Eksperimentelt arbejde med transplantation af allogene keratinocytter på kunstigt skabte ar hos hvide rotter

Ønsket om at udnytte det cellulære potentiale og behovet for at finde nye effektive metoder til at forbedre ars æstetiske udseende førte til ideen om at forsøge at undersøge muligheden for at transplantere keratinocytter på aroverflader.

For at bevise sandsynligheden for at bruge keratinocytkultur til at forbedre ars udseende, blev der udført en eksperimentel undersøgelse på hvide laboratorierotter, hvortil der blev skabt aroverflader. Rottearmodellen blev opnået som følge af heling af kunstigt påførte sår på ryggen langs rygsøjlen. Rotterne fik skåret identiske hudstykker ud på 2x3 cm. 2,5 måneder efter "armodellerings"-operationen gennemgik rotterne dermabrasion (fjernelse af de øverste lag af arret ved hjælp af termokaustik), og allogene keratinocytter blev transplanteret, isoleret fra huden på rotteunger 2-4 dage efter fødslen.

Isolering og dyrkning af rotteepidermisceller blev udført i laboratoriet for celleteknologier ved Institut for Cytologi ved Det Russiske Videnskabsakademi ved hjælp af følgende teknologi.

Huden blev vasket i Hanks saltvandsopløsning indeholdende 200 U/ml gentamicin og skåret i små stykker på 0,2-0,5 cm2 ^. Hudstykkerne blev inkuberet i 0,5% dispaseopløsning i balanceret saltfosfatbufferet opløsning ved 37°C i 1 time. Stykkerne blev derefter overført til Dulbeccos fosfatbufferede saltvandsopløsning, og epidermis blev adskilt fra dermis. Epidermis blev inkuberet i 0,125% trypsinopløsning i 10-15 minutter under omrøring ved 50 rpm, hvorefter enzymvirkningen blev stoppet ved at tilsætte 5% føtalt bovint serum. En tredjedel af den resulterende cellesuspension blev anvendt i ren form til en af mulighederne for transplantation på ar, den anden tredjedel blev dyrket på biokompatible huslige filmovertræk "Polypor", og den tredje - på petriskåle uden substrat. Operation med dermabrasion af de resulterende ar hos rotter med efterfølgende transplantation af rotte-epidermisceller på dem blev udført under etherbedøvelse ved hjælp af termisk kauterisering.

I den første gruppe rotter blev der efter dermabrasion placeret sterile stykker cambric på den polerede overflade af arret, vasket med fysiologisk opløsning og tørret, hvorpå en rystet suspension af allogene rotte-epidermocytter blev påført i en koncentration på 1,5 millioner celler pr. 1 ml (ifølge Institut for Cytologi). Cambric-stykkerne blev placeret på det polerede ar, så cellerne lå på arrets overflade. Ovenpå blev der lagt en bandage af flere lag gaze, som blev syet fast til arrets kanter.

En del af den opnåede cellesuspension blev podet i petriskåle på sterile Polypore-film skåret i skålenes form, den anden del - på petriskåle uden film. Dyrkning blev udført i FAD-medium, bestående af en blanding af DMEM og F12-medium i forholdet 3:1 med tilsætning af 10% føtalt bovint serum, 5 μg/ml insulin (Sigma), 0,5 μg/ml hydrocortisonhemisuccinat (Sigma), 10 μg/ml epidermal vækstfaktor EGF (Institute of Cytology RAS, St. Petersburg). Den anden og tredje gruppe rotter, 7 individer hver, blev opereret 6 dage efter den første. På dette tidspunkt var der dannet flerlagslag fra suspensionen af podede keratinocytter i petriskålene, som blev transplanteret i rotterne. Den anden gruppe blev transplanteret med epidermocytter på en film, den tredje - med et flerlagslag uden substrat. Efter 7 dage blev de opnåede flerlagslag af allogene keratinocytter (MPALK), podet på "Polypore"-filmene, transplanteret som en kultur direkte på såroverfladen. Ovenpå blev filmen, for at undgå at den blev revet af, fastgjort med en flerlags gazebind og syet til rotternes hud.

