Corynebacterium

Difteri er en akut infektionssygdom, der primært rammer børn, og som manifesterer sig som dyb forgiftning af kroppen med difteritoksin og karakteristisk fibrinøs inflammation på det sted, hvor patogenet er lokaliseret. Sygdommens navn kommer fra det græske ord difteri - hud, hinde, da der dannes en tæt, gråhvid hinde på det sted, hvor patogenet reproducerer sig.

Det forårsagende agens for difteri - Corynebacterium diphtheriae - blev først opdaget i 1883 af E. Klebs i filmstykker og blev udvundet i renkultur i 1884 af F. Leffler. I 1888 opdagede E. Roux og A. Yersin dens evne til at producere et eksotoksin, som spiller en vigtig rolle i difteriets ætiologi og patogenese. Produktionen af antitoksisk serum af E. Behring i 1892 og dets anvendelse siden 1894 til behandling af difteri gjorde det muligt at reducere dødeligheden betydeligt. Et vellykket angreb på denne sygdom begyndte efter 1923 i forbindelse med udviklingen af en metode til at udvinde difteri-anatoksin af G. Raion.

Det forårsagende agens for difteri tilhører slægten Corynebacterium (klasse Actinobacteria). Morfologisk er den karakteriseret ved, at cellerne er kølleformede og fortykkede i enderne (græsk coryne - kølle), danner grene, især i gamle kulturer, og indeholder granulære indeslutninger.

Slægten Corynebacterium omfatter et stort antal arter, som er opdelt i tre grupper.

• Corynebakterier er parasitter hos mennesker og dyr og patogene for dem.
• Corynebakterier, der er patogene for planter.
• Ikke-patogene Corynebakterier. Mange arter af Corynebakterier er normale beboere af huden, slimhinderne i svælget, nasopharynx, øjnene, luftvejene, urinrøret og kønsorganerne.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ]

Morfologi af corynebakterier

C. diphtheriae er lige eller let buede, ikke-bevægelige stave, 1,0-8,0 μm lange og 0,3-0,8 μm i diameter; de danner ikke sporer eller kapsler. De har ofte hævelser i den ene eller begge ender og indeholder ofte metakromatiske granuler - volutinkorn (polymetafosfater), som får en blålig-lilla farve, når de farves med methylenblåt. En særlig Neisser-farvningsmetode er blevet foreslået til deres påvisning. I dette tilfælde farves stavene strågule, og volutinkornene er mørkebrune og er normalt placeret ved polerne. Corynebacterium diphtheriae farver godt med anilinfarvestoffer, er grampositiv, men i gamle kulturer bliver den ofte misfarvet og har en negativ farvning ifølge Gram. Den er karakteriseret ved udtalt polymorfi, især i gamle kulturer og under påvirkning af antibiotika. G+C-indholdet i DNA er omkring 60 mol%.

Biokemiske egenskaber af corynebakterier

Difteribacillen er en aerob eller fakultativ anaerob bakterie, den optimale temperatur for vækst er 35-37 °C (vækstgrænser er 15-40 °C), den optimale pH er 7,6-7,8. Den er ikke særlig krævende over for næringsmedier, men vokser bedre på medier, der indeholder serum eller blod. Ostemasse Roux- eller Loeffler-medier er selektive for difteribakterier , og vækst på dem viser sig efter 8-12 timer i form af konvekse kolonier på størrelse med et knappenålshoved, gråhvide eller gullig-creme i farven. Deres overflade er glat eller let kornet, og i periferien er kolonierne noget mere transparente end i midten. Kolonierne smelter ikke sammen, hvilket resulterer i, at kulturen får udseende af shagreen-læder. På bouillonen manifesterer væksten sig som ensartet turbiditet, eller bouillonen forbliver transparent, og en fin film dannes på dens overflade, som gradvist tykner, smuldrer og sætter sig i flager på bunden.

