Nonviral genterapi giver håb for kroniske lændesmerter

I en nylig undersøgelse offentliggjort i tidsskriftet Biomaterials udviklede forskere en ny ikke-viral genterapi til behandling af diskogene rygsmerter (DBP) ved at levere transkriptionsfaktoren Forkhead Boks F1 (FOXF1) ved hjælp af konstruerede ekstracellulære vesikler (eEV'er) til degenerative intervertebrale diske (IVD'er) in vivo.

Kroniske lændesmerter (LBP) er et voksende globalt problem på grund af en aldrende befolkning og forværrede opioidproblemer. Nuværende behandlinger omfatter kortvarig lindring eller dyre operationer, hvilket fremhæver behovet for ikke-vanedannende og mindre invasive behandlinger.

Nuværende biologiske terapier, herunder administration af vækstfaktorer, celleterapi og virale genterapier, kan reducere degeneration i dyre- og menneskemodeller. Bekymringer såsom kortsigtede virkninger, dårlig langtidseffektivitet og unødvendig immunogenicitet og tumorgenicitet kan imidlertid forhindre den direkte anvendelse af disse metoder.

I denne undersøgelse etablerede forskere en ikke-viral genterapi for intervertebral diskdegeneration (IVD) ved hjælp af FOXF1-eEV.

Forskerne transficerede primære museembryonale fibroblaster (PMEF'er) med et plasmid indeholdende FOXF1 eller pCMV6 som kontrol og karakteriserede eEV-prøver ved hjælp af nanopartikelsporingsassay (NTA).

De vurderede den effektive lastning af molekylær last i eEV'er ved hjælp af kvantitativ revers transkription-polymerase-kædereaktion (qRT-PCR) og konventionel PCR. Western blot-analyse identificerede FOXF1 og specifikke EV-proteiner i eEV-formationer. Holdet brugte plasmider, der forbedrer opstrøms og nedstrøms polylinker-regioner til at bestemme tilstedeværelsen af FOXF1-plasmid-DNA i donorceller og genererede eEV'er.

De undersøgte fuldlængde mRNA produceret fra plasmid-DNA i eEV'er og donorceller.

Forskere skabte ekstracellulære vesikler med transkriptionsfaktorer for at genoprette vævsfunktion og modificere smerterespons i en dyremodel af DBP.

De identificerede EV'er til at transportere og distribuere FOXF1 til beskadigede intervertebrale diske i en musemodel af diskogene rygsmerter for at bestemme FOXF1 eEV-hæmning af intervertebral disk degeneration.

Teamet kombinerede biomekanisk testning af musens intervertebrale diske med billeddannelse, ekstracellulær matrix (ECM) ændringer og smerterespons vurderet efter 12 uger for at bekræfte ændringer i struktur og funktion samt smerte induceret af den terapeutiske intervention.

Smertevurderinger før og efter behandling omfattede mikrocomputertomografi (mikro-CT), magnetisk resonansbilleddannelse (MRI), mekaniske tests, Alcian blå (AB) og picrosirius rød (PSR) farvning, dimethylmethylenblå test og immunhistokemi (IHC) ) ).

Undersøgelsen involverede en kirurgisk teknik, hvor forskere injicerede Buprenorphine ER subkutant i mus for at kontrollere postoperative smerter.

Teamet udførte adfærdsvurderinger før operationen og hver anden uge fra fire til tolv uger efter operationen, ved hjælp af en række forskellige teknikker såsom åben felttest, kold plade, haleophæng og wireophæng.

Det åbne felt test vurderede den spontane aktivitet af mus; koldpladetest målte termisk hyperalgesi; Haleophængningstest målte aksial smerte; og wire suspension tests målt styrke.

Tolv uger efter operationen dissekerede holdet dyrenes lændehvirvelsøjler ved hjælp af femoral nerve- og arteriesporing til at identificere intervertebrale diske mellem L4 og L5, L5 og L6 og L6 og S1 IVD. De brugte L5/L6 IVD til at evaluere histologi og bestemme indholdet af glycosaminoglycan (GAG).

FOXF1 eEV'er reducerede markant smertereaktioner, mens de genoprettede IVD-struktur og funktion, herunder forbedringer i diskhøjde, vævshydrering, proteoglykanindhold og mekaniske egenskaber.

Undersøgelsen fokuserede på frigivelsen af FOXF1-ladede eEV'er fra primære fibroblaster transficeret med FOXF1-transkriptionsfaktoren. Kvantitativ RT PCR viste en signifikant stigning i FOXF1 mRNA transkriptniveauer og fuldlængde transskriberede FOXF1 mRNA niveauer sammenlignet med celler transficeret med pCMV6.

FOXF1 eEV-terapi kan reducere smertereaktioner i en musemodel med lumbal diskpunktion i op til 12 uger. Hunmus viste længere optagelsestider i den FOXF1-behandlede gruppe end i den læsionerede gruppe, hvilket varede i mindst 12 uger efter behandlingen.

FOXF1 eEV-terapi forbedrede hydrering og IVD-vævshøjde hos skadede og degenerative dyr in vivo, samtidig med at hydreringsniveauer og T2-vægtet IVD-billedintensitet blev bibeholdt.

Holdet observerede dog et fald i skivehøjden hos sårede dyr og dyr behandlet med pCMV6 eEV. Mus behandlet med FOXF1 eEV havde ingen reduktion i skivehøjde 12 uger efter behandling. Køn påvirkede ikke funktionelle resultater.

FOXF1 eEV'er genoprettede den mekaniske funktion af beskadigede og degenererede IVD'er in vivo. Under aksial belastning viste FOXF1 eEV-behandlede IVD'er højere normaliseret NZ-stivhed sammenlignet med beskadigede IVD'er.

Under krybeforhold udviste beskadigede IVD'er øgede normaliserede krybeforskydninger, hvilket indikerer et fald i normaliseret krybeelastisk stivhed.

Resultater viser, at reduktion af GAG-indhold i beskadigede IVD'er øger den mekaniske fleksibilitet, men eEV-terapi forhindrer tab af glycosaminoglycan og efterfølgende ændringer i mekanisk funktion.

FOXF1 eEV'er forårsagede strukturelle og funktionelle ændringer i IVD ved at øge niveauet af proteoglycaner og GAG'er.

Undersøgelsesresultaterne viste, at eEV'er fyldt med udviklingsmæssige transkriptionsfaktorer kan behandle smertefulde ledsygdomme såsom DBP ved at levere disse transkriptionsfaktorer til degenerative og smertefulde IVD-led.

Denne strategi kan hjælpe med at reducere strukturelle og funktionelle abnormiteter forårsaget af sygdommen, samt regulere kønsspecifikke smerteresponser.

Forskere har også anbefalet at bruge udviklingsmæssige transkriptionsfaktorer såsom FOXF1 til at omdanne degenerative NP-celler til en pro-anabolsk tilstand in vivo. Yderligere forskning er nødvendig for at bestemme dets terapeutiske effektivitet.