Enzymernes og cytokinernes rolle i patogenesen af osteoartritis

I de senere år har forskeres opmærksomhed været rettet mod at identificere proteaser, der er ansvarlige for nedbrydningen af ledbrusk (ECM) ved slidgigt. Ifølge moderne koncepter spiller matrixmetalloproteaser (MMP'er) en vigtig rolle i patogenesen af slidgigt. Hos patienter med slidgigt påvises et forhøjet niveau af tre MMP'er - kollagenaser, stromelysiner og gelatinaser. Kollagenase er ansvarlig for nedbrydningen af nativt kollagen, stromelysin - type IV kollagen, proteoglycaner og laminin, gelatinase - for nedbrydningen af gelatine, kollagener IV, Vh XI typer, elastin. Derudover antages tilstedeværelsen af et andet enzym - aggrecanase, som har MMP'ers egenskaber og er ansvarlig for proteolysen af bruskholdige proteoglycanaggregater.

Tre typer kollagenaser er blevet identificeret i human ledbrusk, hvis niveauer er signifikant forhøjede hos patienter med slidgigt: kollagenase-1 (MMP-1), kollagenase-2 (MMP-8) og kollagenase-3 (MMP-13). Sameksistensen af tre forskellige typer kollagenaser i ledbrusk antyder, at hver af dem spiller sin egen specifikke rolle. Faktisk er kollagenase-1 og -2 hovedsageligt lokaliseret i den overfladiske og øvre mellemzone af ledbrusk, mens kollagenase-3 findes i den nedre mellemzone og i den dybe zone. Desuden viste resultaterne af immunhistokemiske undersøgelser, at efterhånden som slidgigten skrider frem, når niveauet af kollagenase-3 et plateau og endda falder, mens niveauet af kollagenase-1 gradvist stiger. Der er tegn på, at kollagenase-1 ved slidgigt primært er involveret i den inflammatoriske proces i ledbrusk, mens kollagenase-3 er involveret i vævsombygning. Kollagenase-3, der udtrykkes i brusk hos patienter med slidgigt, nedbryder type II-kollagen mere intensivt end kollagenase-1.

Af repræsentanterne for den anden gruppe af metalloproteaser er tre også blevet identificeret i humant stromelysin: stromelysin-1 (MMP-3), stromelysin-2 (MMP-10) og stromelysin-3 (MMP-11). I dag vides det, at kun stromelysin-1 er involveret i den patologiske proces ved slidgigt. Stromelysin-2 detekteres ikke i synovialmembranen hos patienter med slidgigt, men det findes i meget små mængder i synovialfibroblasterne hos patienter med leddegigt. Stromelysin-3 findes også i synovialmembranen hos patienter med leddegigt nær fibroblaster, især i fibrosezoner.

I gruppen af gelatinaser i humant bruskvæv er kun to blevet identificeret: 92 kD gelatinase (gelatinase B eller MMP-9) og 72 kD gelatinase (gelatinase A eller MMP-2); hos patienter med slidgigt bestemmes en stigning i niveauet af 92 kD gelatinase.

For nylig er en anden gruppe af MMP'er blevet identificeret, som er lokaliseret på overfladen af cellemembraner og kaldes membrantype-MMP'er (MMP-MT). Denne gruppe omfatter fire enzymer - MMP-MT1 - MMP-MT-4. MMP-MT-ekspression er blevet fundet i human ledbrusk. Selvom MMP-MT-1 har kollagenaseegenskaber, er både enzymerne MMP-MT-1 og MMP-MT-2 i stand til at aktivere gelatinase-72 kDa og kollagenase-3. Rollen af denne gruppe af MMP'er i patogenesen af artrose kræver afklaring.

Proteinaser udskilles i form af et zymogen, som aktiveres af andre proteinaser eller organiske kviksølvforbindelser. Den katalytiske aktivitet af MMP'er afhænger af tilstedeværelsen af zink i enzymets aktive zone.