Før transplantation af keratinocytter til den tredje gruppe rotter dyrket uden substrat, blev PAC adskilt fra bunden af petriskålen ved at behandle den med dispase, som har evnen til selektivt at forstyrre dermal-epidermal bindinger. Når dispase virker på et flerlagslag, forstyrrer det forbindelsen mellem basallagscellerne og bunden af petriskålen og har en meget mindre effekt på de intercellulære forbindelser, hvilket gør det muligt at "fjerne" laget helt. Frigørelse af det flerlagede cellelag med dispase blev udført som følger. Transportmediet blev drænet fra petriskålene, og cellelagene blev vasket tre gange med et næringsmedium indeholdende antibiotika, især gentamicin (0,2 mg/ml). De flerlagede lag blev fyldt med 0,125% dispaseopløsning ("Sigma") og placeret i en termostat, hvor de blev inkuberet ved t=37°C i 20-30 minutter. Udseendet af en hvid rand, der skaller af langs lagets periferi, er en indikator for begyndelsen af processen med dets separation fra kanterne og bunden af petriskålen. Få minutter efter starten af separationsprocessen blev dispase-opløsningen drænet, og epitellagene blev vasket 2-3 gange med mediet. Et stykke steril sårforbinding "Lita-color", skåret til koppens størrelse, blev påført overfladen af det epidermale lag, hvorpå laget, der var adskilt af dispase, og som yderligere var skrællet af koppens bund med en spatel, blev sat på. Ved hjælp af en øjenpincet blev laget sammen med belægningen af servietten "Lita-color" (Rusland) revet af fra bunden af petriskålen og forsigtigt overført til den forberedte overflade af arret. Serviettene "Lita-color" indeholder gentamicin og exolin (kollagenekstrakt), som, når de blev fugtet med resterne af vækstmediet og derefter med en fysiologisk opløsning, svulmede op og blev til en moderne sårforbinding, der giver god beskyttelse mod ekstern infektion og hurtig heling på grund af den fugtabsorberende struktur.

Flerlags gazebind blev påført Polypore-filmene og Lita-color-servietterne og syet til rotternes hud for stærkere fiksering. Hver rotte blev placeret i et separat bur for at skabe optimale betingelser for dens vedligeholdelse og indpodning af de transplanterede keratinocytter. Bandagerne til de rotter, hvortil suspensionen og det flerlagede lag af epidermocytter fjernet ved dispase blev transplanteret, blev fugtet med sterilt saltvand flere gange om dagen for at skabe de mest gunstige betingelser for indpodning af cellerne. I betragtning af at Polypore-filmen var uigennemtrængelig for vand, blev bandagerne til rotterne i den anden gruppe ikke fugtet, hvilket var en af fordelene i forhold til transplantationer uden film. Bandagerne blev fjernet efter 10 dage. Det kliniske billede af ar efter celletransplantation adskilte sig kun lidt fra ar uden transplantation, bortset fra deres lyserøde farve (på grund af dermabrasion) og større afskalning. Denne kendsgerning tyder på, at der ikke skete ændringer i arret umiddelbart efter at sårforbindingerne faldt af med MPC.

Udtagning af biopsimateriale fra rotter.

1, 2, 5 og 9 måneder efter transplantation af allogene keratinocytter fra rotter på polerede ar fra hvide rotter blev der udtaget materiale til histologisk, cytomorfologisk og elektronmikroskopisk undersøgelse. Prøver af normal rottehud og ar uden celletransplantation blev taget som kontrol. Anæstesi af rotter blev udført ved hjælp af etheranæstesi.

Efter anæstesi blev der udtaget stykker arvæv fra de markerede områder, hvortil keratinocytterne var transplanteret, ved hjælp af en biopsipunch med en diameter på 2 mm og placeret i en 2,5% glutaraldehydopløsning for at forberede materialet til elektronmikroskopisk undersøgelse. Vævsstykker taget til histologisk undersøgelse blev placeret i en 10% neutral formalinopløsning, efterfulgt af at blive passeret gennem alkoholer og indlejret i paraffin, hvorefter ultratynde snit blev skåret og undersøgt i et lysoptisk mikroskop.

Kontrol I. Normal rottehud.

