Krystalaflejringernes rolle i patogenesen af osteoartritis

Basiske calciumfosfat (BCP) krystaller findes i synovialvæsken hos 30-60% af patienter med slidgigt. Ifølge A. Swan et al. (1994) findes calciumholdige krystaller i synovialvæsken hos et langt større antal patienter med slidgigt. På grund af krystallernes ekstremt lille størrelse eller deres lille antal identificeres de dog ikke ved hjælp af konventionelle teknikker. Tilstedeværelsen af BCP-krystaller i synovialvæsken korrelerer med radiografiske tegn på ledbruskdegeneration og er forbundet med et større volumen af effusion sammenlignet med effusion i knæled uden krystaller. En undersøgelse af faktorer, der påvirker den radiografiske progression af gonartrose, viste, at aflejring af calciumpyrofosfatdihydrat (CPPD) krystaller er en indikator for et ugunstigt klinisk og radiografisk resultat. I en undersøgelse af ældre patienter blev slidgigt fundet at være forbundet med chondrocalcinose, især i knæets laterale tibiofemorale kompartment og de første tre metakarpofalangeale led. Det er ikke ualmindeligt, at begge typer krystaller, OFC og PFC, findes hos patienter med slidgigt.

Klinisk adskiller ledbruskdegeneration forårsaget af calciumkrystalaflejring sig fra den, der ses ved primær slidgigt. Hvis krystaller var et simpelt epifænomen for bruskdegeneration, ville de findes i de led, der oftest er påvirket af primær slidgigt, dvs. knæ, hofter og de små led i hænderne. I modsætning hertil påvirker krystalaflejringssygdomme oftest led, der ikke er typiske for primær slidgigt, såsom skulder, håndled og albue. Tilstedeværelsen af krystaller i ledvæsken (effusionsvæsken) er forbundet med mere alvorlig ledbruskdegeneration. Spørgsmålet om, hvad der er årsagen, og hvad der er virkningen, krystalaflejring eller bruskdegeneration, diskuteres. En mellemliggende position indtages af følgende antagelse: en primær anomali i bruskmetabolismen fører til dens degeneration, og sekundær aflejring af krystaller accelererer dens nedbrydning (den såkaldte amplifikationsløjfeteori).

Den nøjagtige mekanisme, hvorved calciumkrystaller beskadiger ledbrusk, er ukendt og opsummeres nedenfor. Teoretisk set kan calciumkrystaller skade chondrocytter direkte. Histologisk undersøgelse afslører dog sjældent krystaller i nærheden af chondrocytter, og endnu sjældnere indtages de af dem. Den mest sandsynlige mekanisme er fagocytose af krystaller fra synoviale slimhindeceller, efterfulgt af frigivelse af proteolytiske enzymer eller sekretion af cytokiner, der stimulerer chondrocytternes frigivelse af enzymer. Dette koncept understøttes af en undersøgelse af PFKD-induceret synovitis' rolle i udviklingen af hurtigt progressiv slidgigt ved pyrofosfatartropati. I denne undersøgelse blev calciumpyrofosfatdihydratkrystaller (1 eller 10 mg) injiceret ugentligt i højre knæ hos kaniner med slidgigt induceret af partiel lateral meniskektomi. Det viste sig, at efter 8 injektioner viste højre knæled signifikant mere alvorlige ændringer sammenlignet med det venstre. Intensiteten af synovial inflammation korrelerede med intraartikulære injektioner af calciumpyrofosfatdihydratkrystaller og deres dosis. Selvom doserne af CPPD-krystaller, der blev anvendt i dette studie, overstiger dem in vivo, indikerer resultaterne den rolle, som CPPD-induceret inflammation spiller i progressionen af slidgigt ved pyrofosfatartropati.

Potentielle mekanismer for induktion af ledbruskskader forårsaget af calciumholdige krystaller er forbundet med deres mitogene egenskaber, evnen til at inducere MMP'er og stimulere prostaglandinsyntese.

