Årsager til tuberkulose

Familien Mycobacteriaceae af Actinomycetales-ordenen omfatter den enkelte slægt Mycobacterium. I 1975 indeholdt denne slægt omkring 30 arter, og i år 2000 havde dette antal allerede nærmet sig 100. De fleste mykobakteriearter klassificeres som saprofytiske mikroorganismer, der er udbredt i miljøet.

Gruppen af obligate parasitter er ubetydelig, men dens praktiske betydning er stor og bestemmes af de arter, der forårsager tuberkulose hos mennesker og dyr. Der er en opfattelse af, at forgængerne til mykobakterier, der er patogene for mennesker, var gamle jordmykobakterier.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ]

Taksonomi af mykobakterier

Alle mykobakterier er opdelt i patogene for mennesker og opportunistiske.

I klinisk mikrobiologi anvendes flere tilgange til at klassificere mykobakterier:

• ved væksthastighed og optimal temperatur, evnen til at danne pigment;
• for klinisk signifikante komplekser.

De mykobakteriearter, der forårsager tuberkulose, er kombineret i M. tuberculosis-komplekset, som omfatter M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG, M. africanum, M. microti og M. canettii. For nylig er M. pinnipedii og M. sarrae, som er fylogenetisk beslægtede med M. microti og M. bovis, blevet føjet til det.

De resterende mykobakterier, der forårsager forskellige mykobakterier, klassificeres som ikke-tuberkuløse mykobakterier. Følgende komplekser skelnes fra denne gruppe: M. avium, bestående af M. avium, M. intracellulare, M. scrofulaceum; M.fortuitum inklusive underarterne M.fortuitum og M. chelonae, og M. terrae, inklusive M. terrae, M. triviale og M. nonchromogenicum. De vigtigste grupper er spedalskhedspatogenet M. leprae, samt ulcerøs læsionspatogenet Buruli M. ulcerans.

Denne klassificering forener mykobakteriearter med samme kliniske betydning, når deres finere differentiering ikke er afgørende. Biologiske, biokemiske og molekylære metoder anvendes til at identificere arter inden for grupper og komplekser.

Klassificeringen af ikke-tuberkuløse mykobakterier baseret på kulturelle forskelle blev udviklet af Runyon i 1959. Ifølge den skelnes der mellem 4 grupper af mykobakterier.

Gruppe I - fotokromogene mykobakterier

Denne gruppe omfatter mykobakterier, der ikke er pigmenterede, når de dyrkes i mørke, men får lys gul eller gul-orange pigmentering efter lyseksponering. Potentielt patogene stammer, der tilhører denne gruppe, er M. asiaticum, M. kansasii, M. marinum, M. simiae. Blandt mykobakterierne i denne gruppe findes både hurtigtvoksende (M. marinum) og langsomtvoksende (M. asiaticum, M. kansasii). Den optimale væksttemperatur varierer fra 25 ^° C for M. simiae, 32-33 ^° C for M. marinum til 37 ^° C for M. asiaticum.

Den klinisk mest betydningsfulde art i vores land er M. kansasii, som findes i vandløb. M. kansasii-stammen (M. luciflavum) forårsager sygdomme hos mennesker. Den vokser i et ægmedium som ru eller glatte kolonier med et temperaturoptimum på 37 ^° C. Morfologisk er bakterierne af moderat længde. To varianter af M. kansasii er blevet beskrevet til dato: orange og hvid. Når M. kansasii introduceres til marsvin, forårsager den infiltrater og kompaktering af regionale lymfeknuder.

Gruppe II - skotokromogene mykobakterier (fra det græske ord scotos - mørke)

Denne gruppe omfatter mykobakterier, der danner pigment i mørke. Væksthastigheden er 30-60 dage. Denne gruppe omfatter M. aquae (M. gordonae) og M. scrofulaceum.

M. scrofulaceum betragtes som en potentielt patogen art. På ægmedium vokser bakterier af denne art som glatte eller ru kolonier af orange farve. Morfologisk er mykobakterier stavformede, korte eller lange. De vokser ved en temperatur på 25-37 ^° C. Hos børn forårsager de skader på lymfeknuder og lunger.

M. aquae (M. gordonae) klassificeres som saprofytiske skotokromogene mykobakterier. De vokser i ægmedium som orange kolonier ved en temperatur på 25-37 °C. Morfologisk er mykobakterierne stavformede og moderat lange (>5 μm). De findes i vandmasser.

Gruppe III - ikke-fotokromogene mykobakterier

Denne gruppe omfatter mykobakterier, der ikke danner pigment eller har en lysegul farve, der ikke intensiveres i lys. De vokser i 2-3 eller 5-6 uger. De omfatter: M. avium, M. intracellulare, M. xenopi, M. terrae, M. gastri, M. hattey, M. bruiiense.

M. avium (fuglemykobakterier) vokser på Lowenstein-Jensen-mediet som pigmenterede eller svagt pigmenterede kolonier ved 37 ^° C og 45 ^° C. Morfologisk er de mellemlange stave. De kan være patogene for mennesker og en række forsøgs- og husdyr (f.eks. svin). De findes i vand og jord.

M. xenopi er isoleret fra en tudse. Unge kulturer vokser som upigmenterede kolonier. Senere fremkommer et gult pigment. Morfologisk er de lange, trådformede stave. De vokser ved en temperatur på 40-45 ^° C. De er betinget patogene for mennesker.

M. terrae blev først isoleret fra radise. De vokser på Lowenstein-Jensen-medium og som pigmentfri kolonier. Den optimale væksttemperatur er 37 ^° C. Morfologisk er de repræsenteret af stave af moderat længde, saprofytter.

Gruppe IV - hurtigtvoksende mykobakterier

Mykobakterier, der tilhører denne gruppe, er karakteriseret ved hurtig vækst (op til 7-10 dage). De vokser i form af pigmenterede eller ikke-pigmenterede kolonier, oftere i form af R-form. God vækst gives i 2-5 dage ved en temperatur på 25 ^° C. Denne gruppe omfatter potentielt patogene mykobakterier M.fortuitum, såvel som saprofytiske mykobakterier, såsom M. phlei, M. smegmatis osv. M. fortuitum giver synlig vækst på ægmediet på 2-4. dag i form af en "roset". Morfologisk er mykobakterier repræsenteret af korte stave. På Lowenstein-Jensen-mediet kan de absorbere malakitgrønt og blive grønt. De er udbredte i naturen.

