Eksperimentelt arbejde med transplantation af allogene keratinocytter på kunstigt skabte ar fra hvide rotter

Ønsket om at anvende cellulært potentiale og behovet for at søge efter nye effektive metoder til forbedring af æstetisk udseende af ar, førte til ideen om at forsøge at undersøge muligheden for keratinocytransplantation til ardannede overflader.

For at bevise muligheden for at anvende keratinocytkultur at forbedre udseendet af ar eksperimentelt arbejde er blevet udført på hvide laboratorierotter, som blev skabt ar overflade. Rotter ardannelse model blev fremstillet ved kunstigt helende sår på bagsiden, langs rygraden. Rotter blev skåret stykker af samme læder, størrelse 2x3 cm. Efter 2,5 måneder efter operation "simulation ardannelse" rotter blev udført dermabrasion kirurgi (fjernelse af de øvre lag via ignioperation vommen) og transplanterede allogene keratinocytter, isoleret fra huden af unge rotter 2-4 dage efter fødslen.

Isolering og vækst af rotteepidermocytter blev udført i laboratoriet for cellulære teknologier fra Institute of Cytology RAS af følgende teknologi.

Huden blev vasket i Hanks saltopløsning indeholdende 200 U / ml gentamicin, skåret i små stykker, et område på 0,2-0,5 cm ². Hudterninger blev inkuberet i en 0,5% opløsning af disaspase i en afbalanceret saltvandsfosfatbufret opløsning ved 37 ° C i en time. Stykkerne blev derefter overført til Dulbeccos fosfatpufrede saltopløsning, og epidermis blev adskilt fra dermis. Epidermis blev inkuberet i en 0,125% trypsinopløsning i 10-15 minutter under omrøring ved 50 omdrejninger pr. Minut, hvorefter enzymets virkning blev standset ved tilsætning af 5% føtalt bovint serum. En tredjedel af den resulterende cellesuspension blev anvendt i ren form til en af mulighederne for at transplantere ar, anden tredjedel dyrket på indenlandske biokompatibel filmbelægning "Polipor", den tredje - på en petriskål uden et substrat. Virkningen af dermabrasionen af de opnåede ar i rotter med efterfølgende transplantation af rotteepidermocytter på dem blev udført under etherbedøvelse ved anvendelse af en varmekræftning.

Den første gruppe af rotter efter dermabrasion på poleret, vasket med saltvand og tørret overflade sterile vommen overlejret stykker af græsplæne, som blev deponeret scrambled allogen rotte epidermotsitov opslæmning med en koncentration på 1,5 millioner celler pr 1 ml (ifølge Institute of cytologi). Batistovye stykker passer på det polerede ar, så cellerne ligger på overfladen af arret. Forbinding på toppen af flere lag osteklæde, hvilket syet til kanterne af arret.

En del af den resulterende cellesuspension blev belagt i petriskåle på sterile Polypore-film skåret i form af kopper, den anden del på petriskåle uden film. Dyrkningen blev udført i et FAD-medium bestående af en blanding af DMEM og F12-medium i et 3: 1-forhold. Med tilsætning af 10% føtalt bovint serum, 5 μg / ml insulin (Sigma), 0,5 μg / ml hydrocortisonhemisuccinat (Sigma). 10 μg / ml epidermal vækstfaktor EGF (Institute of Cytology RAS, St. Petersburg). Den anden og tredje gruppe af rotter med 7 personer blev drevet 6 dage efter den første. På dette tidspunkt dannedes flerskiktslag fra suspensionen af såede keratinocytter i petriskåle, som blev transplanteret til rotter. Den anden gruppe blev transplanteret med epidermocytter på filmen, den tredje gruppe - med et flerlagslag uden substrat. Efter 7 dage blev de flerlagede lag af alogiske keratinocytter (MPALK), der blev sådd på Polypore-film, transplanteret ved dyrkning direkte på såroverfladen. Ovenfor blev filmen fastgjort med en flerlags gazeforbinding og syet til huden af rotter for at undgå ripning.