Et kendetegn ved difteribakterier er deres gode vækst på blod- og serummedier, der indeholder sådanne koncentrationer af kaliumtellurit, at de undertrykker væksten af andre typer bakterier. Dette skyldes, at C. diphtheriae reducerer kaliumtellurit til metallisk tellur, som, når det aflejres i mikrobielle celler, giver kolonierne en karakteristisk mørkegrå eller sort farve. Brugen af sådanne medier øger procentdelen af difteribakteriepodning.

Corynebacterium diphtheriae fermenterer glukose, maltose og galaktose under dannelse af syre uden gas, men fermenterer (som regel) ikke sukrose, har cystinase, har ikke urease og danner ikke indol. Ifølge disse karakteristika adskiller de sig fra de coryneforme bakterier (diftheroider), der oftest findes på øjets slimhinde (Corynebacterium xerosus) og næsesvælget (Corynebacterium pseiidodiphtheriticum), og fra andre diftheroider.

I naturen findes der tre hovedvarianter (biotyper) af difteribacillus: gravis, intermedin og mitis. De adskiller sig i morfologiske, kulturelle, biokemiske og andre egenskaber.

Opdelingen af difteribakterier i biotyper blev foretaget under hensyntagen til de former for difteri hos patienter, som de isoleres fra med størst hyppighed. Gravis-typen isoleres oftest fra patienter med en alvorlig form for difteri og forårsager gruppeudbrud. Mitis-typen forårsager mildere og sporadiske tilfælde af sygdommen, og intermedius-typen indtager en mellemposition mellem dem. Corynebacterium belfanti, der tidligere blev tilskrevet mitis-biotypen, isoleres som en uafhængig, fjerde biotype. Dens væsentligste forskel fra gravis- og mitis-biotyperne er evnen til at reducere nitrater til nitritter. Corynebacterium belfanti-stammer har udtalte adhæsive egenskaber, og både toksogene og ikke-toksogene varianter findes blandt dem.

[ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ]

Antigenisk struktur af corynebakterier

Corynebacterium er meget heterogen og mosaikagtig. Der er fundet adskillige dusin somatiske antigener i alle tre typer difterapatogener, ifølge hvilke de er opdelt i serotyper. I Rusland er der blevet vedtaget en serologisk klassificering, ifølge hvilken der skelnes mellem 11 serotyper af difteribakterier, hvoraf 7 er hovedserotyper (1-7) og 4 er yderligere, sjældent forekommende serotyper (8-11). Seks serotyper (1, 2, 3, 4, 5, 7) tilhører gravis-typen, og fem (6,8,9,10,11) tilhører mitis-typen. En ulempe ved serotypemetoden er, at mange stammer, især ikke-toksogene, har spontan agglutination eller polyagglutinabilitet.

[ 11 ]

Fagtypning af Corynebacterium diphtheriae

Forskellige fagtypningsordninger er blevet foreslået til differentiering af difteribakterier. Ifølge MD Krylovas skema er det muligt at typificere de fleste toksogene og ikke-toksogene stammer af gravis-typen ved hjælp af et sæt af 9 fager (A, B, C, D, F, G, H, I, K). Under hensyntagen til følsomhed over for de specificerede fager, såvel som kulturelle, antigene egenskaber og evnen til at syntetisere coryciner (bakteriedræbende proteiner), identificerede MD Krylova 3 uafhængige grupper af corynebakterier af gravis-typen (I-III). Hver af dem indeholder undergrupper af toksogene og deres ikke-toksogene analoger af difterapatogener.

Corynebacterium-resistens

Corynebacterium diphtheriae udviser høj resistens over for lave temperaturer, men dør hurtigt ved høje temperaturer: ved 60 °C - inden for 15-20 minutter, ved kogning - efter 2-3 minutter. Alle desinfektionsmidler (lysol, phenol, chloramin osv.) i den sædvanligt anvendte koncentration ødelægger den på 5-10 minutter. Difteri-patogenet tolererer dog tørring godt og kan forblive levedygtigt i lang tid i tørret slim, spyt og støvpartikler. I en fin aerosol forbliver difteribakterier levedygtige i 24-48 timer.

Patogenicitetsfaktorer for corynebakterier

Corynebacterium diphtheriaes patogenicitet bestemmes af tilstedeværelsen af en række faktorer.