Runyon-klassifikationen har vist sig at være meget bekvem til at identificere de mest almindelige typer af mykobakterier. Opdagelsen af nye arter og fremkomsten af et stigende antal mellemformer af mykobakterier forårsager dog vanskeligheder med at registrere dem i en eller anden Runyon-gruppe.

M. tuberculosis er en ung evolutionær formation. For nylig har der været en tendens til at opdele M. tuberculosis i klynger eller familier. De vigtigste stammer er dem, der tilhører Beijing-familien, som er kendetegnet ved klonal adfærd og evnen til at forårsage mikroudbrud af tuberkulose.

Mykobakteriernes morfologi

Mykobakterier er tynde stavformede celler med den karakteristiske egenskab at være syre- og alkoholægt (på et af vækststadierne), aerobe. Når de farves ifølge Gram, er de svagt grampositive. Mykobakterier er immobile og danner ikke sporer. Konidier eller kapsler er fraværende. De vokser langsomt eller meget langsomt på tætte næringsmedier: ved den optimale temperatur fremkommer synlige kolonier efter 2-60 dage. Kolonierne er lyserøde, orange eller gule, især når de vokser i lys. Pigmentet diffunderer ikke. Koloniernes overflade er normalt mat (S-type) eller ru (R-type). Mykobakterier vokser ofte i form af slimede eller rynkede kolonier. På flydende medier vokser mykobakterier på overfladen. Den fine tørre film tykner over tid, bliver ujævn-rynket og får et gulligt skær. Bouillonen forbliver transparent, og diffus vækst kan opnås i nærvær af rengøringsmidler. I mikrokolonierne af M. tuberculosis (dvs. i de tidlige stadier) dannes strukturer, der ligner snore - et træk, der er forbundet med snorfaktoren.

Når mycobacteria tuberculosis farves med carbolfuchsin, fremstår de som tynde, let buede stænger med en hindbærrød farve, der indeholder et varierende antal granuler.

Mykobakteriernes længde er cirka 1-10 µm, og bredden er 0,2-0,7 µm. Nogle gange kan man finde buede eller snoede varianter. Mikroorganismer placeret enkeltvis, parvis eller i grupper skiller sig tydeligt ud mod den blå baggrund af andre komponenter i præparatet. Bakterieceller kan ofte arrangeres i form af romertallet "V".

Præparatet kan også afsløre ændrede kokkoidsyreresistente former af patogenet, afrundede, sfæriske eller myceliumlignende strukturer. I dette tilfælde skal et positivt svar bekræftes med yderligere metoder.

Strukturen af mykobakteriers cellevæg

Cellevæggen hos mykobakterier er den mest komplekse sammenlignet med andre prokaryoter.

Mens gramnegative bakterier har to membraner, består den mykobakterielle cellevæg af flere lag, hvoraf nogle indeholder sukkerarter og er karakteriseret ved en relativt konstant sammensætning. De ydre lag har en skiftende kemisk sammensætning og er hovedsageligt repræsenteret af lipider, hvoraf de fleste er mycolsyrer og deres derivater. Som regel er disse lag ikke synlige under elektronmikroskopi. Cellevæggens primære ramme er tværbundne peptidglykaner - et elektrontæt lag. Arabinogalactanlaget gentager peptidglykanlaget og danner et polysaccharidstroma i cellevæggen. Det har forbindelsespunkter med peptidglykanlaget og strukturer til binding af mycolsyrer og deres derivater.

Mycolsyrer findes i form af frie sulfolipider og cordfaktor, hvis tilstedeværelse på celleoverfladen er forbundet med den karakteristiske dannelse af M. tuberculosis-kolonier i form af flageller. Mycolsyrernes unikke og nøglerolle i mykobakteriernes strukturelle organisering og fysiologi gør dem til et fremragende mål for etiotropisk terapi.

Glykolipidlaget kaldes "mykosider" og sammenlignes undertiden med en mikrokapsel. Mykosider er strukturelt og funktionelt lig lipopolysacchariderne i den ydre membran hos gramnegative bakterier, men mangler deres aggressivitet; ikke desto mindre er de giftige og forårsager (ligesom cordfaktor og sulfolipider) dannelsen af granulomer.

Cellemembranen og lagene i cellevæggen er gennemsyret af kanaler eller porer, blandt hvilke vi kan skelne mellem passive porer med kort levetid, der giver kontrolleret diffusion af stoffer, og kanaler med længere levetid, der giver energiafhængig transport af stoffer.

En anden komponent i mykobakteriernes cellevæg er lipoarabinomannan. Det er forankret til plasmamembranen, trænger ind i cellevæggen og kommer ud på dens overflade. I denne henseende ligner det lipoteichoinsyrerne hos grampositive bakterier eller lipopolysaccharid-O-antigenet hos gramnegative bakterier. De terminale fragmenter af lipoarabinomannan, primært dets mannoseradikaler, undertrykker uspecifikt aktiveringen af T-lymfocytter og leukocytter i det perifere blod. Dette fører til en forstyrrelse af immunresponset på mykobakterier.

Variabilitet og former for eksistens af mykobakterier

Bakteriers persistens har en særlig patogenetisk betydning. Laboratorieforsøg udført in vitro og in vivo har vist, at de bakteriedræbende lægemidler isoniazid og pyrazinamid kun dræber mykobakterier i reproduktionsfasen. Hvis mykobakterier er i fasen med lav metabolisk aktivitet (dvs. bakterievæksten er næsten fuldstændig suspenderet, og bakterierne kan kaldes "dvale"), påvirker bakteriedræbende lægemidler dem ikke. Denne tilstand kaldes normalt dvale, og mikroorganismerne kaldes persistere. Persistere er ikke følsomme over for kemoterapeutiske lægemidler, dvs. de opfører sig som resistente mikroorganismer. Faktisk kan de bevare følsomheden over for lægemidler.

