Ét hætteglas, to mål: Bærbar CRISPR-baseret tuberkulosediagnose med 100 % følsomhed

En artikel om en bærbar tuberkulosetest, der kan udføres direkte fra sputum uden komplekst udstyr, blev offentliggjort i Science Advances. Isotermisk DNA-amplifikation og CRISPR-aflæsning kombineres i et enkelt reagensrør; to konservative M. tuberculosis-indsættelser (IS6110 og IS1081) testes på én gang, plus et humant gen som intern prøvekontrol. I en lille "blind" test på kliniske prøver gav testen 100 % sensitivitet (6/6) og 100 % specificitet (7/7) sammenlignet med kultur; detektionsgrænsen er ~69-81 CFU/ml i simuleret sputum. Resultatet kan ses på en papirteststrimmel, og reagenserne frysetørres (opbevaring uden en "koldkæde").

Baggrund

Ifølge WHO vil tuberkulose dræbe omkring 1,25 millioner mennesker i 2023; tuberkulose er endnu engang blevet den hyppigste dødsårsag for infektioner med anslået 10,8 millioner tilfælde. Dette gør tilgængelig og hurtig diagnosticering afgørende, især i ressourcebegrænsede miljøer.

• Nuværende tests er et kompromis mellem nøjagtighed, hastighed og pris. "Guldstandard"-kulturen er meget præcis, men langsom; mikroskopi er hurtig, men ufølsom; PCR-platforme som Xpert MTB/RIF Ultra er betydeligt mere følsomme (LOD ≈ 15,6 CFU/ml), men kræver dyrt udstyr og patroner, hvilket begrænser dækningen.
• Hvorfor isotermisk og CRISPR? Isotermisk RPA-amplifikation fungerer ved 37-42 °C og kræver ikke termiske cyklusser — praktisk "i felten". CRISPR-aflæsning (Cas12/13) tilføjer artsspecificitet og muliggør visuel lateral flow ("strip") uden kompleks optik. Alt i alt er dette vejen til bærbare og billige PVR-tests.
• Hvorfor to MBT-mål på én gang (IS6110 + IS1081). IS6110 er et multikopi-indsæt af M. tuberculosis- komplekset, men nogle linjer har få kopier, og tests for IS6110 alene kan "misse". Tilføjelse af et andet IS1081-indsæt reducerer risikoen for falsk-negative resultater.
• Hvorfor intern menneskelig kontrol. Åndedrætsprøver kan indeholde inhibitorer og "dårlige" prøver. Endogen menneskelig kontrol (f.eks. RNase P/genomisk DNA) bekræfter, at materialet er tilstrækkeligt, og at reaktionen ikke undertrykkes - ellers kan resultatet ikke betragtes som negativt.
• Formatet med én beholder er vigtigt i sig selv. Det reducerer antallet af trin, reducerer risikoen for kontaminering og letter arbejde uden for laboratoriet. Sådanne tilgange til TB har allerede vist sig at være levedygtige; det nye arbejde udvider ideen til et dobbeltmålformat med interne kontroller og demonstrerer desuden frysetørring af reagenser og en striplæser.
• Hvad er værdien af den aktuelle artikel? Forfatterne demonstrerede detektion direkte fra sputum efter den mest forenklede prøveforberedelse, detektionsgrænsen på ~70-80 CFU/ml i simuleret sputum og 100 % sensitivitet/specificitet på et lille blindet sæt af kliniske prøver - en god "teknisk demonstration" til yderligere multicentervalideringer.

Hvordan fungerer dette

• Forskerne kombinerede RPA (hurtig isotermisk amplifikation af genetisk materiale ved 37 °C) med de "skære" enzymer Cas13a/Cas12a. Efter at have udvalgt guide-RNA'erne konfigurerede de systemet til at målrette to MBT-mål samtidigt og parallelt med humant DNA (og kontrollere, at der overhovedet er materiale i prøven, og at reaktionen ikke er "gået i stå").
• Al kemien kommer i ét reagensglas; efter inkubation aflæses resultatet enten med et fluorimeter eller på en lateral flowstrimmel - stort set ligesom en eksprestest.
• Sputumbehandling er blevet forenklet til opvarmning og en kort centrifuge – uden nukleinsyreekstraktorer. For de mest begrænsede betingelser diskuterer forfatterne endda manuelle alternativer til centrifugen.

Hvad testene viste

• Detektionsgrænse: 69,0 CFU/ml (stamme H37Rv) og 80,5 CFU/ml (BCG) i "spike"-sputum. Der blev ikke påvist krydsreaktivitet med andre bakterier/svampe.
• Klinisk setting (blindede prøver): på 13 prøver fra virkelig praksis - 100 % sensitivitet (6/6) og 100 % specificitet (7/7) i forhold til såning. Til sammenligning viste GeneXpert Ultra på det samme kit henholdsvis 100 %/86 %.
• Tekniske nuancer: Af de to aflæsningsmuligheder fungerede Cas13a bedre (for "one-pot"-formatet er det mere følsomt end Cas12a). Derudover reducerer parallel testning af to Mtb-mål risikoen for falske resultater.

Hvorfor er dette nødvendigt?

Dagens tests er et kompromis mellem nøjagtighed, hastighed og tilgængelighed: dyrkning er meget præcis, men langsom; podninger er hurtige, men unøjagtige; PCR-systemer som GeneXpert er præcise og hurtige, men kræver dyre instrumenter og patroner. Den nye CRISPR-tilgang sigter mod at lukke hullet: feltdiagnostik, der fungerer ved 37 °C, med papirstrimmelaflæsninger og muligheden for at opbevare reagenser uden køling.

Begrænsninger og hvad der nu skal ske

Dette er en tidlig demonstration på et lille klinisk sæt - store, multicenterforsøg er nødvendige (herunder HIV-coinfektion hos børn, med paucibacillære former og forskellige MBT-linjer). Forfatterne bemærker separat, at i selve "felt"-versionen skal bordcentrifugen erstattes med en fuldt manuel løsning. Men selve arkitekturen - "to mål + intern kontrol" i ét reagensglas - har allerede bevist sin funktionalitet og giver en klar vej til forfining til massebrug.

Kilde: Alexandra G. Bell et al. En strømlinet CRISPR-baseret test til påvisning af tuberkulose direkte fra sputum, Science Advances, online 6. august 2025 (bind 11, nummer 32). DOI: 10.1126/sciadv.adx206