Faktorer for adhæsion, kolonisering og invasion

De strukturer, der er ansvarlige for adhæsion, er ikke blevet identificeret, men uden dem ville difteribacillus ikke være i stand til at kolonisere celler. Deres rolle udføres af nogle komponenter i patogenets cellevæg. Patogenets invasive egenskaber er forbundet med hyaluronidase, neuraminidase og protease.

Et giftigt glycolipid indeholdt i patogenets cellevæg. Det er en 6,6'-diester af trehalose, der indeholder corynemycolsyre (C32H64O3) og corynemycolsyre (C32H62O3) i ækvimolære forhold (trehalose-6,6'-dicorynemialat). Glykolipidet har en destruktiv virkning på vævsceller på stedet for patogenets reproduktion.

Eksotoksin, som bestemmer patogenets patogenicitet og sygdommens patogenese. Ikke-toksogene varianter af C. diphtheriae forårsager ikke difteri.

Exotoksinet syntetiseres som en inaktiv forløber - en enkelt polypeptidkæde med en molekylvægt på 61 kD. Det aktiveres af selve den bakterielle protease, som splitter polypeptidet i to peptider forbundet med disulfidbindinger: A (mw 21 kD) og B (mw 39 kD). Peptid B udfører en acceptorfunktion - det genkender receptoren, binder til den og danner en intramembran kanal, hvorigennem peptid A trænger ind i cellen og implementerer toksinets biologiske aktivitet. Peptid A er et ADP-ribosyltransferase-enzym, som sikrer overførslen af adenosindiphosphat-ribose fra NAD til en af aminosyreresterne (histidin) i proteinforlængelsesfaktoren EF-2. Som et resultat af modifikationen mister EF-2 sin aktivitet, og dette fører til undertrykkelse af proteinsyntese af ribosomer i translokationsstadiet. Toksinet syntetiseres kun af de C. diphtheriae, der bærer generne for den moderat konverterende profag i deres kromosom. Operonet, der koder for syntesen af toksinet, er monocistronisk. Det består af 1,9 tusind nukleotidpar og har en toxP-promotor og 3 regioner: toxS, toxA og toxB. ToxS-regionen koder for 25 aminosyrerester af signalpeptidet (det sikrer frigivelsen af toksinet gennem membranen ind i bakteriecellens periplasmatiske rum), toxA - 193 aminosyrerester af peptid A og toxB - 342 aminosyrerester af peptid B af toksinet. Tab af profagen af cellen eller mutationer i tox-operonet gør cellen let toksigen. Tværtimod omdanner lysogenisering af ikke-toksigene C. diphtheriae af den konverterende fag dem til toksigene bakterier. Dette er blevet utvetydigt bevist: difteribakteriernes toksigenicitet afhænger af deres lysogenisering af toksikkonverterende korynefager. Corynefager integreres i kromosomet hos corynebakterier ved hjælp af mekanismen for stedspecifik rekombination, og stammer af difteribakterier kan indeholde 2 rekombinationssteder (attB) i deres kromosomer, og corynefager integreres i hvert af dem med samme frekvens.

Genetisk analyse af en række ikke-toksogene stammer af difteribakterier, udført ved hjælp af mærkede DNA-prober, der bærer fragmenter af corynefag-tox-operonen, viste, at deres kromosomer indeholder DNA-sekvenser, der er homologe med corynefag-tox-operonen, men de koder enten for inaktive polypeptider eller er i en "stille" tilstand, dvs. inaktive. I denne forbindelse opstår et meget vigtigt epidemiologisk spørgsmål: kan ikke-toksogene difteribakterier transformeres til toksogene under naturlige forhold (i menneskekroppen), svarende til hvad der sker in vitro? Muligheden for en sådan transformation af ikke-toksogene kulturer af corynebakterier til toksogene ved hjælp af fagkonvertering blev demonstreret i eksperimenter på marsvin, kyllingeembryoner og hvide mus. Om dette sker under den naturlige epidemiske proces (og i så fald hvor ofte) er dog endnu ikke fastslået.