En stærk stimulus for mykobakterielle cellers overgang til en inaktiv tilstand er kemoterapeutiske lægemidler, såvel som faktorer fra værtens immunsystem. Persisterende bakterier kan forblive i læsionerne i måneder eller endda år. Under persistensen kan mykobakterier transformere sig til L-former. I denne form udviser mykobakterier ekstremt lav metabolisk aktivitet, primært rettet mod at øge tykkelsen af cellevæggen og den ekstracellulære matrix, hvilket forhindrer simpel diffusion af stoffer. Derudover akkumulerer mykobakterier genetisk materiale, hvilket øger sandsynligheden for at genskabe en normalt fungerende celle, når gunstige forhold opstår. Detektion af L-former ved standard mikrobiologiske metoder er vanskelig.

Hvis sovende mykobakterier genvinder metabolisk aktivitet og begynder at formere sig under kemoterapi, dør de hurtigt. Hvis kemoterapien afsluttes, fortsætter sådanne "genoplivede" mykobakterier med at formere sig og forårsager et tilbagefald af sygdommen. Dette forklarer begrundelsen for lange kemoterapikure og brugen af efterfølgende korte profylaktiske, normalt sæsonbestemte, kemoprofylaksekure.

Mykobakteriernes fysiologi

I prokaryoternes rige er mykobakterier de ubestridte ledere inden for syntese af komplekse organiske forbindelser. De har sandsynligvis den mest fleksible metabolisme, hvilket giver den nødvendige variation for overlevelse både i det ydre miljø og i makroorganismen. Til dato er der beskrevet mere end 100 enzymatiske reaktioner, hvilket viser den forgrenede og komplekse natur af mykobakteriers metabolisme. For at syntetisere de endelige forbindelser eller tilvejebringe de nødvendige fysiologiske funktioner i mykobakterier kan parallelle metaboliske veje udføres afhængigt af tilgængeligheden af substratet, det kemiske miljø, tilvejebringelsen af respirationscyklusser med de nødvendige komponenter (metalioner, partialtryk af ilt, kuldioxid osv.).

Biokemiske egenskaber af mykobakterier

[ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ]

Lipidmetabolisme

Cellevægslipider, som udgør op til 60% af cellens tørmasse, bestemmer mykobakteriernes ikke-standardiserede tinktoriale, fysiologiske og økologiske egenskaber.

De specifikke lipider af mykobakterier, der er beskrevet til dato, er opdelt i 7 hovedgrupper i henhold til strukturelle egenskaber:

1. fedtsyrederivater af kulhydrater (primært trehalose - cordfaktor):
2. Phosphatidyl myoinositol mannosider:
3. fedtsyrederivater af peptider;
4. N-acylpeptidglykosider - mykosider C;
5. fedtsyreestere af phthioceroler;
6. mykosider A, B. G;
7. glycerolmykolater.

Lipider fra gruppe 4-6 findes kun i mykobakterier.

Blandt de unikke er det værd at bemærke tuberkulostearinsyre og tuberkulopalmitinsyre, som er forstadier til mycolsyre.

Mycolsyrer er en gruppe af højmolekylære fedtsyrer med en kædelængde på op til 84 kulstofatomer, hvis struktur af hovedkæden bestemmes af mikroorganismens systematiske position og dens vækstbetingelser. Deres lave reaktivitet sikrer høj kemisk resistens af mykobakteriers cellevæg. Mycolater undertrykker enzymatisk spaltning af cellevæggen og frie radikalreaktioner.

Cordfaktor klassificeres som en lipidgruppe 1. Den er forbundet med høj toksicitet af mykobakterier og virulens.

Overfladeaktive lipider, eller sulfolipider, spiller en vigtig rolle i mykobakteriers intracellulære tilpasning. Sammen med cordfaktoren danner de cytotoksiske membranotrope komplekser.

Lipoarabinomannan er en heterogen blanding af højmolekylære lipopolysaccharider: forgrenede polymerer af arabinose og mannose med diacylglycerolderivater af palmitinsyre og tuberkulostearinsyre.

Mykosider C er peptidglykolipider, der danner den ydre membran af mykobakterier, som kan observeres under elektronmikroskopi som en transparent zone i cellernes periferi. Mykosider er artsspecifikke forbindelser. Mykobakteriernes antigene egenskaber afhænger af deres type.

Den kvantitative og kvalitative sammensætning af lipidforbindelser i mykobakterier er dynamisk og afhænger af cellernes alder, næringsmediets sammensætning og miljøets fysisk-kemiske egenskaber. Unge mykobakterieceller begynder at danne en cellevæg ved at syntetisere lipopolysaccharider med relativt korte alifatiske kæder. På dette stadie er de ret sårbare og tilgængelige for immunsystemet. Efterhånden som cellevæggen vokser, og der dannes højmolekylære lipider, erhverver mykobakterier resistens og ligegyldighed i deres interaktioner med immunsystemet.

Kulhydratmetabolisme

Den mest foretrukne kulstofkilde for mykobakterier er glycerol.

De vigtigste kulhydrater er arabinose, mannose og maltose, som udgør mere end halvdelen af alle saccharider. Derudover spiller trehalose, glukose, fruktose, galactose, rhamnose og nogle andre saccharider en rolle i cellens vitale aktivitet. I dette tilfælde sker syntesen langs hydrolase- og aldolase-vejene. Pyruvatvejen bruges til at syntetisere glykogen. Arabinose og mannose deltager i dannelsen af vigtige strukturelle forbindelser. Pentosefosfatvejen i glukoseoxidationen bruges til at opnå energi. Den leveres af enzymerne malat-, isocitrat- og succinatdehydrogenaser, hvilket giver fleksibilitet til åndedrætssystemet.

Glyoxylat-signalvejen, som mykobakterier bruger til at inkorporere frie fedtsyrer, der akkumuleres under mykobakteriel vækst, i tricarboxylsyrecyklussen, er unik. Denne cyklus har tiltrukket sig forskeres opmærksomhed som en mulig mekanisme for mykobakteriel kemotaksi under persistens.

Kvælstof- og aminosyremetabolisme

Mykobakteriers udnyttelsesgrad af nitrater, nitritter og hydroxylaminer kan bruges til at identificere arter. Mykobakterier foretrækker asparagin som nitrogenkilde. Syntesen af aminosyrer er en energiafhængig proces og varetages af en gruppe enzymer, der tillader brugen af andre aminosyreforbindelser, såsom glutamat.

