inhibere proteaseaktivitet og TGF (3, hæmmer også frigivelse af enzymer og stimulerer deres inhibitorer.

Proinflammatoriske cytokiner er ansvarlige for den øgede syntese og ekspression af MMP i det fælles væv. De syntetiseres i den synoviale membran og diffunderes derefter i ledbrusk gennem synovialvæsken. Proinflammatoriske cytokiner aktiverer chondrocytter, som igen er i stand til at producere proinflammatoriske cytokiner. I leddene, der er ramt af osteoarthrose, afspilles rollen af effektoren af inflammation hovedsageligt af cellerne i den synoviale membran. Det er synovitis af makrofag typen, der udskiller proteaser og inflammatoriske mediatorer. Blandt dem er IL-f, TNF-a, IL-6, leukæmisk inhiberende faktor (LIF) og IL-17 involveret i størst grad i patogenesen af artrose.

Biologisk aktive stoffer, der stimulerer leddbrusk nedbrydning i slidgigt

• Interleukin-1
• Interleukin-3
• Interleukin-4
• TNF-alfa
• Kolonistimulerende faktorer: makrofag (monocytisk) og granulocyt-makrofag
• Stof P
• PGE ₂
• Aktivatorer af plasminogen (væv og urokinase typer) og plasmin
• Metalloproteaser (collagenaser, ellastaser, stromelysiner)
• Cathepsins A og B.
• Thriller
• Bakterielle lipopolysaccharider
• Phospholipase ag

Litteraturdataene indikerer, at IL-ip og muligvis TNF-a er de vigtigste mediatorer for destruktion af ledvæv i slidgigt. Det er dog stadig ikke kendt, om de opererer uafhængigt af hinanden eller der er et funktionelt hierarki mellem dem. På modeller af slidgigt i dyr blev det vist, at IL-1 blokade effektivt forhindrer ødelæggelse af ledbrusk, mens blokade af TNF-alfa fører til en svækkelse af betændelse i ledvæv. I synovialmembranen blev synovialvæske og brusk hos patienter påvist, øgede koncentrationer af begge cytokiner. Chondrocytterne er i stand til at øge syntesen af ikke kun proteaser (MMP'er og hovedsagelig AP), men også mindre collagener såsom type I og III, samt reducere syntesen af kollagen type II og IX og proteoglycaner. Disse cytokiner stimulerer også aktive iltarter og inflammatoriske mediatorer, såsom PGE ₂. Resultatet af sådanne makromolekylære ændringer i ledbrusk med slidgigt er ineffektiviteten af reparationsprocesser, hvilket fører til yderligere nedbrydning af brusk.

De ovennævnte proinflammatoriske cytokiner modulerer de processer af depression / aktivering af MMP'er i slidgigt. For eksempel kan ubalancen mellem niveauerne af TIMP-1 og MMP'er i brusk i slidgigt være medieret af IL-ip, fordi undersøgelsen in vitro viste, at stigende koncentrationer af IL-1 beta reducerer koncentrationen af TIMP-1 og MMP forøget syntese af chondrocytter. Syntese af AP moduleres også ved IL-1beta. Stimulering in vitro chondrocytter af ledbrusk med IL-1 vyzyvet dosisafhængig stigning i syntese og skarp AP fald i syntese af PAI-1. Evnen hos IL-1 for at reducere syntesen af PAI-1-syntese og stimulere AP er en stærk mekanisme til generering af plasmin aktivering og MMP. Desuden plasmin er ikke kun et enzym aktiverende andre enzymer, det også deltager i nedbrydningen af brusk ved direkte proteolyse.

IL-ip syntetiseres som et inaktivt forstadium masse 31 kD (pre-IL-ip), Azat, efter spaltning af signalpeptidet, omdannes til det aktive cytokin fra vægten på 17,5 kD. I væv af leddene, herunder synovialmembranen og synovialvæske af ledbrusk, IL-ip detekteret i aktiv form, og i undersøgelser in vivo demonstrerede evne ledhinden i slidgigt udskille dette cytokin. Nogle serinproteaser er i stand til at konvertere pre-IL-ip til dets bioaktive form. I pattedyr er sådanne egenskaber findes i kun én protease som hører til familien af cystein aspartatspetsificheskih enzymer kaldet IL-1p-konverterende enzym (IKF eller Caspase-1). Dette enzym er i stand til specifikt at omdanne pre-IL-ip til en biologisk aktiv "moden" IL-ip med en masse på 17,5 kD. IKF er et proenzyme med en molekylvægt på 45 kD (p45), som er lokaliseret i cellemembranen. Efter proteolytisk spaltning af proenzymet p45 til dannelse af to underenheder, kendt som p10 og p20, som er karakteriseret ved enzymatisk aktivitet.