MMP'ers biologiske aktivitet styres af specifikke TIMP'er. Til dato er der identificeret tre typer TIMP'er, som findes i humant ledvæv: TIMP-1-TIMP-3. En fjerde type TIMP er blevet identificeret og klonet, men den er endnu ikke blevet detekteret i humant ledvæv. Disse molekyler binder specifikt til det aktive sted på MMP'er, selvom nogle af dem er i stand til at binde det aktive sted på 72 kD progelatinase (TIMP-2, -3, -4) og 92 kD progelatinase (TIMP-1 og -3). Der er tegn på, at der ved artrose er en ubalance mellem MMP'er og TIMP'er i ledbrusk, hvilket resulterer i en relativ mangel på inhibitorer, muligvis delvist på grund af en stigning i niveauet af aktive MMP'er i vævet. TIMP-1 og -2 findes i ledbrusk og syntetiseres af kondrocytter. Ved slidgigt detekteres kun type I TIMP i synovialmembranen og synovialvæsken. TIMP-3 findes udelukkende i ECM. TIMP-4 deler næsten 50% af sin aminosyresekvens med TIMP-2 og 38% med TIMP-1. I andre målceller er TIMP-4 ansvarlig for at modulere aktiveringen af 72 kD progelatinase på celleoverfladen, hvilket indikerer en vigtig rolle som en vævsspecifik regulator af ECM-remodellering.

En anden mekanisme til at kontrollere den biologiske aktivitet af MMP'er er deres fysiologiske aktivering. Det menes, at enzymer fra serin- og cysteinproteasefamilien, såsom henholdsvis AP/plasmin og cathepsin B, er fysiologiske aktivatorer af MMP'er. Forhøjede niveauer af urokinase (uAP) og plasmin er blevet fundet i ledbrusken hos patienter med slidgigt.

Selvom der findes flere typer cathepsiner i ledvæv, betragtes cathepsin-B som den mest sandsynlige aktivator af MMP'er i brusk. Fysiologiske hæmmere af serin- og cysteinproteaser er blevet fundet i humant ledvæv. Aktiviteten af AP-1-hæmmeren (IAI-1), såvel som cysteinproteaser, er reduceret hos patienter med slidgigt. I lighed med MMP/TIMP er det ubalancen mellem serin- og cysteinproteaser og deres hæmmere, der kan forklare den øgede aktivitet af MMP'er i ledbrusken hos patienter med slidgigt. Derudover er MMP'er i stand til at aktivere hinanden. For eksempel aktiverer stromelysin-1 collagenase-1, collagenase-3 og 92 kD gelatinase; collagenase-3 aktiverer 92 kD gelatinase; MMP-MT aktiverer collagenase-3, og gelatinase-72 kDa forstærker denne aktivering; MMP-MT aktiverer også gelatinase 72 kDa. Cytokiner kan opdeles i tre grupper - destruktive (inflammatoriske), regulatoriske (herunder antiinflammatoriske) og anabolske (vækstfaktorer).

Typer af cytokiner (ifølge van den Berg WB et al.)

Destruktiv	Interleukin-1 TNF-a Leukæmihæmmende faktor Interleukin-17
Reguleringsmæssig	Interleukin-4 Interleukin-10 Interleukin-13 Enzymhæmmere
Anabolske	Mnsulin-lignende vækstfaktorer TGF-b Knoglemorfogenetiske proteiner Morfogenetiske proteiner udvundet fra brusk

Destruktive cytokiner, især IL-1, inducerer en øget frigivelse af proteaser og hæmmer syntesen af proteoglykaner og kollagener af chondrocytter. Regulatoriske cytokiner, især IL-4 og -10, hæmmer IL-1-produktion, øger produktionen af IL-1-receptorantagonisten (IL-1RA) og reducerer niveauet af NO-syntase i chondrocytter. IL-4 modvirker således IL-1 i tre retninger: 1) reducerer produktionen og forhindrer dens virkninger, 2) øger produktionen af den primære "fjerner" IL-1RA og 3) reducerer produktionen af den primære sekundære "budbringer" NO. Derudover reducerer IL-4 enzymatisk nedbrydning af væv. In vivo opnås den optimale terapeutiske effekt med en kombination af IL-4 og IL-10. Anabolske faktorer som TGF-β og IGF-1 interfererer faktisk ikke med produktionen eller virkningen af IL-1, men udviser den modsatte aktivitet, for eksempel ved at stimulere syntesen af proteoglykaner og kollagen, undertrykke aktiviteten af proteaser, og TGF-β hæmmer også frigivelsen af enzymer og stimulerer deres inhibitorer.