For at se forskellen mellem det mikroskopiske billede af normal arforandret rottehud og ar på bestemte tidspunkter efter transplantation af MPC, vises fotografier og beskrivelser af dem i alle stadier af denne undersøgelse.

Epidermis i normal hud består af 7-9 cellelag. Stratum corneum er af moderat tykkelse. Nogle steder består den af 6-8 lag hornede skæl. Basallaget er repræsenteret af cylindriske celler med store, lette, regelmæssigt formede kerner og adskillige nukleoler. Desmosomale forbindelser mellem cellerne og med basalmembranen er tydeligt udtrykt. Under den veldefinerede basalmembran, som har små udvækster i det subepidermale lag, ligger parallelt med den fine bundter af kollagen- og elastinfibre, blandt hvilke der er aflange fibroblaster, små kar. I dybere lag ligger bundter af kollagen- og elastinfibre i forskellige retninger. Blandt dem er mange kar med tynde vægge af samme kaliber, cellulære elementer (fibroblaster, mastceller, leukocytter). Et stort antal hårsække og talgkirtler.

Kontrol 2. Rottear, 2 måneder gammel.

Klinisk billede. Arrene er lyserøde, afskalning, og der er stadig skorper på enkelte steder. Deres areal er reduceret på grund af sammentrækning af kollagenfibrene og er blevet cirka 3,0-3,5 cm ^. Hudvedhæng er fraværende.

Mikroskopisk billede. Epidermis består af 3-5 foldede celler, repræsenteret af afrundede basalceller, en række subulatceller, 1-2 rækker granulære celler med keratohyalinkorn i det øverste lag, der er områder med intracellulært ødem. Stratum corneum er ujævnt ændret fra meget tyndt til fortykket. Arfoldning ses på grund af (kontraktion) af arvæv. Folderne trænger ind i papillærlaget og skaber indtryk af papiller. Grænsen mellem epidermis og dermis er en lige linje. Basalmembranen er ikke sporet overalt. I den nedre del af subepidermal og dybere lag er der kar med en tyk, løs væg, mange er øde med stase. Omkring karrene er der en ophobning af makrofager, fibroblaster. Makrofager omgiver erytrocytterne, der frigives fra kapillærerne, og fagocyterer dem. I de mere overfladiske lag er der små kapillærer. Under epidermis er kollagenfibre løst placeret. I det dybere lag af arret er der grove bundter af kollagenfibre, blandt hvilke der er mange fibroblaster.

Rottear en måned efter transplantation af rottekeratinocytter.

Klinisk billede. Arrene er lyserøde, deres areal er reduceret, især i diameter, og er i gennemsnit 2,5-3 cm² ^. Hår og talgkirtler er fraværende.

Dataene fra mikroskopisk undersøgelse af materiale opnået fra rotter med transplantation af MPaLK på film og MPaLK uden substrat er praktisk talt identiske. Rent teknisk er det dog meget mere kompliceret og omhyggeligt at arbejde med MPaLK uden substrat end ved dyrkning af MPaLK på et substrat. Derfor anvendte vi i yderligere undersøgelse af spørgsmålet om transplantation af keratinocytter til ar flerlags cambric som basis for dyrkning ("substrater").

Mikroskopisk billede. Der ses en fortykkelse af epidermis til 15-20 lag, næsten i midten af hvilken keratinocytterne har en smal, aflang, lodret form og kompakt placering. Basalcellerne er placeret i en ujævn linje. Deres kerner er lette, store, afrundede med en eller to nukleoler, hvilket indikerer deres høje syntetiske og proliferative aktivitet. Grænsen mellem epidermis og dermis er en lige linje. Tornlaget er veludviklet og består af 3-5 lag afrundede celler, der er 2 nukleolære celler.

Umiddelbart under basalmembranen er der tæt placerede tynde bundter af kollagenfibre, parallelt med dem er der et stort antal øde kar, dybere kollagenfibre er grovere, samlet i tætte bundter. Mange store fibroblaster, mastceller (2-3 i synsfeltet), makrofager, leukocytter og øde kar, hvis vægge er løsnet, omkring dem er der løst placerede kollagenfibre. I nogle kar er der stase, diapedese af dannede elementer. Omkring karrene er der fibroblaster, enkelte lymfocytter. Hudvedhæng er fraværende.