Da difteritoksin i patienternes krop har en selektiv og specifik effekt på visse systemer (det sympatiske binyresystem, hjertet, blodkarrene og de perifere nerver er primært påvirket), er det tydeligt, at det ikke kun hæmmer proteinbiosyntesen i celler, men også forårsager andre forstyrrelser i deres stofskifte.

Følgende metoder kan bruges til at detektere toksiciteten af difteribakterier:

• Biologiske dyreforsøg. Intradermal infektion af marsvin med et filtrat af en bouillonkultur af difteribakterier forårsager nekrose på injektionsstedet. En minimal dødelig dosis toksin (20-30 ng) dræber et marsvin, der vejer 250 g, når det injiceres subkutant på 4.-5. dag. Den mest karakteristiske manifestation af toksinets virkning er skade på binyrerne, som er forstørrede og kraftigt hyperæmiske.
• Infektion af kyllingefostre. Difteritoksin forårsager deres død.
• Infektion af cellekulturer. Difteritoksin forårsager en tydelig cytopatisk effekt.
• Et fastfase-enzymbundet immunosorbentassay ved anvendelse af peroxidase-mærkede antitoksiner.
• Anvendelse af en DNA-probe til direkte detektion af tox-operonen i kromosomet hos difteribakterier.

Den enkleste og mest almindelige metode til at bestemme difteribakteriers toksicitet er imidlertid serologisk - geludfældningsmetoden. Dens essens er som følger. En strimmel sterilt filterpapir, der måler 1,5 x 8 cm, fugtes med antitoksisk antidifteri-serum indeholdende 500 AE i 1 ml og påføres overfladen af næringsmediet i en petriskål. Skålen tørres i en termostat i 15-20 minutter. Testkulturerne podes med plaques på begge sider af papiret. Flere stammer podes på én skål, hvoraf den ene, der er tydeligvis giftig, tjener som kontrol. Pladerne med kulturerne inkuberes ved 37 °C, og resultaterne tages i betragtning efter 24-48 timer. På grund af moddiffusionen af antitoksinet og toksinet i gelen dannes en tydelig udfældningslinje på stedet for deres interaktion, som smelter sammen med udfældningslinjen for den toksogene kontrolstamme. Uspecifikke udfældningsbånd (de dannes, hvis der ud over antitoksinet er andre antimikrobielle antistoffer til stede i små mængder i serum) optræder sent, udtrykkes svagt og smelter aldrig sammen med kontrolstammens udfældningsbånd.

Postinfektiøs immunitet

Stærke, vedvarende, praktisk talt livslange, gentagne tilfælde af sygdommen observeres sjældent - hos 5-7% af dem, der har haft sygdommen. Immuniteten er hovedsageligt antitoksisk af natur, antimikrobielle antistoffer er af mindre betydning.

Schick-testen blev tidligere anvendt i vid udstrækning til at vurdere niveauet af anti-difteri-immunitet. Til dette formål blev 1/40 af marsvinetoksinet i et volumen på 0,2 ml injiceret intradermalt i børn. I mangel af antitoksin-immunitet opstår rødme og hævelse med en diameter på mere end 1 cm på injektionsstedet efter 24-48 timer. En sådan positiv Schick-reaktion indikerer enten en fuldstændig mangel på antitoksin eller at dets indhold er mindre end 0,001 AE/ml blod. En negativ Schick-reaktion observeres, når antitoksinindholdet i blodet er højere end 0,03 AE/ml. Hvis antitoksinindholdet er lavere end 0,03 AE/ml, men højere end 0,001 AE/ml, kan Schick-reaktionen være enten positiv eller undertiden negativ. Derudover har selve toksinet en udtalt allergifremkaldende egenskab. For at bestemme niveauet af anti-difteri-immunitet (kvantitativt indhold af antitoksin) er det derfor bedre at anvende RPGA med en erytrocytdiagnostik sensibiliseret med difteritoksoid.