Proinflammatoriske cytokiner er ansvarlige for øget syntese og ekspression af MMP'er i ledvæv. De syntetiseres i synovialmembranen og diffunderer derefter ind i ledbrusken gennem synovialvæsken. Proinflammatoriske cytokiner aktiverer chondrocytter, som igen er i stand til at producere proinflammatoriske cytokiner. I led, der er påvirket af slidgigt, spilles rollen som inflammationseffektor hovedsageligt af celler i synovialmembranen. Det er synovocytter af makrofagtypen, der udskiller proteaser og inflammatoriske mediatorer. Blandt dem er IL-f, TNF-α, IL-6, leukæmihæmmende faktor (LIF) og IL-17 mest "involveret" i patogenesen af slidgigt.

Biologisk aktive stoffer, der stimulerer nedbrydningen af ledbrusk ved slidgigt

• Interleukin-1
• Interleukin-3
• Interleukin-4
• TNF-a
• Kolonistimulerende faktorer: makrofag (monocyt) og granulocyt-makrofag
• Stof P
• SIDE ₂
• Plasminogenaktivatorer (vævs- og urokinasetyper) og plasmin
• Metalloproteaser (kollagenaser, ellastaser, stromelysiner)
• Cathepsiner A og B
• Trilsin
• Bakterielle lipopolysaccharider
• Fosfolipase Ag

Litteraturdata indikerer, at IL-1 og muligvis TNF-a er de vigtigste mediatorer af ledvævsdestruktion ved slidgigt. Det er dog stadig ukendt, om de virker uafhængigt af hinanden, eller om der er et funktionelt hierarki mellem dem. Dyremodeller af slidgigt har vist, at IL-1-blokade effektivt forhindrer ødelæggelse af ledbrusk, mens TNF-a-blokade kun fører til et fald i inflammation i ledvæv. Øgede koncentrationer af begge cytokiner blev fundet i synovialmembranen, synovialvæsken og brusk hos patienter. I chondrocytter er de i stand til at øge syntesen af ikke kun proteaser (hovedsageligt MMP og AP), men også mindre kollagener, såsom type I og III, og reducere syntesen af kollagener type II og IX og proteoglykaner. Disse cytokiner stimulerer også reaktive iltarter og inflammatoriske mediatorer såsom PGE2 _. Resultatet af sådanne makromolekylære ændringer i ledbrusk ved slidgigt er ineffektiviteten af reparative processer, hvilket fører til yderligere nedbrydning af brusk.

De ovennævnte proinflammatoriske cytokiner modulerer processerne for MMP-undertrykkelse/aktivering ved slidgigt. For eksempel kan ubalancen mellem TIMP-1 og MMP-niveauer i brusk ved slidgigt være medieret af IL-1, da et in vitro-studie viste, at en stigning i IL-1 beta-koncentrationer fører til et fald i TIMP-1-koncentrationer og en stigning i MMP-syntese af chondrocytter. AP-syntese moduleres også af IL-1 beta. In vitro-stimulering af artikulære bruskchondrocytter med IL-1 forårsager en dosisafhængig stigning i AP-syntese og et kraftigt fald i iAP-1-syntese. IL-1's evne til at mindske iAP-1-syntese og stimulere AP-syntese er en potent mekanisme for plasmingenerering og MMP-aktivering. Derudover er plasmin ikke kun et enzym, der aktiverer andre enzymer, det deltager også i processen med brusknedbrydning ved direkte proteolyse.

IL-ip syntetiseres som en inaktiv precursor med en masse på 31 kD (præ-IL-ip), og omdannes derefter, efter spaltning af signalpeptidet, til et aktivt cytokin med en masse på 17,5 kD. I ledvæv, herunder synovialmembranen, synovialvæsken og ledbrusk, findes IL-ip i en aktiv form, og in vivo-studier har vist synovialmembranens evne til at udskille dette cytokin ved slidgigt. Nogle serinproteaser er i stand til at omdanne præ-IL-ip til dets bioaktive form. Hos pattedyr blev sådanne egenskaber kun fundet i én protease, som tilhører familien af cystein-aspartat-specifikke enzymer og kaldes IL-1β-konverterende enzym (ICF eller caspase-1). Dette enzym er i stand til specifikt at omdanne præ-IL-ip til biologisk aktiv "moden" IL-ip med en masse på 17,5 kD. ICF er et 45 kD proenzym (p45), der er lokaliseret i cellemembranen. Efter proteolytisk spaltning af p45-proenzymet dannes to underenheder kendt som p10 og p20, som er karakteriseret ved enzymatisk aktivitet.