Mitogen effekt af calciumholdige krystaller. Ved krystalassocierede artropatier observeres ofte proliferation af synoviale slimhindeceller, hvor krystallerne selv kun delvist er ansvarlige for denne proces. Stigningen i antallet af synoviale celler ledsages af øget sekretion af cytokiner, som fremmer kondrolyse og inducerer sekretion af proteolytiske enzymer. OFC-krystaller i koncentrationer, der findes i menneskelig ledpatologi, stimulerer dosisafhængigt mitogenesen af hvilende hudfibroblastkulturer og synoviale fibroblaster fra hunde og mus. Krystaller af calciumpyrofosfatdihydrat, urat, sulfat, carbonat og calciumphosphat stimulerer cellevækst. Begyndelsen og toppen af ( ^3H )-thymidin-inkorporering induceret af disse krystaller forskydes med 3 timer sammenlignet med stimulering af celler med blodserum. Denne tidsperiode kan være nødvendig for fagocytose og opløsning af krystaller. Tilsætning af kontrolkrystaller af samme størrelse (f.eks. diamantstøv eller latexpartikler) stimulerede ikke mitogenesen. Natriumuratmonohydratkrystaller havde svage mitogene egenskaber og var signifikant ringere end calciumurats, hvilket indikerer vigtigheden af krystallernes calciumindhold i mitogenesen. Syntetiske OFC-krystaller havde de samme mitogene egenskaber som krystaller opnået fra patienter med chondrocalcinose. Den mitogene effekt af calciumholdige krystaller var ikke et resultat af en stigning i calciumindholdet i det omgivende næringsmedium in vitro, da opløsning af basiske calciumphosphatkrystaller i næringsmediet ikke stimulerede inkorporeringen af ( ^3H )-thymidin af fibroblaster.

En foreslået mekanisme for OFC-induceret mitogenese er, at unormal synovialcelleproliferation i det mindste delvist kan skyldes endocytose og intracellulær opløsning af krystaller, hvilket øger cytoplasmatiske Ca2 ⁺ -koncentrationer og aktiverer den calciumafhængige signalvej, der fører til mitogenese. Dette koncept understøttes af kravet om direkte celle-krystalkontakt for at stimulere mitogenese, da eksponering af cellekulturer for krystaller inducerede cellevækst, mens eksponering af celler berøvet en sådan kontakt ikke gjorde det. For at undersøge kravet om krystalfagocytose efter celle-krystalinteraktion blev celler dyrket med ^45Ca -OPC og ( ^3H )-thymidin. Det blev fundet, at celler indeholdende ^45Ca -OPC inkorporerede signifikant mere ( ^3H )-thymidin end celler uden basisk calciumfosfatmærkning. I makrofagkulturer resulterede hæmning af krystalendocytose med cytochalasin i hæmning af krystalopløsning, hvilket yderligere understreger nødvendigheden af fagocytose.

Calciumholdige krystaller er opløselige i syre. Efter fagocytose opløses krystallerne i det sure miljø i makrofagfagolysosomer. Klorokin, ammoniumchlorid, bafilomycin A1 og alle lysosomotrofe stoffer, der øger lysosomal pH, hæmmer dosisafhængigt intracellulær krystalopløsning og (3H)-thymidinoptagelse ⁱ fibroblaster dyrket med basiske calciumphosphatkrystaller.

Tilsætning af OFC-krystaller til en monolags fibroblastkultur forårsagede en øjeblikkelig tifoldig stigning i intracellulært calcium, som vendte tilbage til baseline efter 8 minutter. Kilden til calcium var overvejende ekstracellulær ion, da de basiske calciumphosphatkrystaller blev tilsat et calciumfrit dyrkningsmedium. Den næste stigning i intracellulær calciumkoncentration blev observeret efter 60 minutter og varede i mindst 3 timer. Her var kilden til calcium fagocyterede krystaller opløst i fagolysosomer.