Nitrit- og nitratreduktaseaktivitet

Mycobacterium tuberculosis kan danne adenosintrifosfat (ATP) ved at overføre elektroner langs en kæde af bærere, der ender med NO3- _i stedet for O2 _. Disse reaktioner reducerer NO3 _til NH3 _i mængder, der er nødvendige for syntesen af aminosyrer, purin- og pyrimidinbaser. Dette opnås gennem den sekventielle virkning af nitrat- og nitritreduktaser.

Katalase- og peroxidaseaktivitet

Katalase forhindrer ophobning af hydrogenperoxid, som dannes under aerob oxidation af reducerede flavoproteiner. Enzymaktiviteten afhænger af mediets pH og temperaturen. Ved en temperatur på 56 °C er katalase ikke aktiv. Der findes tests for tilhørsforhold til det patogene kompleks af mykobakterier, baseret på katalasens termolabilitet.

Det er kendt, at 70% af Mycobacterium tuberculosis-stammer, der er resistente over for isoniazid, mister deres katalase- og peroxidaseaktivitet.

Peroxidase- og katalaseaktivitet udføres af det samme enzymkompleks.

[ 11 ], [ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ]

Vitaminer og coenzymer

M. tuberculosis indeholder B-vitaminer (riboflavin, pyridoxin, cyanocobalamin, thiamin), C- og K-vitamin, para-aminobenzoesyre, pantothensyre og nikotinsyre, biotin og folsyre.

Mykobakteriers metabolisme, ernæring og respiration

Under normale, gunstige forhold er mykobakterier tuberkulose strengt aerobe og mesofile, dvs. de vokser i nærvær af ilt og i temperaturområdet 30-42 ^° C, bedst ved 37 ^° C. Under ugunstige ydre forhold og/eller iltmangel manifesterer mykobakterier tuberkulose sig som mikroaerofile og endda som anaerobe. I dette tilfælde undergår deres metabolisme betydelige ændringer.

_{Med hensyn til iltforbrug og udvikling af oxidasesystemer ligner mykobakterier ægte svampe. Vitamin K9} fungerer som et bindeled mellem NADH-dehydrogenase og cytokrom b i overføringssystemet hos slægten Mycobacterium. Dette cytokromsystem ligner det mitokondrielle. Det er følsomt over for dinitrophenol, ligesom i højere organismer.

Den beskrevne type respiration er ikke den eneste kilde til ATP-dannelse. Ud over O2 terminalen kan mykobakterier bruge respirationskæder, der overfører elektroner og ender med nitrater (NO3- ₎^. Reserven i mykobakteriernes respirationssystem er glyoxylatcyklussen.

Anoxisk (endogen) respiration, som forekommer i en atmosfære med en iltkoncentration på mindre end 1%, stimuleres af azidforbindelser, som reducerer oxidationen af pyruvat eller trehalose.

Vækst og reproduktion af mykobakterier

Mycobacterium tuberculosis formerer sig ekstremt langsomt: fordoblingsperioden er 18-24 timer (normale bakterier deler sig hvert 15. minut). Derfor kræves der mindst 4-6 uger for at opnå synlig vækst af typiske kolonier. En af årsagerne til mykobakteriernes langsomme reproduktion anses for at være deres udtalte hydrofobicitet, hvilket komplicerer diffusionen af næringsstoffer. Det er mere sandsynligt, at dette er genetisk bestemt og er forbundet med en mere kompleks struktur af mykobakterier. Det er for eksempel kendt, at de fleste bakterier har flere kopier af den ribosomale ribonukleinsyre (rRNA) operon. Langsomt voksende mykobakterier (M. tuberculosis, M. leprae) har én kopi af operonen, og hurtigtvoksende (M. smegmatis) - kun to kopier.

Når mykobakterier dyrkes i flydende medier, vokser de på overfladen. Den fine, tørre film tykner med tiden, bliver ujævn og rynket og får et gulligt skær, ofte sammenlignet med elfenbensfarven. Bouillonen forbliver transparent, og diffus vækst kan kun opnås i nærvær af detergenter, såsom Tween-80. I mikrokolonier (dvs. i de tidlige stadier) dannes strukturer, der ligner bundter - et træk forbundet med navelstrengsfaktoren hos M. tuberculosis.

Genetik af mykobakterier

Slægten Mycobacterium er genetisk meget forskelligartet. I modsætning til mange saprofytiske og ikke-tuberkuløse mykobakterier indeholder Mycobacterium tuberculosis ikke ekstrakromosomale inklusioner (f.eks. plasmider). Hele Mycobacterium tuberculosis' mangfoldighed af egenskaber bestemmes af dens kromosom.

M. tuberculosis-kompleksets genom er ekstremt konservativt. Dets repræsentanter har DNA-homologi på niveauet 85-100%, mens DNA'et fra andre mykobakteriearter kun er homologt med M. tuberculosis med 4-26%.

Repræsentanter for slægten Mycobacteria har store genomer sammenlignet med andre prokaryoter - 3,1-4,5x109 ^Da. Imidlertid er genomerne for patogene arter mindre end for andre mycobakterier (hos M. tuberculosis - 2,5x109 ^Da ). Den klassiske årsag til human tuberkulose, M. tuberculosis, har flere gener end M. africanum og M. bovis, som har mistet noget af deres genetiske materiale under evolutionen.

I 1998 blev nukleotidsekvensen for kromosomet i H37Rv-stammen af M. tuberculosis offentliggjort. Dens længde er 4.411.529 basepar. Kromosomet i tuberculosis-mycobacterium har en ringstruktur. Det indeholder omkring 4.000 gener, der koder for proteiner, samt 60 kodende for funktionelle RNA-komponenter: en unik ribosomal RNA-operon, 10Sa RNA, der deltager i nedbrydningen af proteiner med atypisk matrix-RNA, 45 transport-RNA (tRNA) og mere end 90 lipoproteiner.

Mere end 20% af genomet er optaget af gener for cellevæggens fedtsyremetabolisme, herunder mycolsyrer, glycinrige sure polypeptider (PE- og PPE-familier), kodet af polymorfe regioner i henholdsvis PGRS-genomet (Polymorphic GC-rich repetitive sequence) og MPTR-genomet (Major polymorphic tandem repeat) (den femte og fjerde ring på det genomiske kromosomkort). Variabiliteten af disse genomregioner sikrer forskelle i antigener og evnen til at hæmme immunresponset. Genomet for Mycobacterium tuberculosis indeholder i vid udstrækning gener, der kontrollerer virulensfaktorer.