TNF-a syntetiseres også som en membranbundet precursor med en masse på 26 kD; ved proteolytisk spaltning frigives den fra cellen som en aktiv opløselig form med en masse på 17 kD. Proteolytisk spaltning udføres af TNF-a-konverterende enzym (TNF-KF), som tilhører familien af adamalysiner. AR Amin og medforfattere (1997) fandt øget ekspression af TNF-CF mRNA i ledbrusk hos patienter med slidgigt.

Den biologiske aktivering af chondrocytter og synovitocytter IL-1 og TNF-a medieres ved binding til specifikke receptorer på overfladen af celler - IL-R og TNF-R. For hver cytokin er to typer receptorer blevet identificeret: IL-IP af type I og II og TNF-P I (p55) og II (p75). Til transmissionen af signaler i cellerne i det fælles væv reagerer IL-1PI og p55. IL-1P type I har en lidt højere affinitet for IL-1beta end for IL-1a; IL-1P type II - tværtimod har større affinitet for IL-1a end for IL-ip. Det er uvist, om IL-IP II type II kan formidle IL-1-signaler, eller det tjener kun til at inhibere i virkeligheden IL-1-binding til IL-1PI-typen. I hondroiitah og synovialfibroblaster af patienter med slidgigt finde en stor mængde af IL-1PI og p55, hvilket igen forklarer den høje følsomhed af disse celler til stimulering af cytokiner relevante. Denne proces fører både til en stigning i sekretionen af proteolytiske enzymer og til ødelæggelsen af ledbrusk.

Det er ikke udelukket, at IL-6 deltager i den patologiske proces i slidgigt. Denne antagelse er baseret på følgende observationer:

• IL-6 øger antallet af inflammatoriske celler i den synoviale membran,
• IL-6 stimulerer proliferationen af chondrocytter,
• IL-6 forbedrer virkningerne af IL-1 ved forøgelse af syntesen af MMP og hæmning af syntesen af proteoglycaner.

Imidlertid IL-6 i stand til at inducere produktion af TIMP, men påvirker ikke produktionen af MMP'er anses derfor at dette cytokin er involveret i processen med indeslutning af proteolytisk nedbrydning af ledbrusk, som er udført gennem en feedback-mekanisme.

En anden repræsentant for den IL-6-familien er LIF - cytokin, som produceres af chondrocytter opnået fra patienter med slidgigt, som respons på stimulering af pro-inflammatoriske cytokiner IL-ip og TNF-a. LIF stimulerer resorptionen af proteoglycaner i brusk samt syntesen af MMP og NO-produktion. Denne cytokins rolle i slidgigt er ikke fuldt ud forstået.

IL-17 er en 20-30 kD homodimer, der har IL-1-lignende virkning, men langt mindre udtalt. IL-17 stimulerer syntesen og isolationen af et antal proinflammatoriske cytokiner, herunder IL-ip, TNF-a, IL-6 og MMP i målceller, fx i humane makrofager. Derudover stimulerer IL-17 ingen produktion med chondrocytter. Ligesom LIF er rollen som IL-17 i patogenesen af OA blevet lidt studeret.

Uorganisk frit radikal NO spiller en vigtig rolle i nedbrydningen af ledbrusk med OA. Chondrocytter opnået fra patienter med slidgigt producerer mere NO så spontant såvel som efter stimulation med proinflammatoriske cytokiner i sammenligning med normale celler. Et højt NO-indhold findes i synovialvæsken og serumet hos patienter med slidgigt - resultatet af øget ekspression og syntese af induceret NO-syntase (hNOC), et enzym der er ansvarlig for NO-produktion. For nylig blev DNA fra chondrocytspecifikke hNOC klonet, enzymets aminosyresekvens blev bestemt. Aminosyresekvensen indikerer en 50% identitet og 70% lighed med hNOC specifikt for endotelet og neuralt væv.