Før omplantning keratinocytter tredje gruppe rotter, dyrket uden substratet, der producerer en adskillelse af PAC fra bunden af petriskålen dispase behandling, som har evnen til selektivt at bryde dermo-epidermal kommunikation. Under påvirkning af en flerlaget reservoir dispase ødelægger forbindelsen af det basale cellelag til bunden af petriskålen og i langt mindre grad, påvirker det intercellulære kommunikation, hvilket gør det muligt at "fjerne" hele laget. Løsningen af flerlagscellestraten ved disposition blev udført som følger. Fra petriskåle blandet transport medium blev cellearkene vasket tre gange med medium indeholdende antibiotika, især - gentamicin (0,2 mg / ml). Flerlags lag blev hældt 0,125% dispase opløsning ( «Sigma») og anbragt i en inkubator, hvor de blev inkuberet ved t = 37 ° C i 20-30 minutter. Udseendet af hvid krone, skrælning omkring periferien af reservoiret - en indikator for begyndelsen af processen med at adskille det fra kanterne og bunden af petriskålen. Få minutter efter starten af adskillelsesprocessen blev dispaseopløsning tømt 2-3 gange epiteliale lag blev vasket med medium. På overfladen af det epidermale lag blev påført, tilskåret klokkestykke steril sårforbinding "Leith-farve, som spaltes adskilt dispase formation, yderligere delaminering af bunden af koppen med en spatel. Brug af oftalmiske pincet lag sammen med belægningen af bindet" Leith-farve "(russisk ) brød væk fra bunden af en petriskål og forsigtigt overført til den forberedte overflade af arret. Servietter "Lita-farve" indeholder i sin sammensætning og gentamicin eksolin (collagen ekstrakt), som når de er våde miljø forbliver spire i fremtiden Sem saltvandsopløsning svulmede og blev moderne sår belægning, der giver god beskyttelse mod ekstern infektion og hurtig heling som følge af begyndende vådhed med struktur.

Polypropfilm og Lita-farveservietter blev lagdelt med gasbindinger, der blev syet på huden af rotter til mere holdbar fixering. Hver rotte blev plantet i et separat bur, for at skabe optimale betingelser for dets vedligeholdelse og engraftment af transplanterede keratinocytter. Bandager rotter, transplanterede suspension og flerlaget reservoir epidermotsitov shot dispase, hver dag flere gange om dagen, fugtet med sterilt saltvand for at skabe de gunstigste betingelser cellerne for indpodning. I betragtning af at filmen "Polypor" var uigennemtrængelig for vand, fugtede rotterne i den anden gruppe ikke forbindingerne, hvilket var en af fordelene ved transplantationer uden film. Efter 10 dage blev forbindelserne fjernet. Det kliniske billede af ar efter celletransplantation adskiller sig lidt fra ar uden transplantation, bortset fra en mere lyserød farve (på grund af dermabrasion) og større afskalning. Denne kendsgerning antyder det. At umiddelbart efter forsvindingen af sårbeklædningerne med IPC, forekom der ingen ændringer i vommen.

Med biopsi materiale i rotter.

Efter 1, 2, 5 og 9 måneder efter overførslen af rottealogiske keratinocytter til jordens ar af hvide rotter blev materialet taget til histologisk, cytomorfologisk og elektronmikroskopisk undersøgelse. Som kontrolprøver af normal rottehud og ar blev taget uden transplantation af celler. Anæstesi hos rotter blev udført med æteræstesi.

Efter anæstesi fra de markerede områder, i hvilke keratinocytter blev transplanteret, en biopsi piercer med en diameter på 2 mm. Stykkene af arvæv blev taget og anbragt i en 2,5% glutaraldehydopløsning for at fremstille materialet til elektronmikroskopi. Vævsstykker udtaget til histologisk undersøgelse blev anbragt i 10% neutral formalinopløsning, efterfulgt af gennem ledninger alkoholer og fyldt i paraffin, efterfulgt af skæring af ultratynde sektioner og ser dem i lyset-optisk mikroskop.

Kontrol I. Normal rottehud.

For at se forskellen mellem det mikroskopiske billede af den normale ar-ændrede hud af rotter og arr på bestemte tidspunkter efter IPC-transplantationen, vises fotografier og beskrivelser til dem på alle stadier af denne undersøgelse.

Den epidermis af normal hud består af 7-9 lag celler. Kåt lag af moderat tykkelse. På steder består det af 6-8 lag af hornede skalaer. Det basale lag er repræsenteret af celler af cylindrisk form med stort lys, regelmæssige kerner og flere nukleoler. Desmosomale forbindelser mellem cellerne og den basale membran udtrykkes tydeligt. Under veldefinerede basal membran, der har fine fremspring i subepidermal lag ligger parallelt til de blide bundter af kollagen og elastin fibre, herunder aflange fibroblaster, små fartøjer. I dybere lag ligger bundterne af collagen og elastinfibre i forskellige retninger. Blandt dem er der mange skibe med tynde vægge af samme kaliber, cellulære elementer (fibroblaster, mastceller, leukocytter). I et stort antal hårsække, talgkirtler.