Mycobacterium tuberculosis syntetiserer alle de komponenter, der er nødvendige for metabolismen: essentielle aminosyrer, vitaminer, enzymer og cofaktorer. Sammenlignet med andre typer bakterier har M. tuberculosis øget aktivitet af lipogenese-enzymer. To gener koder for hæmoglobinlignende proteiner, der fungerer som antioxidantbeskyttere eller fælder for overskydende cellulær ilt. Disse egenskaber muliggør hurtig tilpasning af Mycobacterium tuberculosis til pludselige ændringer i miljøforholdene.

Et karakteristisk træk ved M. tuberculosis-kompleksets genom er et stort antal gentagne DNA-sekvenser. Kromosomet i M. tuberculosis H37Rv indeholder således op til 56 kopier af IS-elementer (insertionssekvenser), som giver DNA-polymorfi af Mycobacterium tuberculosis. De fleste af dem, med undtagelse af IS6110-elementet, er uændrede. Kromosomerne i forskellige stammer af Mycobacterium tuberculosis indeholder normalt fra 5 til 20 kopier af IS6110, men der er stammer, der ikke har dette element. Sammen med IS-elementer indeholder genomet flere typer korte nukleotidgentagelser (PGRS og MPTR), samt direkte gentagelser DR (Direct Repeat), der er placeret i DR-regionen og adskilt af variable sekvenser - spacere (den sjette ring på kromosomkortet). Forskelle i antallet af kopier og lokalisering på kromosomet af disse genetiske elementer bruges til at differentiere stammer af Mycobacterium tuberculosis i molekylær epidemiologi. De mest avancerede metoder til genotypning af mykobakterier er baseret på detektion af genomisk polymorfi forårsaget af IS6110-elementet, såvel som DR og deres spacere. Det er karakteristisk, at divergensen af M. tuberculosis-arten som regel opstår på grund af rekombinationer mellem kopier af IS6110-elementet, som flankerer forskellige gener.

To profager, phiRv1 og phiRv2, blev fundet i H37Rv-genomet. Ligesom det polymorfe Dral-sted er de sandsynligvis forbundet med patogenicitetsfaktorer, da disse regioner af genomet adskiller sig fra lignende regioner af de avirulente stammer af M. tuberculosis H37Ra og M. bom BCG. Regioner af genomet (mutT, ogt-gener), der er ansvarlige for en stigning i mutationsraten og tilpasningen af mycobacteria tuberculosis under pressede forhold, blev identificeret. Opdagelsen af triggergener for dvaletilstanden af mycobacteria tuberculosis ændrede konceptet om latent tuberkuloseinfektion.

Undersøgelse af polymorfi af gener, der koder for katalase, peroxidase og A-underenheden af DNA-gyrase. Tre genotypiske grupper blev identificeret i M. tuberculosis-komplekset. Den ældste (fra et evolutionært synspunkt) er gruppe I: M. africanum, M. bovis, M. tuberculosis og M. microti. Gruppe II og III omfatter forskellige stammer af M. tuberculosis, som er blevet udbredt i nogle geografiske områder. Klonal adfærd er karakteristisk for gruppe I og II, og stammer af gruppe III forårsager ekstremt sjældent massesygdomme. Genetiske familier af M. tuberculosis, som fik navnene Haarlem, Afrika og Filippinerne, er udbredt i forskellige regioner af verden.

En særlig plads indtages af Beijing-familien, som først blev identificeret i histologiske præparater af lungevæv fra patienter i forstæderne til Beijing i 1956-1990. Til dato er stammer af denne familie blevet fundet i asiatiske lande, Sydafrika, Caribien og USA. Spredningen af denne genotype i forskellige områder bestemmes af de etniske karakteristika hos den indfødte befolkning og migranter. For nylig er der blevet indsamlet data om spredningen af stammer af SI/Beijing-genotypen i den nordvestlige del af den europæiske del af Rusland (Sankt Petersborg) og i regionerne Sibirien.

Mykobakteriel resistens

Under udviklingen har tuberkulose-mykobakterier udviklet forskellige mekanismer til at overvinde eller inaktivere ugunstige miljøfaktorer. For det første er der tale om en kraftig cellevæg. For det andet er der tale om omfattende metaboliske evner. De er i stand til at inaktivere mange cellulære toksiner og stoffer (forskellige peroxider, aldehyder og andre), der ødelægger cellemembranen. For det tredje er der tale om morfologisk plasticitet, som består i transformationen af mykobakterier (dannelsen af L-former af inaktive celler). Med hensyn til deres stabilitet indtager de efter sporedannende bakterier en førende plads i prokaryoternes rige.

Patogenet forbliver levedygtigt i tør tilstand i op til 3 år. Ved opvarmning kan tuberkulosemykobakterier modstå temperaturer betydeligt højere end 80°C. I dag menes det, at tuberkulosemykobakterier, der findes i sputum, forbliver levedygtige, når sidstnævnte koges åbent i 5 minutter.

Mycobacterium tuberculosis er resistent over for organiske og uorganiske syrer, alkalier, mange oxidationsmidler samt en række antiseptiske og dehydrerende stoffer, der har en skadelig virkning på andre patogene mikroorganismer. Mycobacterium udviser resistens over for virkningerne af alkoholer og acetone.

Det bemærkes, at produkter baseret på kvaternært ammonium ikke udviser antituberkuloseaktivitet. Under visse betingelser har koncentrationer af klor og iltradikaler på op til 0,5% heller ikke en skadelig virkning på tuberkulosemykobakterier. Dette indebærer, at det er umuligt at bruge sådanne produkter til at sterilisere sputum og andet inficeret biologisk materiale.

Mycobacterium tuberculosis er ufølsom over for diffust sollys og kan eksistere i det ydre miljø i mere end et år uden at miste sin levedygtighed. Kortbølget ultraviolet stråling har en universel bakteriedræbende virkning på alle mikroorganismer. Men under reelle forhold, når Mycobacterium tuberculosis er suspenderet i form af cellulære agglomerater med støvpartikler, øges deres modstandsdygtighed over for ultraviolet stråling.