Ved transplantation af en keratinocytsuspension på et poleret ar, adskiller det mikroskopiske billede sig fra det foregående. Hos de fleste dyr er epidermis tynd og består af 5-6 lag celler. Det nederste lag består af celler med uregelmæssig, polygonal form med kerner med rund-uregelmæssig form. Tilstanden af det subepidermale lag svarer til dets tilstand hos gruppen af dyr uden MPALK-transplantation.

I dette tilfælde kan vi tale om enten en forsinkelse i de processer, der ledsager celletransplantation, eller om et stort tab af celler transplanteret i form af en suspension. Derfor blev der draget en konklusion om uhensigtsmæssigheden af arkorrektion ved transplantation af keratinocytter i form af en suspension.

Rottear 2 måneder efter transplantation af rottekeratinocytter.

Klinisk billede. Arret ser tyndt og fint ud. Stedvis observeres afskalning og skællende pletter.

Mikroskopisk billede. Stratum corneum er fortykket, stedvis - hyperkeratose. Epidermis er fortykket og består af 12-20 rækker celler. Grænsen mellem epidermis og dermis er en lige linje. Delikate kollagenfibre under epidermis ligger ret tæt. I de dybere lag af arret er de samlet i store, grove bundter. I det subepidermale lag opstår ny vaskulær dannelse. I de nedre lag af arvæv er der mange øde kar placeret parallelt med epidermis' overflade. Store fibroblaster er jævnt fordelt i arrets tykkelse, der er gigantiske, flerforgrenede, mange makrofager.

Rottear 5 måneder efter transplantation af rotte-epidermisceller.

Klinisk billede. Arret ser jævnt og glat ud uden at skalle af, der er enkelte hår, deres tæthed er større i periferien af arret, hvilket indikerer marginal indvækst af hårsække i arret og nydannelse af hårsække. Ararealet af ar fortsætter med at mindskes.

Mikroskopisk billede. Epidermis er stadig tyk (15-20 lag, nogle steder op til 30), og i de øvre lag er den fyldt med keratohyalinkorn. Basalmembranen er tydeligt synlig. Under den ligger kollagenfibre løst. I de nedre lag er kollagenet kraftigere og tæt pakket. Der er mange kapillærer mellem kollagenbundterne. I de øvre lag er antallet af øde kar reduceret. Overgangen mellem epidermis og dermis er let bølget. Nogle steder er der dybe epidermale udvækster i arvæv. Nydannede kar er synlige mellem kollagenfibrene. Enkelte hårsække og talgkirtler fremkommer.

Rottear 9 måneder efter transplantation af rotte-epidermale MPA-celler.

Klinisk billede. Arrene er blevet betydeligt mindre i størrelse sammenlignet med tidligere perioder, deres areal er i gennemsnit omkring 1,5-2,0 cm² ^. Arrene er ujævnt dækket af fine hår, især i periferien. Mindre finpladeafskalning er stadig til stede.

Mikroskopisk billede.

Epidermis er blevet tyndere, repræsenteret af 6-8 rækker celler, ligner epidermis i normal rottehud i struktur, kun celletætheden er 1 mm højere, og de er mindre. Basallaget består af små rundcylindriske celler. Basalmembranen er veludviklet, hemidesmosomer er tydeligt synlige. Tilstedeværelsen af epidermale udvækster i det subepidermale lag bemærkes. Papillarlaget udtrykkes langs hele arrets længde. Disse fakta indikerer, at adhæsionen af de transplanterede keratinocytter på dette tidspunkt er blevet meget stærkere med det underliggende arvæv. Derfor kan arpleje hos personer med MPALK-transplantation 9 måneder efter MPC-transplantation være traditionel. Under epidermis er kollagenfibre mere sarte end i de dybe lag. Mange kar er dukket op, især overfladiske. Væggene i større kar er fortykkede. Hårsække og talgkirtler er i store mængder. Det mikroskopiske billede ligner dermallignende væv.

Resultater af eksperimentelt arbejde og diskussion heraf.

I løbet af dette arbejde blev keratinocytter i forskellige former transplanteret på kunstigt fremstillede rottehudar efter dermabrasionskirurgi - på sårbeklædning, som en suspension på cambric og som et flerlagslag uden substrat. Arbejdet blev udført med det formål at indhente morfologiske data om effekten af transplanterede allogene keratinocytter på ar, samt at bestemme optimale transplantationsmuligheder.