TNF-α syntetiseres også som en membranbundet precursor med en masse på 26 kDa; ved proteolytisk spaltning frigives den fra cellen som en aktiv opløselig form med en masse på 17 kDa. Proteolytisk spaltning udføres af TNF-α-konverterende enzym (TNF-AC), som tilhører adamalizinfamilien. AR Amin et al. (1997) fandt øget ekspression af TNF-AC mRNA i ledbrusken hos patienter med slidgigt.

Biologisk aktivering af chondrocytter og synovocytter af IL-1 og TNF-a medieres ved binding til specifikke receptorer på celleoverfladen - IL-R og TNF-R. To typer receptorer er blevet identificeret for hvert cytokin - IL-IP type I og II og TNF-R type I (p55) og II (p75). IL-1PI og p55 er ansvarlige for signaltransmission i ledvævsceller. IL-1R type I har en lidt højere affinitet for IL-1beta end for IL-1a; IL-1R type II har derimod en højere affinitet for IL-1a end for IL-ip. Det er fortsat uklart, om IL-IP type II kan mediere IL-1-signaler, eller om det kun tjener til kompetitiv hæmning af IL-1's forbindelse med IL-1R type I. Chondroitider og synoviale fibroblaster hos patienter med slidgigt indeholder store mængder IL-1PI og p55, hvilket igen forklarer disse cellers høje følsomhed over for stimulering af de tilsvarende cytokiner. Denne proces fører til både øget udskillelse af proteolytiske enzymer og ødelæggelse af ledbrusk.

IL-6's involvering i den patologiske proces ved slidgigt kan ikke udelukkes. Denne antagelse er baseret på følgende observationer:

• IL-6 øger antallet af inflammatoriske celler i synovialmembranen,
• IL-6 stimulerer chondrocytproliferation,
• IL-6 forstærker virkningerne af IL-1 i at øge MMP-syntesen og hæmme proteoglykansyntesen.

IL-6 er imidlertid i stand til at inducere produktionen af TIMP'er, men påvirker ikke produktionen af MMP'er, så det antages, at dette cytokin er involveret i processen med at hæmme den proteolytiske nedbrydning af ledbrusk, som udføres af en feedbackmekanisme.

Et andet medlem af IL-6-familien er LIF, et cytokin produceret af chondrocytter fra patienter med slidgigt som reaktion på stimulering af de proinflammatoriske cytokiner IL-1p og TNF-a. LIF stimulerer resorption af bruskproteoglykaner, såvel som MMP-syntese og NO-produktion. Dette cytokins rolle i slidgigt er ikke fuldt ud klarlagt.

IL-17 er en 20-30 kD homodimer med en IL-1-lignende effekt, men meget mindre udtalt. IL-17 stimulerer syntesen og frigivelsen af en række proinflammatoriske cytokiner, herunder IL-1p, TNF-α, IL-6 og MMP i målceller, såsom humane makrofager. Derudover stimulerer IL-17 NO-produktion af chondrocytter. Ligesom LIF er IL-17's rolle i patogenesen af artrose blevet dårligt undersøgt.

Det uorganiske frie radikal NO spiller en vigtig rolle i nedbrydningen af ledbrusk ved artrose. Kondrocytter isoleret fra patienter med slidgigt producerer højere mængder NO både spontant og efter stimulering med proinflammatoriske cytokiner sammenlignet med normale celler. Højt NO-indhold er blevet fundet i synovialvæske og serum fra patienter med slidgigt - dette er et resultat af øget ekspression og syntese af induceret NO-syntase (hNOC), enzymet der er ansvarligt for NO-produktion. For nylig blev DNA'et fra den kondrocytspecifikke hNOC klonet, og enzymets aminosyresekvens blev bestemt. Aminosyresekvensen indikerer 50% identitet og 70% lighed med hNOC, der er specifik for endotel og nervevæv.