Epidemiologi af difteri

Den eneste smittekilde er en person - en syg person, en person i bedring eller en rask bærer af bakterien. Infektion sker gennem luftbårne dråber, luftbårent støv og gennem forskellige genstande, der bruges af syge eller raske bærere: tallerkener, bøger, linned, legetøj osv. I tilfælde af kontaminering af fødevarer (mælk, cremer osv.) er smitte mulig via fordøjelsesvejen. Den mest massive udskillelse af patogenet forekommer i sygdommens akutte form. Imidlertid er personer med latente, atypiske former for sygdommen af største epidemiologisk betydning, da de ofte ikke indlægges på hospitalet og ikke opdages med det samme. En patient med difteri er smitsom i hele sygdomsperioden og en del af rekonvalescensperioden. Den gennemsnitlige bakteriebærerperiode hos personer i bedring varierer fra 2 til 7 uger, men kan vare op til 3 måneder.

Raske bærere spiller en særlig rolle i difteriens epidemiologi. Ved sporadisk sygelighed er de de vigtigste distributører af difteri og bidrager til at bevare patogenet i naturen. Den gennemsnitlige varighed af bærertiden for toksogene stammer er noget kortere (ca. 2 måneder) end for ikke-toksogene (ca. 2-3 måneder).

Årsagen til dannelsen af sund bærerevne af toksogene og ikke-toksogene difteribakterier er ikke fuldt ud oplyst, da selv et højt niveau af antitoksisk immunitet ikke altid sikrer fuldstændig frigørelse af kroppen fra patogenet. Måske har niveauet af antibakteriel immunitet en vis betydning. Af primær epidemiologisk betydning er bærerevne af toksogene stammer af difteribakterier.

[ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ], [ 16 ], [ 17 ], [ 18 ], [ 19 ]

Symptomer på difteri

Mennesker i alle aldre er modtagelige for difteri. Patogenet kan trænge ind i menneskekroppen gennem slimhinderne i forskellige organer eller gennem beskadiget hud. Afhængigt af processens lokalisering skelnes der mellem difteri i svælget, næsen, strubehovedet, øret, øjet, kønsorganerne og huden. Blandede former er mulige, for eksempel difteri i svælget og huden osv. Inkubationsperioden er 2-10 dage. I den klinisk udtrykte form for difteri udvikles en karakteristisk fibrinøs inflammation af slimhinden på patogenets lokaliseringssted. Toksinet produceret af patogenet påvirker først epitelcellerne og derefter de nærliggende blodkar, hvilket øger deres permeabilitet. Det udgående ekssudat indeholder fibrinogen, hvis koagulation fører til dannelsen af en gråhvid filmagtig belægning på overfladen af slimhinden, som er tæt forbundet med det underliggende væv og, når det rives af, forårsager blødning. Konsekvensen af skader på blodkarrene kan være udvikling af lokalt ødem. Difteri i svælget er særligt farligt, da det kan forårsage difteri-kryps på grund af ødem i slimhinden i larynx og stemmebånd, hvorfra 50-60% af børn med difteri tidligere døde som følge af kvælning. Difteritoksin, der kommer ind i blodet, forårsager generel dyb forgiftning. Det påvirker primært det kardiovaskulære, sympatiske binyresystem og perifere nerver. Symptomerne på difteri består således af en kombination af lokale tegn afhængigt af lokaliseringen af indgangsporten og generelle symptomer forårsaget af forgiftning med toksinet, der manifesterer sig i form af adynami, sløvhed, bleg hud, lavt blodtryk, myokarditis, lammelse af de perifere nerver og andre lidelser. Difteri hos vaccinerede børn, hvis observeret, forløber normalt i en mild form og uden komplikationer. Dødeligheden i perioden før brug af seroterapi og antibiotika var 50-60%, nu er den 3-6%.