Det blev konstateret, at alle tre transplantationsmetoder er mulige, men transplantation af MPAC uden substrat er en meget arbejdskrævende procedure, hvorunder MPAC kan blive beskadiget, hvilket påvirker resultaterne af transplantationen. Desuden udelukker denne transplantationsmetode arbejde på store overflader.

Transplantation af keratinocytsuspensioner er en langt mere omkostningseffektiv metode, kræver ikke langvarig celledyrkning og er enkel i den version, vi foreslår, ved hjælp af sterile kambriske blanke, hvis størrelse svarer til arrenes størrelse. Forsinkelsen i den terapeutiske effekt ved transplantation af en cellesuspension på omkring en måned sammenlignet med MPC på en sårbelægning er ikke et væsentligt punkt ved en behandlingsvarighed på mange måneder. Det er kendt, at når MPC transplanteres til brandsårspatienter, sker transformationen af hudstrukturen gradvist og over flere år. Transplantation af keratinocytkultur på sårbelægninger er den mest bekvemme og lovende metode, men også betydeligt dyrere. Derudover kræver det i øjeblikket en søgning efter mere avancerede belægningsmuligheder, der skal være fleksible, hygroskopiske, have bakteriostatiske eller bakteriedræbende egenskaber og være biologisk neutrale for celler. Filmen "Polypor" - en mellemliggende version af den indenlandske sårbelægningsfilm - tillod os på trods af nogle ufuldkommenheder at studere transplantation af rottekeratinocytter på ar i eksperimentet og drage konklusioner om effektiviteten af denne retning af arbehandling.

Forfatterne, der transplanterede MPC på brandsår, bemærkede, at epidermis i løbet af den første uge efter transplantation af et flerlags lag af keratinocytter på desinficerede sår, blev fortykket og lagdelt. Alle lag af epidermis var tydeligt synlige. Interessant nok var antallet af cellelag i transplantaterne 10-30 % større end i hudbiopsier. Forfatterne bemærkede forekomsten af keratohyalingranulat på den 5. dag efter MPC-transplantation, og basalmembranen og hemidesmosomer - allerede på den 3. dag.

J.Rives et al. (1994), Paramonov BA (1996); Kuznetsov NM et al. (1998) fandt, at i de tidlige stadier efter transplantation af MPC til patienter med huddefekter i fuld tykkelse efter forbrændinger, er forbindelsen mellem dermis og epidermis meget svag og en lige linje, mens papillærlaget er fraværende. Ved udgangen af den 2. måned begynder der at dannes overfladiske papiller og hudvedhæng, og forbindelsen mellem dermis og epidermis bliver stærkere. Litteraturdata indikerer, at transplantation af allogene keratinocytter på sår hos forbrændingspatienter er en lovende metode. På trods af at afstødning af allogene keratinocytter ifølge forskellige forfattere sker inden for 10 dage til 3 måneder, spiller de ikke desto mindre en rolle i heling af såroverfladen, udskillelse af vækstfaktorer og mekanisk lukning af defekten. Det antages, at MPALC har reduceret antigenaktivitet, da de under in vitro-dyrkning mister Langerhans-celler, hvilket gør det muligt for dem at eksistere i modtagerens krop i lang tid. Derudover har en allogen kultur udtaget fra huden hos unge, raske mennesker et uforligneligt større biologisk potentiale end en autolog kultur af patienter efter en skade.

Hovedformålet med vores undersøgelse var at finde ud af, om allogene keratinocytter vil slå rod i ar, og hvilke ændringer der vil ske i arvævet under påvirkning af en sådan biologisk aktiv "sårbelægning". I tilfælde af et positivt resultat, at udvikle den mest effektive og mindst arbejdskrævende teknologi til dette område af rehabiliteringsmedicin.

