Ikke-viral genterapi giver håb for kroniske lændesmerter

I et nyligt studie offentliggjort i tidsskriftet Biomaterials udviklede forskere en ny ikke-viral genterapi til behandling af diskogene rygsmerter (DBP) ved at levere transkriptionsfaktoren Forkhead Box F1 (FOXF1) ved hjælp af konstruerede ekstracellulære vesikler (eEV'er) ind i degenerative intervertebrale diske (IVD'er) in vivo.

Kroniske lændesmerter er et voksende globalt problem på grund af en aldrende befolkning og forværrede opioidproblemer. Nuværende behandlinger omfatter kortvarig lindring eller dyre operationer, hvilket understreger behovet for ikke-vanedannende og mindre invasive behandlinger.

Nuværende biologiske tilgange, herunder administration af vækstfaktorer, celleterapi og viral genterapi, kan reducere degeneration i dyre- og menneskemodeller. Imidlertid kan problemer som kortsigtede effekter, dårlig langsigtet effekt og unødvendig immunogenicitet og onkogenicitet hindre den direkte anvendelse af disse tilgange.

I dette studie etablerede forskerne en ikke-viral genterapi til degeneration af intervertebral diskus (IVD) ved hjælp af FOXF1-eEV.

Forskerne transficerede primære museembryonale fibroblaster (PMEF) med plasmider indeholdende FOXF1 eller pCMV6 som kontrol og karakteriserede eEV-prøver ved hjælp af nanopartikelsporingsassay (NTA).

De vurderede effektiv lastning af molekylær last i eEV'er ved hjælp af kvantitativ revers transkription-polymerasekædereaktion (qRT-PCR) og konventionel PCR. Western blot-analyse identificerede FOXF1 og EV-specifikke proteiner i eEV-formationer. Holdet brugte plasmider, der forstærker de øvre og nedre polylinkerregioner, til at bestemme tilstedeværelsen af FOXF1-plasmid-DNA i donorceller og genererede eEV'er.

De undersøgte mRNA i fuld længde produceret fra plasmid-DNA i eEV'er og donorceller.

Forskere skabte ekstracellulære vesikler med transkriptionsfaktorer for at genoprette vævsfunktion og ændre smerteresponser i en dyremodel af DBP.

De identificerede EV'er til transport og distribution af FOXF1 til beskadigede intervertebrale diske i en musemodel af diskogene rygsmerter for at bestemme FOXF1 eEV-hæmning af intervertebral diskdegeneration.

Holdet kombinerede biomekanisk testning af intervertebrale diske hos mus med billeddannelse, ændringer i ekstracellulær matrix (ECM) og smerteresponser vurderet efter 12 uger for at bekræfte ændringer i struktur og funktion, samt smerter induceret af den terapeutiske intervention.

Præoperative og postoperative smertevurderinger omfattede mikro-computertomografi (mikro-CT), magnetisk resonansbilleddannelse (MRI), mekanisk testning, Alcianblåt (AB) og picrosiriusrødt (PSR) farvning, dimethylmethylenblåt-test og immunhistokemi (IHC).

Undersøgelsen involverede en kirurgisk teknik, hvor forskere administrerede buprenorfin ER subkutant til mus for at kontrollere postoperative smerter.

Holdet udførte adfærdsvurderinger før operationen og hver anden uge fra fire til 12 uger efter operationen ved hjælp af en række forskellige metoder, herunder åben felttest, kold plade, haleophæng og wireophæng.

Åbenfelttesten vurderede musenes spontane aktivitet; kolde pladetests målte termisk hyperalgesi; haleophængningstests målte aksial smerte; og trådophængningstests målte styrke.

Tolv uger efter operationen dissekerede teamet dyrenes lændehvirvelsøjler ved hjælp af femoralnerve- og arteriesporing for at identificere intervertebrale skiver mellem L4 og L5, L5 og L6 samt L6 og S1 IVD. De brugte L5/L6 IVD til at vurdere histologi og bestemme glycosaminoglycan (GAG)-indholdet.

FOXF1 eEV'er reducerede smerteresponser signifikant, samtidig med at de genoprettede IVD-struktur og -funktion, herunder forbedret diskhøjde, vævshydrering, proteoglykanindhold og mekaniske egenskaber.

Studiet fokuserede på frigivelsen af FOXF1-indlæste eEV'er fra primære fibroblaster transficeret med transkriptionsfaktoren FOXF1. Kvantitativ RT PCR viste en signifikant stigning i FOXF1 mRNA-transkriptniveauer og niveauer af transkriberet FOXF1 mRNA i fuld længde sammenlignet med pCMV6-transficerede celler.

FOXF1 eEV-terapi kan reducere smerteresponser i en lumbal diskuspunkturmodel hos mus i op til 12 uger. Hunmus viste længere anfaldstider i den FOXF1-behandlede gruppe end i den skadede gruppe, hvilket varede i mindst 12 uger efter behandlingen.

FOXF1 eEV-terapi forbedrede IVD-vævshydrering og -højde hos skadede og degenerative dyr in vivo, samtidig med at hydreringsniveauer og IVD-disk T2-vægtet billedintensitet blev opretholdt.

Holdet observerede dog en reduktion i diskhøjden hos tilskadekomne dyr og dyr behandlet med pCMV6 eEV. Mus behandlet med FOXF1 eEV havde ingen reduktion i diskhøjden 12 uger efter behandlingen. Køn påvirkede ikke funktionelle resultater.

FOXF1 eEV'er gendannede den mekaniske funktion af beskadigede og degenererede IVD'er in vivo. Under aksial belastning udviste FOXF1 eEV'er-behandlede IVD'er højere normaliseret NZ-stivhed sammenlignet med beskadigede IVD'er.

Under krybeforhold udviste beskadigede IVD'er øgede normaliserede krybeforskydninger, hvilket indikerer et fald i normaliseret krybeelastisk stivhed.

Resultaterne viser, at reduktion af GAG-indhold i beskadigede IVD'er øger den mekaniske fleksibilitet, men eEV-behandling forhindrer tab af glycosaminoglykaner og efterfølgende ændringer i mekanisk funktion.

FOXF1 eEV'er inducerede strukturelle og funktionelle ændringer i IVD ved at øge proteoglykan- og GAG-niveauerne.

Resultaterne af undersøgelsen viste, at eEV'er fyldt med udviklingsmæssige transkriptionsfaktorer kan behandle smertefulde ledsygdomme såsom DBP ved at levere disse transkriptionsfaktorer til degenerative og smertefulde led via IVD.

Denne strategi kan bidrage til at reducere de strukturelle og funktionelle abnormiteter forårsaget af sygdommen og regulere smerteresponser på en kønsspecifik måde.

Forskerne anbefalede også at bruge udviklingstranskriptionsfaktorer såsom FOXF1 til at flytte degenerative NP-celler til en pro-anabolsk tilstand in vivo. Yderligere undersøgelser er nødvendige for at bestemme dens terapeutiske effekt.