NEJ hæmmer syntesen af makromolekyler af ECM af ledbrusk og stimulerer syntesen af MMP. Endvidere ledsages en stigning i NO-produktion af et fald i syntesen af antagonisten IL-IP (IL-1RA) ved chondrocytter. Således fører en stigning i niveauet af IL-1 og et fald i IL-1 RA til hyperstimulering af NO af chondrocytter, hvilket igen fører til forøget nedbrydning af bruskmatrixen. Der har været rapporter om en terapeutisk virkning in vivo af en selektiv hNOC-inhibitor på progressionen af eksperimentel artrose.

Naturlige cytokininhibitorer kan direkte hæmme bindingen af cytokiner til receptoren af cellemembraner, hvilket reducerer deres proinflammatoriske aktivitet. Naturlige inhibitorer af cytokiner kan opdeles i tre klasser i henhold til deres virkningsmåde.

Den første klasse af inhibitorer indbefatter receptorantagonister, der forhindrer binding af liganden til dets receptor ved konkurrence for bindingsstedet. Til dato er en sådan inhibitor kun blevet fundet for IL-1, den ovennævnte konkurrencehæmmende inhibitor af IL-1 / ILIP IL-1 PA-systemet. IL-1 RA blokerer mange af de, der observeres i væv i leddene i osteoarthritis, herunder syntesen af prostaglandiner ved synovialceller, produktion af collagenase af chondrocytter og nedbrydning af ledbrusk i kabinettet.

IL-1PA påvises i forskellige former - en opløselig (rIL-1PA) og to intercellulær (μIL-lPAI og μIL-1APAP). Affiniteten af den opløselige form af IL-1RA er 5 gange den af intercellulære former. På trods af den intensive videnskabelige søgning forbliver sidstnævntes funktion ukendt. Eksperimenter in vitro viste, at for at inhibere aktiviteten af IL-1bet kræves koncentrationen af IL-1PA, 10-100 gange højere end normalt , in vivo, er en tusindfoldig forøgelse i koncentrationen af IL-1PA påkrævet. Denne kendsgerning kan delvis forklare den relative mangel på IL-1 RA og det overskydende IL-1 i synovia hos patienter med slidgigt.

Den anden klasse af naturlige inhibitorer af cytokiner er repræsenteret af opløselige receptorer af cytokiner. Et eksempel på sådanne inhibitorer hos mennesker relateret til patogenesen af osteoartrose er pIL-1P og pp55. Opløselige cytokinreceptorer afskæres former af normale receptorer ved at binde til cytokinet, de forhindrer deres binding til membranassocierede receptorer af målceller, der handler ved en mekanisme kompetitiv antagonisme.

Den vigtigste forløber for opløselige receptorer er membranbundet IL-1PP. Affiniteten af rIL-IP med hensyn til IL-1 og IL-1 PA er forskellig. Således har pIL-1PH større affinitet for IL-1p end for IL-1 PA, og pIL-1PI viser en større affinitet for IL-1RA end for IL-ip.

For TNF er der også to typer opløselige receptorer - pp55 og pp75, som opløselige IL-1 receptorer, de dannes ved "sheeding" (dumping). In vivo findes begge receptorer i vævene i de ramte led. Rollen af opløselige TNF-receptorer i patogenesen af slidgigt debatteres. Det foreslås, at de i lave koncentrationer stabiliserer den tredimensionelle struktur af TNF og forøger halveringstiden for det bioaktive cytokin, medens høje koncentrationer af pp55 og pp75 kan reducere TNF-aktivitet gennem konkurrencedygtig antagonisme. Tilsyneladende kan pp75 virke som en bærer af TNF, hvilket letter dens binding til den membranassocierede receptor.

Den tredje klasse af naturlige inhibitorer af cytokiner er repræsenteret af en gruppe af antiinflammatoriske cytokiner, som indbefatter TGF-beta, IL-4, IL-10 og IL-13. Antiinflammatoriske cytokiner reducerer produktionen af proinflammatoriske såvel som nogle proteaser, stimulerer produktionen af IL-1RA og TIMP.