De data, vi indhentede, lignede på mange måder litteraturdataene om morfologiske ændringer, der forekommer i den menneskelige epidermis efter transplantation af allogene keratinocytter til brandsår. Der er dog også betydelige forskelle, både med hensyn til det morfologiske substrat, hvorpå transplantationen finder sted, og med hensyn til teknologi. Således forekommer processen med dannelse af basalmembranen og dermal-epidermale forbindelser (hemidesmosomer, papiller) på et senere tidspunkt sammenlignet med transplantation af keratinocytter til såroverflader uden arforandringer. Tilsyneladende sker dette på grund af den dårligere ernæring af arvævet sammenlignet med dermis eller muskelfascien. Et ar, især et gammelt, er et tæt bindevæv med et meget lille antal kar, mens bunden af et brandsår er granulationsvæv rigt på kar. Det er således indlysende, at de betingelser, hvorunder transplantation og indpodning af keratinocytter forekommer, er absolut forskellige. Jo mere vaskulariseret celletransplantationsområdet er, desto lettere er processen med deres indpodning. Fra dette postulat følger konklusionen om præferencen for at arbejde med unge ar, hvor bindevævet stadig er ret løst og rigt på kar.

Som et resultat af dette eksperimentelle arbejde blev det bevist, at:

1. Transplantation af MPALK til ar er mulig.
2. Den optimale transplantationsmetode er transplantation af keratinocytter på sårbelægningen.
3. Aroverfladen bør poleres ved hjælp af kirurgisk laserdermabrasion eller en Schumann-skærer.
4. Under påvirkning af MPALK forekommer hurtig epitelisering af den polerede overflade af arret.
5. Jo bedre vaskulariseret arvævet er, det vil sige jo yngre arret er, desto bedre er resultaterne af keratinocyttransplantation.
6. Under påvirkning af transplanterede keratinocytter transformeres arvævet gradvist og bliver til et dermallignende (mere løst arvæv med hudvedhæng).
7. Gradvis løsning af arvæv, startende med det subepidermale lag. Dets vaskularisering forbedres, kollagenfiberbundter i de øvre og nedre dele af arret antager en løsere placering end i arvæv uden celletransplantation. Hårsække og talgkirtler fremkommer. Epidermis, efter at have passeret hypertrofifasen, nærmer sig i sin struktur epidermis af normal hud.
8. De observerede ændringer er forbundet med vækstfaktorer og cytokiner udskilt af keratinocytter, som ved at forbedre arvævets trofisme fremmer dets transformation fra groft fibrøst væv til løsere væv, hvilket fører til en forbedring af arrets udseende.

Baseret på denne undersøgelse kan det således konkluderes, at transplanterede keratinocytter har en gavnlig effekt på arvæv, hvilket kan have praktiske implikationer for rehabilitering af patienter med forskellige typer ar.

Dette arbejde på rotter gjorde det også muligt for os at formulere kravene til sårbeklædninger, som keratinocytter dyrkes på.

Sårforbindinger bør være:

• biokompatibel med celler,
• åndbar,
• har en elastisk, formdannende base,
• være hydrofil,
• da medicinske tilsætningsstoffer indeholder antibakterielle lægemidler og antioxidanter, der ikke er giftige for dyrkede celler.

Kliniske resultater af bioteknologisk behandling af ar.

Tidligere fandt N. Carver et al. (1993), at okklusive forbindinger bedst fremmer vedhæftning til såret og overlevelse af keratinocytter, men ikke tillader dannelse af lagdelt (moden) epidermis. Et luftigt miljø er nødvendigt for dannelsen af lagdelt epidermis. Derfor blev det efter vedhæftning af et flerlagslag foreslået at fjerne den okklusive sårforbinding efter 7-10 dage og behandle sår under tørre forbindinger eller vandopløselige salver. Det kan siges, at kvaliteten og egenskaberne af det "substrat", hvorpå cellerne dyrkes, er et meget vigtigt punkt for effektiviteten af transplantation af cellemateriale og dermed for resultaterne af lægernes arbejde. Men der findes ingen ideel sårforbinding i dag, på trods af overfloden af foreslåede muligheder (kunstig hud, ikke-vævet stof lavet af carboxymethylcellulose, fibrinbelægninger, semipermeable polyurethanfilm). Et vigtigt punkt i denne sag er omkostningerne ved "substrater" (specielle sårbeklædninger), da deres høje omkostninger øger de samlede omkostninger ved bioteknologisk behandling.