Det blev konstateret, at den mitogene effekt af OFC-krystaller ligner PDGF's som vækstfaktor; ligesom sidstnævnte udviser OFC-krystaller synergisme med IGF-1 og blodplasma. Blokering af IGF-1 reducerer cellemitogenese som reaktion på OFC. PG Mitchell et al. (1989) viste, at induktion af mitogenese i Balb/c- ₃ T3 fibroblaster _af OFC-krystaller kræver tilstedeværelsen af serin/threonin proteinkinase C (PKC), en af de vigtigste mediatorer af signaler genereret under ekstern stimulering af celler med hormoner, neurotransmittere og vækstfaktorer. Et fald i PKC-aktivitet i Balb/c-3 T3-celler _hæmmerOFC -medieret induktion af proto-onkogenerne c-fos og c-myc, men påvirker ikke stimuleringen af disse onkogener medieret af PDGF.

Stigningen i intracellulært calcium efter opløsning af fagocyterede krystaller er ikke den eneste signalvej for mitogenese. Når vækstfaktorer som PDGF binder til deres membranreceptor, stimuleres fosfolipase C (en fosfodiesterase), som hydrolyserer phosphatidylinositol 4,5-bisphosphat for at danne de intracellulære budbringere inositol-3-phosphat og diacylglycerol. Førstnævnte frigiver calcium fra det endoplasmatiske reticulum ved at modulere aktiviteten af calciumafhængige og calcium/calmodulin-afhængige enzymer såsom proteinkinaser og proteaser.

R. Rothenberg og H. Cheung (1988) rapporterede øget nedbrydning af phosphatidylinositol 4,5-bisphosphat af phospholipase C i kanin-synovialceller som reaktion på stimulering med OFC-krystaller. Sidstnævnte øgede signifikant indholdet af inositol-1-phosphat i celler med mærket ( ^3H )-inositol; toppen blev nået inden for 1 minut og varede i ca. 1 time.

Diacylglycerol er en potentiel aktivator af calciumpyrophosphatdihydrat. Da OFC-krystaller øger phospholipase C-aktiviteten, hvilket fører til akkumulering af diacylglycerol, kan man derfor forvente en stigning i PKC-aktivering. PG Mitchell et al. (1989) sammenlignede virkningerne af OFC-krystaller og PDGF på DNA-syntese af Balb/c- _{3T3fibroblaster}. I cellekultur blev PKC inaktiveret ved inkubation af celler med tumor-understøttende phorbol-diester (TPD), en diacylglycerol-analog. Langvarig stimulering med lave doser af TPD mindskede PKC-aktiviteten, hvorimod en enkelt stimulering med en høj dosis aktiverede den. Stimulering af DNA-syntese af OFC-krystaller blev undertrykt efter PKC-inaktivering, hvilket indikerer vigtigheden af dette enzym i OFC-induceret mitogenese. Tidligere påviste GM McCarthy et al. (1987) en sammenhæng mellem den mitogene respons af humane fibroblaster på OFC-krystaller og PKC-aktivering. OFC-krystaller aktiverer imidlertid ikke phosphatidylinositol 3-kinase eller tyrosinkinaser, hvilket bekræfter, at mekanismen for celleaktivering af OFC-krystaller er selektiv.

Celleproliferation styres af en gruppe gener kaldet proto-onkogener. Proteinerne foe og mye, produkter af proto-onkogenerne c-fos og c-myc, er lokaliseret i cellekernen og bundet til specifikke DNA-sekvenser. Stimulering af 3T3 fibroblaster med OFC-krystaller resulterer i c-fos-ekspression inden for få minutter, som når et maksimum 30 minutter efter stimulering. Induktion af c-myc-transkription af OFC-krystaller eller PDGF sker inden for 1 time og når et maksimum 3 timer efter stimulering. Cellerne opretholder et forhøjet niveau af c-fos- og c-myc-transkription i mindst 5 timer. I celler med inaktiveret PCD undertrykkes stimuleringen af c-fos og c-myc af OFC- eller TFD-krystaller signifikant, mens induktionen af disse gener af PDGF ikke ændres.

Medlemmer af mitogen-aktiveret proteinkinase (MAP K)-familien er nøgleregulatorer af forskellige intracellulære signalkaskader. En underklasse af denne familie, p42/p44, regulerer celleproliferation gennem en mekanisme, der involverer aktivering af proto-onkogenerne c-fos og c-jun. OFC- og PFKD-krystaller aktiverer en proteinkinase-signalvej, der involverer både p42 og p44, hvilket antyder en rolle for denne signalvej i calciumholdige krystalinduceret mitogenese.