Laboratoriediagnostik af difteri

Den eneste metode til mikrobiologisk diagnostik af difteri er bakteriologisk, med obligatorisk testning af den isolerede kultur af corynebakterier for toksicitet. Bakteriologiske undersøgelser for difteri udføres i tre tilfælde:

• til diagnosticering af difteri hos børn og voksne med akutte inflammatoriske processer i svælget, næsen og nasopharynx;
• ifølge epidemiologiske indikationer fra personer, der har været i kontakt med kilden til difteripatogenet;
• personer, der nyligt er optaget på børnehjem, vuggestuer, kostskoler og andre særlige institutioner for børn og voksne, med henblik på at identificere mulige bærere af difteribacillen blandt dem.

Materialet til undersøgelsen er slim fra svælget og næsen, film fra mandlerne eller andre slimhinder, som er indgangspunktet for patogenet. Såning udføres på telluritserum eller blodmedier og samtidigt på koaguleret serum Roux (koaguleret hesteserum) eller Loeffler (3 dele bovint serum + 1 del sukkerbouillon) medier, hvorpå corynebakterievækst viser sig efter 8-12 timer. Den isolerede kultur identificeres ved en kombination af morfologiske, kulturelle og biokemiske egenskaber, hvor sero- og fagtypningsmetoder anvendes, når det er muligt. I alle tilfælde er en toksicitetstest ved hjælp af en af ovenstående metoder obligatorisk. De morfologiske træk ved corynebakterier undersøges bedst ved hjælp af tre metoder til farvning af et smearpræparat: Gram, Neisser og methylenblåt (eller toluidinblåt).

Behandling af difteri

En specifik behandling for difteri er brugen af anti-difteri antitoksisk serum indeholdende mindst 2000 IE pr. 1 ml. Serummet administreres intramuskulært i doser fra 10.000 til 400.000 IE afhængigt af sygdommens sværhedsgrad. En effektiv behandlingsmetode er brugen af antibiotika (penicilliner, tetracykliner, erythromycin osv.) og sulfonamider. For at stimulere produktionen af sine egne antitoksiner kan anatoxin anvendes. For at slippe af med bakteriebæreren bør antibiotika anvendes, som den givne stamme af corynebakterier er meget følsom over for.

Specifik profylakse mod difteri

Den primære metode til bekæmpelse af difteri er planlagt massevaccination af befolkningen. Til dette formål anvendes forskellige vaccinemuligheder, herunder kombinerede, dvs. med det formål at skabe immunitet mod flere patogener samtidig. Den mest udbredte vaccine i Rusland er DPT. Det er en suspension af kighostebakterier adsorberet på aluminiumhydroxid, dræbt af formalin eller thimerosal (20 milliarder i 1 ml), og indeholder difteritoksoid i en dosis på 30 flokkuleringsenheder og 10 enheder tetanustoksoidbinding i 1 ml. Børn vaccineres fra 3 måneders alderen, og derefter udføres revaccinationer: den første efter 1,5-2 år, den næste i alderen 9 og 16 år, og derefter hvert 10. år.

Takket være massevaccinationen, der begyndte i USSR i 1959, var forekomsten af difteri i landet i 1966 reduceret med 45 gange sammenlignet med 1958, og tallet i 1969 var 0,7 pr. 100.000 indbyggere. Den efterfølgende reduktion i vaccinationsmængden i 1980'erne førte til alvorlige konsekvenser. I 1993-1996 blev Rusland ramt af en difteriepidemi. Voksne, primært dem, der ikke var blevet vaccineret, og børn blev syge. I 1994 blev næsten 40 tusind patienter registreret. I forbindelse med dette blev massevaccinationen genoptaget. I denne periode blev 132 millioner mennesker vaccineret, herunder 92 millioner voksne. I 2000-2001 var dækningen af børn med vaccinationer inden for den fastsatte periode 96%, og med revaccination - 94%. På grund af dette faldt forekomsten af difteri i 2001 med 15 gange sammenlignet med 1996. For at reducere forekomsten til isolerede tilfælde er det dog nødvendigt at vaccinere mindst 97-98 % af børnene i deres første leveår og sikre massevaccination i de efterfølgende år. Det er usandsynligt, at difteri vil blive fuldstændig elimineret i de kommende år på grund af den udbredte spredning af toksogene og ikke-toksogene difteribakterier. Det vil også tage noget tid at løse dette problem.