Den høje overlevelsesrate for tuberkulosemykobakterier bidrager til den ekstremt udbredte spredning af denne infektion i befolkningen uanset klimatiske forhold. Dette er dog ikke den eneste faktor, der bidrager til globaliseringen af problemet - tuberkulosemykobakterier kan overleve i menneskekroppen i lang tid og genaktiveres med ubegrænsede intervaller.

Lokalisering af tuberkulose-mykobakterien inde i makrofager giver tilstrækkelig substratstabilitet, idet der tages højde for mononukleære fagocytters "levetid" og varigheden af mykobakteriel replikation, samt isolering fra humorale immunitetseffektorer. Samtidig vælger patogenet en biotop, der er uacceptabel for de fleste mikroorganismer på grund af dens potentielle fare. Denne symbiose sikres af en række adaptive mekanismer hos mykobakterier.

Processen med makrofagskade og parasitisme i den ser sådan ud: penetration af mykobakterier i makrofagen uden dens aktivering; undertrykkelse af dannelsen af fagolysosomer eller deres transformation til en zone, der er behagelig for bakterier; gennembrud fra fagosomer ind i cytoplasmaet med inaktivering af antimikrobielle faktorer; interferens med cellens vitale aktivitet; svækkelse af makrofagernes følsomhed over for aktiverende signaler fra T-lymfocytter; reduktion af makrofagernes antigenpræsenterende funktion og den tilhørende svækkelse af reaktionerne fra cytotoksiske T-lymfocytter, der er konfigureret til at ødelægge inficerede celler.

Cellevæggens egenskaber spiller naturligvis en vigtig rolle i at sikre dette, såvel som metaboliske og funktionelle evner. Ved første kontakt med mykobakterier er makroorganismens immunsystem ikke i stand til at aktivere humoral immunitet, hurtigt neutralisere og eliminere cellen fra kroppen, da de mobile alifatiske kæder i mykobakterievæggen ikke tillader en vurdering af patogenets overfladestrukturer og overfører den relevante information til syntesen af det nødvendige sæt antistoffer.

Mykobakteriernes høje hydrofobicitet sikrer ikke-specifik, dvs. receptoruafhængig, kontakt med makrofager. Ved at danne et fagosom omkring mykobakteriecellen placerer makrofagen den i sig selv. Overflademykosid- og lipoarabinomannan-komplekser kan genkendes af receptorer, men de signaler, der udløses gennem dem, aktiverer ikke eller aktiverer svagt makrofager. Som følge heraf ledsages fagocytose ikke af frigivelse af frie radikalformer af ilt og nitrogen. Det menes, at dette er mere karakteristisk for virulente stammer af M. tuberculosis, som på grund af lipoarabinomannans strukturelle egenskaber initierer "ikke-aggressiv" fagocytose. Andre makrofagreceptorer, især CD 14 og receptorer for komplementkomponenten C3 (CR1-CR3), deltager også i genkendelsen af M. tuberculosis.

Efter at have trængt ind i makrofagen indeholder mykobakteriet en række mekanismer, der forhindrer dannelsen af fagolysosomet: produktionen af ammonium, som alkaliserer miljøet inde i fagosomet, syntesen af sulfolipider, hvilket fører til dannelsen af en negativ ladning på overfladen af fagosomet, hvilket forhindrer fusionen af fagosomet og lysosomet.

Hvis der dannes et fagolysosom, er mykobakterien, takket være sin kraftige voksagtige skal, i stand til at dæmpe frie radikalreaktioner forårsaget af bakteriedræbende stoffer i fagocytter. Ammonium alkaliserer miljøet, blokerer aktiviteten af lysosomale enzymer, og sulfolipider neutraliserer membranotrope kationiske proteiner. Derudover producerer tuberkulosemykobakterier meget aktive enzymer med katalase- og peroxidaseaktivitet, som konkurrerer med makrofagernes peroxidasesystemer og samtidig inaktiverer lysosomhydroperoxider. Alt dette øger mykobakteriernes resistens over for oxidativ stress.

Yderligere tilpasning af mykobakterier består i at bruge jernholdige forbindelser fra makrofager til deres enzymsystemer og blokere makrofagernes immunspecifikke funktioner. Makrofager er et af de vigtigste reservoirer af jern, hvis overskud akkumuleres i form af ferritin. Jernindholdet i alveolære makrofager er 100 gange højere end i blodmonocytter, hvilket helt sikkert bidrager til deres kolonisering af tuberkulosemykobakterier.

Mykobakterier udøver toksiske virkninger på makrofager ved hjælp af endotoksiner og ikke-specifikke faktorer. Begge påvirker primært makrofagernes åndedrætssystem - mitokondrier. Endotoksiner omfatter mykoliske arabinolipider, som hæmmer mitokondrie-respiration. Ikke-specifikke toksiner omfatter produkter fra syntesen af lipiddelen af den mykobakterielle celle - fthien og fthionsyrer, som forårsager afkobling af oxidativ fosforylering. Øgede metaboliske processer under disse forhold ledsages ikke af korrekt ATP-syntese. Værtscellerne begynder at opleve energimangel, hvilket fører til hæmning af deres vitale aktivitet og efterfølgende til cytolyse og apoptose.

Det er muligt, at nogle patogenicitetsfaktorer kun dannes inde i inficerede celler, som det er tilfældet med andre bakterier, der foretrækker en intracellulær livsstil. For eksempel udtrykker salmonella, der parasiterer inde i makrofager, yderligere mere end 30 gener. Trods den fuldstændige beskrivelse af tuberkulose-mykobakteriens genom er 30% af kodonerne relateret til proteiner med ukendte egenskaber.

Lægemiddelresistens af mykobakterier

Fra et klinisk synspunkt bestemmer en mikroorganismes lægemiddelfølsomhed, om standardkemoterapi med det angivne lægemiddel kan bruges til at behandle sygdommen forårsaget af den isolerede stamme. Resistens "forudsiger behandlingssvigt med det lægemiddel, der testes". Med andre ord undertrykker brugen af standardkemoterapi, der resulterer i en systemisk lægemiddelkoncentration, der normalt er effektiv under normale forhold, ikke spredningen af "resistente mikroorganismer".