Endelig involverer OFC-induceret mitogenese transkriptionsfaktoren nuklear faktor κB (NF-κB), som først blev beskrevet som immunoglobulin κ letkæde (IgK)-genet. Det er en inducerbar transkriptionsfaktor, der er vigtig i mange signalveje, fordi den regulerer ekspressionen af forskellige gener. NF-κB-induktion er normalt koblet med frigivelsen af inhiberende proteiner kaldet IκB fra cytoplasmaet. NF-κB-induktion efterfølges af translokation af den aktive transkriptionsfaktor til kernen. OFC-krystaller inducerer NF-κB i Balb/c- _3T3- fibroblaster og humane hudfibroblaster.

Flere signaltransduktionsveje kan være involveret i signaltransduktion efter NF-κB-aktivering, men alle involverer proteinkinaser, der phosphorylerer (og dermed nedbryder) IκB. Baseret på in vitro-studier blev IκB tidligere antaget at fungere som et substrat for kinaser (f.eks. PKC og proteinkinase A). Imidlertid er et IκB-kinasekompleks med stor molekylvægt for nylig blevet identificeret. Disse kinaser phosphorylerer specifikt serinrester af IκB. NF-κB-aktivering af TNF-α og IL-1 kræver effektiv virkning af NF-κB-inducerende kinase (NIK) og IκB-kinase. Den molekylære mekanisme for NIK-aktivering er i øjeblikket ukendt. Selvom OFC-krystaller aktiverer både PKC og NF-κB, er det ukendt, i hvilket omfang disse to processer kan være forbundet. Da GκB-kinasemodifikation sker via phosphorylering, kan en rolle for PKC i induktionen af NF-κB af OFC-krystaller via phosphorylering og aktivering af GκB-kinase ikke udelukkes. Dette koncept understøttes af hæmningen af OFC-krystal-induceret mitogenese og NF-κB-ekspression af PKC-hæmmeren staurosporin. Tilsvarende kan staurosporin hæmme GκB-kinase og dermed hæmme proteinkinase A og andre proteinkinaser.

Mekanismen for OFC-krystal-induceret mitogenese i fibroblaster omfatter således mindst to forskellige processer:

• en hurtig membranbundet begivenhed, der resulterer i aktivering af PKC og MAP K, induktion af NF-κB og proto-onkogener,
• langsommere intracellulær opløsning af krystaller, hvilket fører til en stigning i det intracellulære indhold af Ca2 ⁺, og derefter til aktivering af en række calciumafhængige processer, der stimulerer mitogenese.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ]

Induktion med MMP-calciumholdige krystaller

Mediatoren for vævsskade forårsaget af calciumholdige krystaller er MMP'er - collagenase-1, stromelysin, 92 kD gelatinase og collagenase-3.

I betragtning af forholdet mellem OFC-krystalindhold og ødelæggelse af ledvæv blev der fremsat en hypotese om, at OFC-krystaller og muligvis nogle kollagener fagocyteres af synovialceller. Stimulerede synovocytter prolifererer og udskiller proteaser. Denne hypotese blev testet in vitro ved at tilsætte naturlige eller syntetiske OFC-, PFCD- og andre krystaller til dyrkede humane eller hundesynovocytter. Aktiviteten af neutrale proteaser og kollagenaser steg dosisafhængigt og var cirka 5-8 gange højere end den for kontrolcellekulturen dyrket uden krystaller.

I celler dyrket i et krystalholdigt medium blev der detekteret co-induktion af collagenase-1, stromelysin og gelatinase-92 kDa mRNA, efterfulgt af sekretion af enzymer i mediet.

OFC-krystaller inducerede også akkumulering af kollagenase-1 og kollagenase-2 mRNA i modne svinechondrocytter, efterfulgt af sekretion af enzymerne i mediet.