Kontrol 2. Scar af en rotte 2 måneder gammel.

Klinisk billede. Arter blege lyserød, med skrælning, på stederne forbliver skorsterne. Deres område er faldet på grund af sammentrækning af kollagenfibre og bliver ca. 3,0-3,5 cm ^:. Hud vedhæftede stoffer er fraværende.

Mikroskopisk billede. Epidermis er sammensat af 3-5 cellelag, plisserede, ved afrundede basale celler, én række subulate, 1-2 rækker keratohyalin granulat med korn i det øvre lag, der er dele af intracellulær ødem. Hornhindelaget er heterogent ændret fra meget tyndt til fortykket. Der er en foldning af vommen på grund af (sammentrækning) af arvæv. Foldene trænger ind i papillærlaget og giver indtryk af papiller. Grænsen mellem epidermis og dermis er en lige linje. Den basale membran kan ikke spores overalt. I den nedre del af de subepidermale og dybere lag - fartøjer med en tyk, løsnet mur, mange øde, med stasisfænomener. Omkring skibene - en klynge af makrofager, fibroblaster. Makrofager omgiver de erythrocytter der kommer ud af kapillærerne og fagocytiserer dem. I de mere overfladiske lag - små kapillærer. Under epidermis er kollagenfibre løs. I det dybere lag af vommen - grove bundter af collagenfibre, blandt hvilke der er mange fibroblaster.

Ærring af en rotte en måned efter transplantation af MPAl rotte rotte keratinocytter.

Klinisk billede. Scarsrosa, deres areal faldt, især i diameter og gennemsnit 2,5-3 cm ². Hår- og talgkirtler er fraværende.

Disse mikroskopisk undersøgelse af materiale fra rotter med overførsel MPAlK MPAlK på filmen og substratet uden væsentlige identiske. Men teknisk set, arbejde med MPAlK ikke understøttes meget vanskeligere og besværlig end når de dyrkes MPAlK på underlaget, så den yderligere undersøgelse af spørgsmålet om transplantationen kertainotsitov ar vi brugt som grundlag for dyrkning ( "substrat") lagdelt græsplæne.

Mikroskopisk billede. Der er en fortykning af epidermis til 15-20 lag, næsten til midten af hvilke keratinocytterne har en smal, langstrakt, lodret form og et kompakt arrangement. Basalcellerne er anbragt i en ujævn linje. Deres kerne er lette, store, runde i form med en eller to nukleoler, hvilket indikerer deres høje syntetiske og proliferative aktivitet. Grænsen mellem epidermis og dermis er en lige linje. Det tornede lag er veludviklet, består af 3-5 lag celler med rund form, der er 2 nucleolus celler.

Umiddelbart under den basale membran - tæt tyndt bundne af kollagenfibre, parallelt med dem et stort antal tomme fartøjer, er dybere kollagenfibre grovere, opsamlet i tætte bundt. Mange store fibroblaster, mastceller (2-3 i synsfeltet), makrofager, leukocytter og tomme fartøjer, hvis vægge løsnes, omkring dem er løs kollagenfibre. I nogle fartøjer - stasis, diapedesis af ensartede elementer. Omkring skibene - fibroblaster, enkelt lymfocytter. Hud vedhæftede stoffer er fraværende.

Når en keratinocyt suspension suspenderes til et poleret ar, adskiller det mikroskopiske billede fra den tidligere. I de fleste dyr er epidermis tynd, består af 5-6 lag celler. Det nedre lag består af celler af uregelmæssig, polygonal form med afrundede uregelmæssigt formede kerner. Tilstanden af det subepidermale lag ligner det i gruppen af dyr uden en transplantation.

I dette tilfælde kan man tale om forsinkelse af de processer, der ledsager celletransplantation, eller af et stort tab af celler transplanteret i form af en suspension. Derfor blev det konkluderet, at korrektionen af ardannelse ved keratinocyttransplantation i form af en suspension er uhensigtsmæssig.

Råderørring 2 måneder efter transplantationen af MPAl rotte rotte keratinocytter.