Inden for mikrobiologi er definitionen af lægemiddelfølsomhed eller lægemiddelresistens baseret på populationstilgangen, hvilket indebærer forskellige grader af resistens i en pulje (heterogent sæt) af mikrobielle celler. Lægemiddelresistens vurderes ud fra kvantitative karakteristika, såsom den "minimale hæmmende koncentration" (MIC). For eksempel dør 90 % af mikroorganismerne ved MIC-90 (bakteriostatisk koncentration). Resistens bør derfor forstås som dens grad i en del af den mikrobielle population, hvilket i de fleste tilfælde forudbestemmer behandlingens svigt. Det er generelt accepteret, at 10 % af resistente stammer blandt en patients samlede mikrobielle population kan have en patogen effekt. Inden for ftisiobakteriologi er det for førstelinjebehandling mod tuberkulose 1 %. eller 20 kolonidannende enheder - CFU). En sådan del af den mikrobielle population er i stand til at fortrænge den oprindelige på en måned og danne en læsion. For andenlinjebehandling mod tuberkulose er kriteriet for resistens en stigning på 10 % i den mikrobielle population.

Udviklingen af lægemiddelresistens i mikroorganismer er forbundet med selektion i nærvær af et antibiotikum og med den præferentielle overlevelse af en del af den mikrobielle population, der har beskyttelsesmekanismer mod det antibakterielle middel. Hver population indeholder et lille antal mutante celler (normalt 10⁶ ^- 10⁶ ⁾, der er resistente over for et bestemt lægemiddel. Under kemoterapi dør følsomme mikrobielle celler, og resistente celler formerer sig. Som følge heraf erstattes følsomme celler af resistente celler.

Mykobakterier har i starten høj naturlig resistens over for mange bredspektrede antibakterielle lægemidler, men forskellige arter har forskellige spektre og grader af denne følsomhed.

Ægte naturlig resistens forstås som en permanent artsspecifik egenskab ved mikroorganismer forbundet med fraværet af et mål for et antibiotikums virkning eller målets utilgængelighed på grund af cellevæggens initialt lave permeabilitet, enzymatisk inaktivering af stoffet eller andre mekanismer.

Erhvervet resistens er individuelle stammers evne til at forblive levedygtige ved antibiotikakoncentrationer, der undertrykker væksten af hovedparten af den mikrobielle population. Erhvervelse af resistens er i alle tilfælde genetisk bestemt: fremkomsten af ny genetisk information eller en ændring i ekspressionsniveauet af ens egne gener.

I øjeblikket er der opdaget forskellige molekylære mekanismer for resistens over for Mycobacterium tuberculosis:

• antibiotikainaktivering (enzyminaktivering), for eksempel ved β-laktamaser;
• ændring af virkningsmålet (ændring i proteinets rumlige konfiguration på grund af mutation i den tilsvarende region af genomet):
• hyperproduktion af målet, hvilket fører til en ændring i forholdet mellem agent og mål og frigivelse af en del af bakteriens livsopretholdende proteiner;
• aktiv fjernelse af lægemidlet fra den mikrobielle celle (efflux) på grund af aktivering af stressforsvarsmekanismer:
• ændringer i permeabilitetsparametrene for de eksterne strukturer i den mikrobielle celle, hvilket blokerer antibiotikumets evne til at trænge ind i cellen;
• inkludering af en "metabolisk shunt" (bypass-metabolisk vej).

Ud over den direkte indvirkning på mikrobielle cellers metabolisme fører mange antibakterielle lægemidler (benzylpenicillin, streptomycin, rifampicin) og andre ugunstige faktorer (immunsystemets biocider) til forekomsten af ændrede former for mykobakterier (protoplaster, L-former) og overfører også celler til en dvaletilstand: intensiteten af cellemetabolismen falder, og bakterien bliver ufølsom over for antibiotikumets virkning.

Alle mekanismer danner forskellige grader af resistens, hvilket giver resistens over for forskellige koncentrationer af kemoterapimedicin, så fremkomsten af resistens hos bakterier er ikke altid ledsaget af et fald i antibiotikaens kliniske effektivitet. For at vurdere behandlingens effektivitet og prognose er det vigtigt at kende graden af resistens.

På nuværende tidspunkt er der for hvert førstelinjelægemiddel mod tuberkulose og for de fleste reservelægemidler blevet identificeret mindst ét gen. Specifikke mutationer, der fører til udvikling af resistente varianter af mykobakterier. I den udbredte fordeling af lægemiddelresistens hos mykobakterier er en høj mutationsrate in vivo vigtig, højere end in vitro.

[ 16 ], [ 17 ], [ 18 ], [ 19 ], [ 20 ], [ 21 ], [ 22 ], [ 23 ], [ 24 ], [ 25 ]

Typer af lægemiddelresistens hos mykobakterier

Der skelnes mellem primær og erhvervet lægemiddelresistens. Mikroorganismer med primær resistens omfatter stammer isoleret fra patienter, der ikke har modtaget specifik behandling, eller som har modtaget medicin i en måned eller mindre. Hvis det er umuligt at afklare, om der anvendes antituberkulosemedicin, anvendes udtrykket "initial resistens".

Primær lægemiddelresistens er af stor klinisk og epidemiologisk betydning, og derfor er det for en korrekt vurdering nødvendigt ikke at give kemoterapi til en nydiagnosticeret patient med tuberkulose før mikrobiologisk undersøgelse af det diagnostiske materiale. Hyppigheden af primær lægemiddelresistens beregnes som forholdet mellem antallet af nydiagnosticerede patienter med primær resistens og antallet af alle nydiagnosticerede patienter, der er blevet testet for lægemiddelfølsomhed i løbet af året. Hvis en resistent stamme isoleres fra en patient under antituberkulosebehandling, der er givet i en måned eller mere, betragtes resistensen som erhvervet. Hyppigheden af primær lægemiddelresistens karakteriserer den epidemiologiske tilstand af tuberkulosepatogenpopulationen.

Erhvervet lægemiddelresistens blandt nydiagnosticerede patienter er resultatet af mislykket behandling (forkert valg af lægemidler, manglende overholdelse af behandlingen, reduktion af lægemiddeldoser, uensartet levering og lægemidlernes dårlige kvalitet). Disse faktorer fører til et fald i den systemiske koncentration af lægemidler i blodet og deres effektivitet, samtidig med at de "udløser" forsvarsmekanismer i mykobakterielle celler.