Effektiviteten af celleteknologier er blevet bevist til dato, men desværre er disse teknologier meget dyre, især i lande, hvor industriel produktion af cellesammensætninger ikke er etableret. Lande som USA har dog længe etableret en industri til produktion af cellemateriale til brandsårstransplantation. Især virksomheden BioSurface Technology Inc. har siden 1989 dyrket 37.000 flerlagede keratinocytlag, som blev brugt til at behandle 240 patienter i 79 lande verden over (R. Odessey, 1992), mens 1 cm² ^cellekultur koster omkring 7-8 amerikanske dollars.

Teknologien til behandling af forskellige hudsygdomme og -problemer har en række forskelle, men enhver cellebehandling er baseret på at opnå cellemateriale af høj kvalitet og transplantation heraf.

Denne proces består af følgende trin:

• at tage hud fra ofre (eller fra donorer),
• transport af hudlapper til et bioteknologisk center,
• isolering af basallagsceller og deres proliferation,
• vækst af flerlagede keratinocytlag (MLK).
• cellekulturtransplantation.

Hovedproblemet ved behandling med transplantation af flerlagede keratinocytlag er behovet for levedygtige celler i alle stadier af celletransplantationen. Hudstykker til isolering af autologe eller allogene celler bør være så tynde som muligt, da de i dette tilfælde er lettere at adskille ved hjælp af mekaniske og enzymatiske metoder og opnå en suspension af levende celler til dyrkning. De kan opnås ved at skære med et dermatom eller ved hjælp af huden på øjenlågene, forhuden og skulderens indre overflade. Da cellerne er følsomme over for halogener (klor, jod) og hydrogenperoxid, kan de ikke anvendes ved behandling af huden under materialeindsamling.

Det kvantitative og kvalitative udbytte af celler fra hudtransplantater og effektiviteten af deres dyrkning afhænger også af donorens helbred og alder. Derudover skal hudbiopsier leveres så hurtigt som muligt og under passende forhold (miljø, temperatur) til et laboratorium, der er certificeret og akkrediteret til disse formål.

Til opbevaring og transport af hudlapper kan Eagle's medium eller medium 199 med tilsætning af 10% bovint serum, DMEM-medium med tilsætning af 5% føtalt bovint serum og antibiotika anvendes.

I cytologilaboratoriet opdeles hudbiopsien først mekanisk i små stykker, derefter bearbejdes hudstykkerne ved hjælp af enzymer: trypsin, kollagenase, dispase osv.

Under enzymers påvirkning ødelægges desmosomer, og keratinocytter frigives til mediet i form af individuelle celler eller aggregater bestående af forskellige antal celler. Kun basale keratinocytter anvendes til dyrkning, som dyrkes på specielle medier i termostater indeholdende 5% CO2, i petriskåle eller i kolber ved t = 37 °C. Allerede efter 48 timer observeres dannelsen af keratinocytkolonier, som gradvist smelter sammen og bliver til et monolag. Efter at have modtaget et tilstrækkeligt antal celler, podes den resulterende suspension på sårforbindinger, der er fremstillet til dette formål, og placeres i petriskåle. Først dannes et monolag og derefter et flerlagslag af keratinocytter fra suspensionen. Trinene i keratinocytdyrkningsprocessen er skematisk vist i figur 12 (33,43,54,65).

Dannelsen af et flerlags keratinocytlag, der er egnet til transplantation, tager normalt 7-10 dage. Nogle gange er denne periode længere, hvilket afhænger af kvaliteten af kildematerialet (alder, donorens helbredstilstand, korrekt materialeindsamling, kvaliteten af det anvendte medie osv.). Hvis flerlagslaget vokser for meget, kan celler med apoptose-fænomener, der er uegnede til transplantation, forekomme på overfladen. Petriskåle med flerlags keratinocytlag (MLK) dyrket i dem på sårbeklædning leveres til klinikken i specielle beholdere ved en temperatur på mindst +15° C.

Modificeret Greens metode til dyrkning af MPC

I vores arbejde brugte vi flerlags cambric som sårbeklædning og opgav "Polypor"-filmene, som vi begyndte at arbejde med i eksperimentet med rotter. Vi dyrkede derfor flerlags keratinocytlag på præ-affedtet og steril cambric, selvom det heller ikke er en optimal sårbeklædning.