Klinisk billede. Æret ser tyndt, ømt ud. På steder er der en eksdysis, skalaer.

Mikroskopiske billeder. Stratum corneum er fortykket, på steder - hyperkeratose. Den epidermis er fortykket, den består af 12-20 rækker af celler. Grænsen mellem epidermis og dermis er en lige linje. Delikate kollagenfibre under epidermis ligger ret tæt. I dybere lag af rumen samles de i grove store bundt. I det subepidermale lag vises en ny dannelse af kar. I de nedre lag af arvæv - mange tomme skibe, der ligger parallelt med overfladen af epidermis. Store fibroblaster fordeles jævnt i tykkelsen af maven, der er kæmpe, flerfacetterede, mange makrofager.

Ærring af rotten 5 måneder efter transplantation af MP af rotte spermocytter.

Klinisk billede. Scar ser glat, glat, uden afskalning, der er enkelt hår af deres større tæthed i periferien af det ar, der angiver de kant indgroede hårsækkene i vommen og svulst i hårsækkene. Området af aren fortsætter med at falde.

Mikroskopisk billede. Den epidermis er stadig tyk (15-20 lag, nogle gange op til 30) i de øverste lag er fyldt med keratogialinkorn. Den basale membran er tydelig synlig. Under hendes kollagenfibre ligger løs. I de nederste lag er collagen stærkere og tæt pakket. Blandt bjælkerne af kollagen er der mange kapillærer. I de øverste lag faldt antallet af tomme fartøjer. Den epidermis og dermis er lidt bølget. Der er dybe epidermale udvækst i arvæv. Blandt kollagenfibrene er synlige nydannede kar. Vis enkelt hårsække og talgkirtler.

Ærring af rotten 9 måneder efter transplantationen af IPA rotte rotte-epidermocytter.

Klinisk billede. Scars blev meget mindre i sammenligning med tidligere vilkår, deres område er i gennemsnit ca. 1,5-2,0 cm ². Arter er ujævnt dækket af tyndt hår, især omkring periferien. Mindre småplader skalering beholdes.

Mikroskopisk billede.

Epidermis blev tyndere, repræsenteret fra 6-8 rækker af celler, der minder om den epidermale struktur af den normale hud af rotter, kun tætheden af celler med 1 mm. Højere og de er mindre. Basal lag består af små celler af runde cylindrisk form. Den basale membran er veldefineret, hæmommosmerne er tydeligt synlige. Tilstedeværelsen af epidermale udvækst i det subepidermale lag er noteret. Papillærlaget udtrykkes langs hele længden af arret. Disse fakta viser, at adhæsionen af de transplanterede keratinocytter i denne tidsperiode er blevet meget mere holdbar med rumens underliggende væv. Derfor kan omsorg for ar af mennesker med MALC transplantation 9 måneder efter IPC transplantation være traditionel. Under epidermis er mere delikate kollagenfibre end i de dybe lag. Der var mange skibe, især overfladisk placeret. I større fartøjer er væggene fortykkede. Hårfollikler og talgkirtler i store mængder. Det mikroskopiske mønster ligner et dermalvæv.

Resultater af eksperimentelt arbejde og deres diskussion.

Under dette arbejde på kunstig hud ar af rotter efter operation dermabrasion, transplanterede keratinocytter i forskellige formah- på sår overflader, som en suspension i kammerdug og lagdelt formation uden et substrat. Arbejdet blev udført for at opnå morfologiske data om effekten af transplanterede allogene keratinocytter på ar, samt bestemmelse af de optimale transplantationsvarianter.

Det blev konstateret, at alle tre transplantationsmetoder er reelle, men transplantation af IPAA uden substrat er en meget besværlig procedure, hvor IPAC kan blive såret, hvilket påvirker resultaterne af transplantationen. Desuden udelukker denne transplantationsmetode arbejde på store overflader.