Til epidemiologiske formål beregnes hyppigheden af tidligere behandlede tilfælde. Til dette formål tages patienter, der er registreret til genbehandling efter et mislykket kemoterapiforløb eller tilbagefald, i betragtning. Forholdet mellem antallet af resistente Mycobacterium tuberculosis-kulturer og antallet af alle stammer, der er testet for lægemiddelresistens i løbet af året blandt patienter i denne gruppe på tidspunktet for deres registrering, beregnes.

I strukturen af lægemiddelresistens hos Mycobacterium tuberculosis skelnes følgende:

Monoresistens - resistens over for et af antituberkuloselægemidlerne, følsomhed over for andre lægemidler bevares. Ved kompleks terapi påvises monoresistens ret sjældent og som regel over for streptomycin (i 10-15% af tilfældene blandt nydiagnosticerede patienter).

Polyresistens er resistens over for to eller flere lægemidler.

Multipel lægemiddelresistens er resistens over for isoniazid og rifampicin samtidigt (uanset tilstedeværelsen af resistens over for andre lægemidler). Det ledsages normalt af resistens over for streptomycin osv. I øjeblikket er multipel lægemiddelresistens (MDR) hos tuberkulosepatogener blevet et epidemiologisk farligt fænomen. Beregninger viser, at påvisning af patogener med MDR i mere end 6,6% af tilfældene (blandt nydiagnosticerede patienter) kræver en ændring i strategien for det nationale antituberkuloseprogram. Ifølge data fra overvågning af lægemiddelresistens varierer hyppigheden af MDR blandt nydiagnosticerede patienter fra 4 til 15%, blandt tilbagefald - 45-55%, og blandt tilfælde af mislykket behandling - op til 80%.

Superresistens er multipel lægemiddelresistens kombineret med resistens over for fluorquinoloner og et af de injicerbare lægemidler (kanamycin, amikacin, capreomycin). Tuberkulose forårsaget af stammer med superresistens udgør en direkte trussel mod patienters liv, da andre andenlinjebehandlinger mod tuberkulose ikke har en udtalt antibakteriel effekt. Siden 2006 har nogle lande organiseret overvågning af spredning af mykobakteriestammer med superresistens. I udlandet betegnes denne MDR-variant normalt som XDR.

Krydsresistens er, når resistens over for ét lægemiddel fører til resistens over for andre lægemidler. Ved M. tuberculosis er mutationer forbundet med resistens normalt ikke indbyrdes forbundne. Udviklingen af krydsresistens skyldes ligheden i den kemiske struktur af nogle antituberkuloselægemidler. Krydsresistens påvises især ofte inden for én gruppe af lægemidler, såsom aminoglykosider. For at forudsige krydsresistens er genetiske undersøgelser af mykobakterielle kulturer nødvendige i kombination med mikrobiologiske undersøgelser af resistens.

Ikke-tuberkuløse mykobakterier

Ikke-tuberkuløse mykobakterier overføres yderst sjældent fra person til person. Hyppigheden af isolering af nogle af deres arter fra materiale fra patienter er sammenlignelig med hyppigheden af isolering af disse arter fra miljøgenstande. Infektionskilder kan være husdyr og fugle, uforarbejdede produkter. Mykobakterier findes i slagtemateriale og kvægmælk.

Ifølge bakteriologiske laboratorier var prævalensen af ikke-tuberkuløse mykobakterier i 2004-2005 0,5-6,2% blandt alle mykobakterier hos nydiagnosticerede patienter. Hyppigheden kan sandsynligvis være noget højere, da den anvendte metode til at bearbejde det diagnostiske materiale ikke er optimal for ikke-tuberkuløse mykobakterier. Saprofytiske mykobakterier kan være til stede i det diagnostiske materiale, hvis indsamlingsreglerne ikke følges, eller på grund af materialets egenskaber (for eksempel kan M. smegmatis isoleres fra urinen hos mandlige patienter).

I denne henseende er det vigtigt gentagne gange at bekræfte den påviste type mykobakterier fra patientens materiale.

Mykobakterier påvirker huden, blødt væv og kan også forårsage mykobakteriose i lungerne, hvilket er særligt almindeligt i immundefekttilstande. Ved lungelokalisering opdages det oftere hos ældre mænd med en historie med kroniske lungesygdomme, herunder svampelæsioner.

Af alle mykobakterier er M. avium-intracellularae-komplekset den mest almindelige årsag til pulmonal mykobakteriose hos mennesker. Det forårsager sygdomme i lungerne, perifere lymfeknuder og disseminerede processer. I den nordlige del af Europa forekommer omkring 60% af pulmonale mykobakterier. Fibrokavernøse og infiltrative processer dominerer og har et kronisk forløb på grund af høj resistens over for antituberkulosemedicin.

M. kansasii er årsagen til kronisk lungesygdom, der ligner tuberkulose. Kemoterapi er mere effektiv på grund af M. kansasis højere følsomhed over for antibakterielle lægemidler. M. xenopi og M. malmoense forårsager primært kroniske lungesygdomme. De kan forurene varmt- og koldtvandsforsyningssystemer. M. malmoens' levesteder er ikke fuldt ud fastlagt. M. xenopi udviser ret god følsomhed over for antituberkulosebehandling. M. malmoense udviser ret høj følsomhed over for antibiotika in vitro, men konservativ behandling er ofte ineffektiv og endda dødelig. M. fortuitum og M. chelonae er anerkendt som årsager til knogle- og bløddelssygdomme på grund af direkte kontaminering af et sår under traumer, kirurgi og penetrerende skader. De forårsager op til 10% af lungemykobakterier. Det forekommer som en kronisk destruktiv bilateral læsion, ofte dødelig. Antituberkuloselægemidler og bredspektrede antibiotika er ikke aktive eller har ringe aktivitet mod disse typer mykobakterier.

I de sydlige regioner er mykobakterier i hud og blødt væv forårsaget af M. leprae og M. ulceranse udbredt. Identifikation af ikke-tuberkuløse mykobakterier udføres i laboratorierne hos landets førende anti-tuberkuloseinstitutioner. Dette kræver høje kvalifikationer og godt laboratorieudstyr.