NO hæmmer syntesen af makromolekyler i ECM i ledbrusk og stimulerer syntesen af MMP. Desuden ledsages en stigning i NO-produktion af et fald i syntesen af IL-IP-antagonisten (IL-1RA) af chondrocytter. Således fører en stigning i niveauet af IL-1 og et fald i IL-1RA til hyperstimulering af NO i chondrocytter, hvilket igen fører til øget nedbrydning af bruskmatrixen. Der er rapporter om den terapeutiske effekt in vivo af en selektiv hNOC-hæmmer på progressionen af eksperimentel slidgigt.

Naturlige cytokinhæmmere er i stand til direkte at forhindre cytokiner i at binde sig til cellemembranreceptorer, hvilket reducerer deres proinflammatoriske aktivitet. Naturlige cytokinhæmmere kan opdeles i tre klasser baseret på deres virkningsmekanisme.

Den første klasse af inhibitorer omfatter receptorantagonister, der forhindrer ligandens binding til dens receptor ved at konkurrere om bindingsstedet. Til dato er en sådan inhibitor kun fundet for IL-1 - dette er den ovennævnte kompetitive inhibitor af IL-1/ILIP-systemet IL-1 PA. IL-1 PA blokerer mange effekter, der observeres i ledvæv ved slidgigt, herunder syntesen af prostaglandiner af synovialceller, produktionen af kollagenase af chondrocytter og nedbrydningen af bensmuskelen i ledbrusk.

IL-1RA findes i forskellige former - én opløselig (rIL-1RA) og to intercellulære (μIL-lPAI og μIL-1RAP). Affiniteten af den opløselige form af IL-1RA er 5 gange højere end den for de intercellulære former. Trods intensiv videnskabelig forskning er sidstnævntes funktion stadig ukendt. In vitro-eksperimenter har vist, at hæmning af IL-1beta-aktivitet kræver en koncentration af IL-1RA, der er 10-100 gange højere end normalt, mens in vivo-forhold kræver en tusindfoldig stigning i IL-1RA-koncentrationen. Denne kendsgerning kan delvist forklare den relative mangel på IL-1RA og overskuddet af IL-1 i synovium hos patienter med slidgigt.

Den anden klasse af naturlige cytokinhæmmere er opløselige cytokinreceptorer. Eksempler på sådanne hæmmere hos mennesker, der er relateret til patogenesen af slidgigt, er rIL-1R og pp55. Opløselige cytokinreceptorer er forkortede former for normale receptorer; når de binder sig til cytokiner, forhindrer de deres binding til membranassocierede receptorer i målceller ved at virke via kompetitiv antagonisme.

Den primære forløber for opløselige receptorer er membranbundet IL-1RP. rIL-IP's affinitet for IL-1 og IL-1RA er forskellig. rIL-1RN har således en højere affinitet for IL-1β end for IL-1RA, og rIL-1PI udviser en højere affinitet for IL-1RA end for IL-ip.

Der findes også to typer opløselige receptorer for TNF - pp55 og pp75. Ligesom opløselige IL-1-receptorer dannes de ved "afgivelse". In vivo findes begge receptorer i vævet i de berørte led. Rollen af opløselige TNF-receptorer i patogenesen af slidgigt er omdiskuteret. Det antages, at de i lave koncentrationer stabiliserer TNF's tredimensionelle struktur og øger halveringstiden for det bioaktive cytokin, mens høje koncentrationer af pp55 og pp75 kan reducere TNF-aktivitet ved kompetitiv antagonisme. pp75 kan sandsynligvis fungere som en TNF-bærer, hvilket letter dens binding til den membranassocierede receptor.

Den tredje klasse af naturlige cytokinhæmmere er repræsenteret af en gruppe antiinflammatoriske cytokiner, som omfatter TGF-beta, IL-4, IL-10 og IL-13. Antiinflammatoriske cytokiner reducerer produktionen af proinflammatoriske og nogle proteaser og stimulerer produktionen af IL-1RA og TIMP.