Transplantation af keratinocyt suspension er en langt mere økonomisk metode, kræver ikke lang cellekultur og er enkel i vores foreslåede version ved hjælp af sterile cambric billets, hvis dimensioner svarer til størrelsen af ar. Forsinkelsen af den terapeutiske virkning under transplantationen af cellesuspensionen i ca. En måned i sammenligning med MIC på sårbelægningen er ikke et signifikant øjeblik med behandlingsvarigheden beregnet i mange måneder. Det vides at under transplantationen af IPC for at brænde patienter, skete omdannelsen af hudstrukturtilstanden gradvis og i flere år. Transplantation af keratinocytkulturen på sårbeklædning er den mest hensigtsmæssige og lovende metode, men det er også meget dyrere. Desuden kræver det for i dag at søge efter mere sofistikerede belægninger, som skal være plastiske, hygroskopiske, have bakteriostatiske eller baktericide egenskaber og være biologisk neutrale for celler. Filmen "Polipor" - en mellemliggende version af den hjemlige film sår dækning, på trods af visse mangler, har givet os mulighed for at studere eksperimentelt keratinocytkulturer transplantationscentre rotter på ar og at drage konklusioner om effektiviteten af denne retning attraktion ardannelse.

Forfatterne, der udførte IPC-transplantationen på brændte sår, bemærkede, at i løbet af den første uge efter transplantationen af det flerlagede keratinocytlag på de saniterede sår blev epidermis fortykket og stratificeret. Alle lag af epidermis var veldefinerede. Det er interessant, at antallet af cellelag i transplantationer er 10-30% større end i hudbiopsiprover. Forfatterne bemærkede udseendet af granulater af keratogialin på den femte dag efter transplantationen af MPA, den basale membran og hæmomosmer - allerede på den tredje dag.

J. Rives et al. (L994), Paramonov BA (1996); NM Kuznetsov et al. (1998) fandt, at under de tidlige perioder efter transplantation BMD patienter med polnosloynymi overfladefejl efter forbrændinger, kommunikationen mellem dermis og epidermis er meget svag og er en lige linie, papillærlaget er fraværende. Ved udgangen af den anden måned begynder dannelsen af overfladiske papiller og appendages af huden, forbindelsen mellem dermis og epidermis bliver mere holdbar. Litteraturdataene taler om transplantationen af allogene keratinocytter på sårene hos brændte patienter som en lovende metode. På trods af, at afvisningen af allogene keratinocytter sker indsendt af forskellige forfattere i perioden fra 10 dage til 3 måneder, men de har en rolle i sårhelingen overflade, frigiver vækstfaktorer og mekanisk lukker defekten. Det menes, at MPAlK har reduceret antigen aktivitet, som, når de dyrkes in vitro miste Langerhans-celler, der tillader dem at eksistere i lang tid i kroppen af modtageren. Desuden har den allogene kultur, der er opnået fra huden hos unge raske mennesker, et uforligneligt større biologisk potentiale end den autologe kultur af patienter efter traumer.

Hovedformålet med vores undersøgelse var at finde ud af, om allogene keratinocytter vil overleve på arrene, og hvad vil der være ændringer i arvæv under påvirkning af sådan biologisk aktiv "sårbelægning". I tilfælde af et positivt resultat skal du udarbejde den mest effektive og mindst arbejdskraftintensive teknologi på dette område af rehabiliteringsmedicin.

Data på mange måder, vi har opnået svarede til dem rapporteret i litteraturen om de morfologiske forandringer, der sker i human epidermis efter transplantation med allogene keratinocytter på brandsår. Men der er betydelige forskelle, både hvad angår det morfologiske substrat, som transplanteres, og hvad angår teknologi. So. Processen med dannelse af den basale membran og dermo-epidermale forbindelser (hæmosmosomer, papiller) forekommer på et senere tidspunkt end i keratinocyttransplantationen til sårfladerne uden ar ændringer. Dette ser ud til at skyldes dårlig næring af væskens væv sammenlignet med dermis eller muskel fascia. Arret, især det gamle, er et tæt bindevæv med et meget lille antal skibe, bunden af det brænde sår er et granulationsvæv rig på blodkar. Det er således indlysende, at betingelserne under hvilke transplantation og indfangning af keratinocytter forekommer helt anderledes. Jo mere vaskulært området transplantation af celler, jo lettere er det at behandle dem. Fra dette postulat er der en konklusion om præference for at arbejde med unge ar, hvor bindevævet stadig er løs nok og rig på blodkar.