GM McCarty et al. (1998) undersøgte rollen af intracellulær krystalopløsning i krystalinduceret MMP-produktion. Forhøjelse af lysosomal pH med bafilomycin A hæmmede intracellulær krystalopløsning og dæmpede også den proliferative respons hos humane fibroblaster på OFC-krystaller, men hæmmede ikke MMP-syntese og -sekretion.

Hverken basisk calciumfosfat eller PFCD-krystaller inducerede IL-1-produktion in vitro, men det gjorde natriumuratkrystaller.

Nuværende data indikerer tydeligt direkte stimulering af MMP-produktion af fibroblaster og kondrocytter ved kontakt med calciumholdige krystaller.

Symptomer på slidgigt indikerer en betydelig rolle, som MMP spiller i sygdommens progression. Tilstedeværelsen af calciumholdige krystaller øger degenerationen af væv i de berørte led.

Stimulering af prostaglandinsyntese

Sammen med stimulering af cellevækst og sekretion af enzymer forårsager calciumholdige krystaller frigivelse af prostaglandiner fra pattedyrcellekulturer, især PGE2 _. Frigivelsen af PGE2 sker _i alle tilfælde inden for den første time efter cellernes eksponering for krystallerne. R. Rothenberg (1987) fastslog, at de vigtigste kilder til arachidonsyre til syntesen af PGE2 _er phosphatidylcholin og phosphatidylethanolamin, og bekræftede også, at phospholipase A2 _og NOX er de dominerende veje for PGE2- _produktion.

PGE1 kan også frigives som reaktion på OFA-krystaller. GM McCarty et al. (1993, 1994) undersøgte virkningerne af PGE2 _, PGE og dets analog misoprostol på den mitogene respons af humane fibroblaster på OFA-krystaller. Alle tre stoffer hæmmede den mitogene respons på en dosisafhængig måde, hvor PGE og misoprostol udviste mere udtalt hæmmende aktivitet. PGE2 og misoprostol, men ikke PGE2 _, hæmmede akkumuleringen af kollagenase mRNA som reaktion på OFA-krystaller.

MG McCarty og H. Cheung (1994) undersøgte mekanismen bag OFC-medieret aktivering af celler ved PGE. Forfatterne viste, at PGE, en mere kraftfuld inducer af intracellulær cAMP end PGE2 _, og PGE, hæmmer OFC-induceret mitogenese og MMP-produktion via en cAMP-afhængig signaltransduktionsvej. Det er muligt, at stigningen i PGE-produktion induceret af OFC-krystaller svækker deres andre biologiske effekter (mitogenese og MMP-produktion) via en feedbackmekanisme.

Krystalinduceret inflammation

Kalciumholdige krystaller findes ofte i synovialvæsken hos patienter med slidgigt, men episoder med akut inflammation med leukocytose er sjældne både ved slidgigt og ved krystalassocierede artropatier (f.eks. Milwaukee-skuldersyndrom). Krystallernes flogistiske potentiale kan modificeres af en række hæmmende faktorer. R. Terkeltaub et al. (1988) demonstrerede blodserums og plasmas evne til signifikant at hæmme neutrofile granulocytters respons på basiske calciumfosfatkrystaller. De faktorer, der forårsager en sådan hæmning, er krystalbindende proteiner. En undersøgelse af et af disse proteiner, et ₂ -HS-glykoprotein (AHSr), viste, at AHSr er den mest potente og specifikke hæmmer af neutrofile granulocytters respons på OFC-krystaller. AHSr er et serumprotein af leveroprindelse; det er kendt, at det sammenlignet med andre serumproteiner findes i relativt høje koncentrationer i knogler og mineraliserende væv. Derudover er AHSr til stede i "ikke-inflammeret" synovialvæske og er også blevet detekteret på basiske calciumfosfatkrystaller i nativ synovialvæske. Muligheden for, at AHSr modulerer det flogogene potentiale af basiske calciumfosfatkrystaller in vivo, kan således ikke udelukkes.

For at opsummere alt ovenstående præsenterer vi to skemaer for slidgigtpatogenese foreslået af WB van den Berg et al. (1999) og M. Carrabba et al. (1996), som kombinerer mekaniske, genetiske og biokemiske faktorer.