Som et resultat af dette eksperimentelle arbejde er det bevist, at:

1. En transplantation af MALK til ar er mulig. 
2. Den optimale transplantationsmetode er transplantationen af keratinocytter på sårdækslet.
3. Overfladen af arret skal males ved hjælp af en operativ dermabrasion ved brug af Schumanns laser eller en cutter.
4. Under indflydelse af MPALK forekommer hurtig epithelisering af mundens overflade.
5. Jo bedre vaskulært arvæv, det vil sige jo yngre ar, desto bedre er resultaterne af keratinocyttransplantation.
6. Ærvævet under påvirkning af transplanterede keratinocytter omdannes gradvist og bliver til et hudlignende (mere sprødt arvæv med tilhørende hud).
7. Gradvis løsning af arvæv begynder med det subepidermale lag. Forbedrer dets vaskularisering, bundter af kollagenfibre i de øvre og nedre dele af kvælen tager et mere sprøjt sted end i arvæv uden transplantation af celler. Der er hårfollikler og talgkirtler. Epidermis i sin struktur nærmer sig epidermis af normal hud efter passering af hypertrofifasen.
8. De observerede ændringer er relateret til keratinocytter secernerede vækstfaktorer, cytokiner, forbedring trofisme arvæv bidrager til omstillingen fra en stiv fibrøst væv i en løsere, hvilket fører til en forbedring af arret.

På baggrund af dette studie kan det konkluderes, at den fordelagtige effekt af transplanterede keratinocytter på arvæv, hvilket kan være af praktisk betydning for rehabilitering af patienter med forskellige typer ar.

Dette arbejde på rotter har også lov til at formulere krav. Til sårbeklædningerne, på hvilke keratinocytter dyrkes.

Sårbeklædninger bør være:

• biokompatibel med celler,
• åndbar,
• har en elastisk, form-bygning base,
• være hydrofil,
• som lægemiddeladditiver indeholder antibakterielle lægemidler, og antioxidanter er ikke giftige for dyrkede celler.

Kliniske resultater af bioteknologisk behandling af ar.

Tidligere, N. Carver et al. (1993) viste, at okklusive dressinger er bedst til at binde til keratinocytes sår og overlevelse, men tillader ikke dannelse af en stratificeret (moden) epidermis. For at danne stratificerede epidermier er et luftmiljø nødvendigt. Efter tilslutning af det flerlagede lag blev der derfor foreslået et okklusivt sårdække efter 7-10 for at fjerne og udføre sår under tørre bandager eller vandopløselige salver. Vi kan sige, at kvaliteten og egenskaberne af "substrat", hvorpå celler dyrkes er et meget vigtigt øjeblik for effektiviteten af transplantation af cellemateriale, og dermed for resultaterne af det arbejde af læger. Men den ideelle sårbandage for i dag er ikke, på trods af den overflod af de foreslåede muligheder (kunstlæder, ikke-vævet stof af carboxymethylcellulose, fibrin belægninger, semipermeabel polyurethan film). Ikke ubetydeligt øjeblik i denne sag er prisen på "substrater" (specielle sårovertræk), da deres høje omkostninger øger de samlede omkostninger ved bioteknologisk behandling.

Effektiviteten af cellulære teknologier har vist sig at være til dato, men desværre er disse teknologier meget dyre, især i lande hvor industriel produktion af cellulære sammensætninger ikke er etableret. Ikke desto mindre har lande som USA længe etableret en industri til produktion af cellulært materiale til transplantation af brændt. Især selskabet BioSurface Technology Inc, siden 1989, hævet 37.000 laminerede lag af keratinocytter, som er blevet anvendt til behandling af 240 patienter i 79 lande rundt om i verden (R.Odessey, 1992) med 1 cm ² cellekultur koster ca. 7-8 $ US.

Teknologien til behandling af forskellige sygdomme og hudproblemer har en række forskelle, men kernen i enhver behandling med celler er produktionen af kvalitetscellemateriale og dets transplantation.

Denne proces består af følgende trin:

• udvælgelse af hud fra de berørte (eller fra donorer)
• transport af hudflapper til bioteknologicenteret,
• isoleringen af celler i det basale lag og deres multiplikation,
• opbygning af flerlagslag af keratinocytter (IPC).
• transplantation af cellekulturer.

Hovedproblemet i behandlingen med transplantationen af multilagskeratinocytlag er behovet for levedygtige celler i alle stadier af celletransplantation. Hudstykker til isolering af autologe eller allogene celler bør være så tynde som muligt, da de i dette tilfælde er lettere at adskille ved hjælp af mekaniske og enzymatiske metoder og for at opnå en suspension af levende celler til vækst. De kan opnås ved at afskære dermatomet eller ved hjælp af øjenlågens hud, forhuden, den indre overflade af skulderen. Da cellerne er følsomme for halogener (chlor, jod), hydrogenperoxid, kan de ikke anvendes til behandling af huden på tidspunktet for indtagelse af materialet.

Det kvantitative og kvalitative udbytte af celler fra hudtransplantater og effektiviteten af deres dyrkning afhænger også af donorens sundhedsstatus og -alder. Hertil kommer, at hudbiopsiprover skal leveres til laboratoriet så hurtigt som muligt og under passende forhold (miljø, temperatur) leveret til et certificeret og akkrediteret laboratorium.

Eagle's medium eller medium 199 med tilsætning af 10% bovint serum, DMEM-medium tilsat 5% føtalt bovint serum og antibiotika kan anvendes til at lagre og transportere hudflapper.

I det cytologiske laboratorium er den kutane biopsi først mekanisk opdelt i små stykker, hvorefter behandlingen af hudfragmenter udføres ved hjælp af enzymer: trypsin, collagenase, dyspase mv.

Under virkningen af enzymer finder destruktion af desmosomer sted, og keratinocytter frigives i mediet som separate celler eller aggregater bestående af forskellige antal celler. Til kultur anvendes kun basale keratinocytter, som dyrkes på specielle medier i inkubatorer indeholdende 5% CO., I petriskåle eller i hætteglas ved t = 37 ° C. Indenfor 48 timer observeres dannelsen af keratinocytkolonier, som gradvist konvergerer til et monolag. Efter opnåelse af et tilstrækkeligt antal celler spredes den resulterende suspension på sårdækslerne fremstillet til dette formål og anbragt i petriskåle. Fra suspensionen dannes først et monolag og derefter et flerlagslag af keratinocytter. Skematisk er stadierne af keratinocytkultiveringsprocessen vist i fig. 12 (33,43,54,65).

Dannelsen af en flerlags keratinocytdannelse egnet til transplantation tager sædvanligvis 7-10 dage. Nogle gange er denne periode længere, hvilket afhænger af kvaliteten af kildematerialet (alder, donorhygiejne, materialets rigtighed, kvaliteten af de anvendte medier osv.). Hvis det flerlagede lag overgrover, kan der på dets overflade være celler med apoptose fænomener, der ikke er egnede til transplantation. Petriskåle, der vokser i dem på sårbeklædning af flerlagslag af keratinocytter (IPC), leveres til klinikken i specielle beholdere ved en temperatur, der ikke er lavere end + 15 ° C.

Den modificerede Greens metode til dyrkning af IPC

I vores arbejde som sårbelægning anvendte vi en flerlags cambric, der opgav polyporefilmene, som vi begyndte at arbejde i et forsøg på med rotter. Således blev flere lag keratinocytlag vokset af os på præfat og steril batiste, selv om det heller ikke er det optimale sårdække.

Kliniske undersøgelser blev udført på frivillige med overholdelse af de nødvendige etiske normer: underskrivelse af en traktat og informeret samtykke.

1. Kulturen af egen (autolog) og taget fra bankcellerne (allogene) keratinocytter blev anvendt.
2. Egnede keratinocytter blev opnået fra et stykke hudskåret indvendigt af patientens skulder.
3. Dermabrasion af ar blev udført ved hjælp af termokobling, roterende diske og erbium laser.
4. Grupper af patienter med normotrofiske, hypotrofe og hypertrofiske ar blev taget.

Den teknologiske proces til anvendelse af cellulær teknologi til forbedring af typen af hud arr bestod af følgende trin:

1. Udvælgelse af patienter.
2. Forklar kernen i behandlingen, tidspunktet for at opnå de forventede resultater, underskrivelsen af en traktat og informeret samtykke.
3. Udnævnelse af patienter i 2-3 uger før operation selmevit med 1t. 3 gange om dagen, zinkteral på 1t. 3 gange om dagen.
4. Med et stykke hud 2,0 cm langt og 0,7-1,0 cm bredt fra skulderens overflade, højt, næsten i bunden af aksillærområdet, for at opnå autologe keratinocytter.
5. I tilfælde af at patienter nægter at isolere deres egne keratinocytter på grund af muligheden for at opnå en lineær ar på skulderens indre overflade, blev det cellulære materiale taget fra en cellebank (allogene keratinocytter).
6. Keratinocytter blev isoleret og dyrket under betingelser for et laboratorium certificeret til denne type arbejde.
7. Efter at have modtaget en IPC, der var tilstrækkelig til transplantation, blev en kirurgisk dag administreret til aren på klinikken, hvor materialet blev bragt i særlige beholdere i petriskåle.
8. Operationen af dermabrasion af vommen, haemostasen blev udført, grundoverfladen blev vasket med steril saltopløsning, tørret, hvorefter IPC blev transplanteret på sterile batistiske "celler ned". Det vil sige, at cellerne, der var øverste i MIC, var lavere, støder op til den polerede overflade.
9. En steril film blev overlejret på toppen, som blev fastgjort til huden med et elastisk bandage eller Omnifix elastisk båndhjælpemiddel. I stedet for filmen kan ligeglade sårbelægninger indeholdende silikone, for eksempel Mepitel, Mepiform, siliconegelplader, også anvendes.

Efter 5-7 dage fjernes film- eller silikoneovertrækningen. På dette tidspunkt må alle keratinocytter krybe ind på det polerede ar og fastgøres til overfladen.

10. Det våde miljø, der er skabt under film- og silikoneovertrækningen, bidrager aktivt til dette. Baptiste, der er tilbage på vommen fra dette punkt, kan imprægneres med curiose eller chitosan gel. Som følge heraf er der på 2. Dag skabt en tæt skorpe, som for patientens bekvemmelighed er bedre at fiksere med en elastisk, luftgennemtrængelig gips, f.eks. Omnifix. Den åndbar skorpe gør det muligt for de nyligt dannede epidermier at skelne og blive til en moden.

Afhængigt af typen af ar og dybden af slibning afvises dressingen efter 8-10 dage. Den epidermis på dette tidspunkt har 30-40% flere cellulære lag end i normal hud. Den basale membran er ikke dannet. Keratinocytter af den fortykkede epidermis frigør en masse biologisk aktive molekyler i arvæv.

Succesen med bioteknologisk behandling af ar afhænger i vid udstrækning af den måde, hvorpå de bliver taget hånd om i den postoperative periode. Cellekulturer er en "sår" slags sårdække, og i de tidlige perioder efter transplantationen kan BMD nemt løsnes fra de underliggende væv. Derfor anbefales patienter at tage sig af arr efter operation. I 8-9 måneder må du ikke gnide og nemt arbejde med koldt kogt vand for at undgå at rive en tynd, nyoprettet epidermis, der ikke har et tæt greb med de underliggende væv.

Bemærk.

Før operation og under dermabrasion anvendelse af halogenerede oxidanter og konserveringsmidler (yodopiron, sulyodopiron, iodinol, yodinat, chlorhexidin hydrogenperoxid) er tilladt før omplantning kletok- absolut kontraindiceret på grund af deres cytotoksiske virkninger. Giftig for celler er også methylenblå. Strålende grøn.

For at undgå infektion, især når man arbejder med hypertrofiske ar, er det muligt at behandle operationsfeltet med neomycinsulfat, polymyxin eller gentamicin. De udøver ikke en cytotoksisk virkning på keratinocytter.

Som et resultat af denne behandling opnås en tredobbelt effekt.

1. Justering af rumens overflade.
2. Lav et lag over det af en ny epidermis, normal tykkelse.
3. Omdannelse af arvæv i dermopodobnuyu ved virkningen af cytokiner, vækstfaktorer og andre bioaktive molekyler, der udskilles af transplanterede celler og keratinocytter stimuleret med dem, fibroblaster og makrofager.

Arret bliver mindre mærkbart, mere elastisk, porer vises i det, blårhår, pigmentering kan genoprettes på grund af tilstedeværelsen af melanocytter i MPC.

Men alle disse positive øjeblikke i cicatrixen kommer ikke straks. I den henseende er det nødvendigt at advare patienterne. At processen med transformation af arvæv i dermis er langsom, og det optimale resultat af en sådan behandling kan forventes ikke tidligere end 10-14 måneder. Umiddelbart efter at forbindingen er afvist, har de polerede overflader et udpræget polychrom, jo lysere er malingsprocessen. Den mindste skade på huden opstår, når man sliber de normotrofe ar med en erbiumlaser. Farmen på ar og omgivende hud blev restaureret i perioden fra 3 til 8 uger. På trods af sådanne forholdsregler er der undertiden postoperativ hyperpigmentering, som kan fortsætte uafhængigt i flere måneder.

[1], [2], [3], [4], [5], [6], [7], [8], [9], [10], [11]