Kliniske studier blev udført på frivillige i overensstemmelse med de nødvendige etiske standarder: underskrivelse af en aftale og informeret samtykke.

1. En kultur af patientens egne (autologe) og opbevarede (allogene) keratinocytter blev anvendt.
2. Patienternes egne keratinocytter blev udtaget fra et stykke hud, der var skåret fra indersiden af deres overarme.
3. Ar-dermabrasion blev udført ved hjælp af termokauteri, roterende skiver og en erbiumlaser.
4. Der blev taget grupper af patienter med normotrofiske, hypotrofiske og hypertrofiske ar.

Den teknologiske proces til anvendelse af cellulær teknologi til at forbedre udseendet af hudar bestod af følgende faser:

1. Patientudvælgelse.
2. Forklaringer af behandlingens essens, tidsrammen for opnåelse af forventede resultater, underskrivelse af kontrakt og informeret samtykke.
3. Ordiner til patienter 2-3 uger før operationen Selmevit 1 tablet 3 gange dagligt, Zinctheral 1 tablet 3 gange dagligt.
4. Tag et stykke hud 2,0 cm langt og 0,7-1,0 cm bredt fra skulderens indre overflade, højt, næsten i den nederste del af armhulen, for at opnå autologe keratinocytter.
5. I tilfælde hvor patienter nægtede at få isoleret deres egne keratinocytter på grund af muligheden for et lineært ar på skulderens indre overflade, blev cellemateriale taget fra en cellebank (allogene keratinocytter).
6. Keratinocytter blev isoleret og dyrket i et laboratorium, der er certificeret til denne type arbejde.
7. Efter at have opnået en tilstrækkelig mængde MPC til transplantation på arrene, blev der fastsat en dag for operationen på klinikken, hvor materialet blev bragt i særlige beholdere i petriskåle.
8. En ar-dermabrasionsoperation blev udført, hæmostase, den polerede overflade blev vasket med en steril saltvandsopløsning, tørret, hvorefter MPC'erne blev transplanteret på den på sterile kambriske "celler nedad". Det vil sige, at de celler, der var øverst i MPC'en, viste sig at være nederst, ved siden af den polerede overflade.
9. Ovenpå blev der påført en steril film, som blev fikseret til huden med en elastisk bandage eller et elastisk Omnifix-plaster. I stedet for filmen kan der anvendes forskellige sårforbindinger indeholdende silikone, for eksempel Mepitel, Mepiform, silikonegelark.

Efter 5-7 dage fjernes filmen eller silikonebelægningen. På dette tidspunkt burde alle keratinocytter være kravlet op på det polerede ar og have sat sig fast på dets overflade.

10. Det fugtige miljø, der skabes under filmen og silikonebelægningen, bidrager aktivt til dette. Den kambriske overflade, der er tilbage på arret fra dette tidspunkt, kan gennemvædes med curiosin eller chitosan gel. Som et resultat heraf dannes der en tæt skorpe på den anden dag, som for patientens bekvemmelighed bedst fastgøres med et elastisk, åndbart plaster, såsom Omnifix. Den åndbare skorpe gør det muligt for den dannede epidermis at differentiere sig og blive til en moden epidermis.

Afhængigt af artypen og dybden af slibningen afvises bandagen efter 8-10 dage. På dette tidspunkt har epidermis 30-40% flere cellelag end i normal hud. Basalmembranen er ikke dannet. Keratinocytter i den fortykkede epidermis udskiller en masse biologisk aktive molekyler i arvævet.

Succesen med bioteknologisk arbehandling afhænger i høj grad af plejemetoden i den postoperative periode. Cellekulturer er en "skånsom" type sårbelægning, og i de tidlige stadier efter transplantation kan IPC'erne let pilles af det underliggende væv. Derfor rådes patienter til at håndtere arret forsigtigt efter operationen. I 8-9 måneder må arret ikke gnides, men behandles forsigtigt med koldt kogt vand for at undgå at rive den tynde, nyoprettede epidermis af, som ikke har en tæt binding til det underliggende væv.

Note.

Før operation og under dermabrasion er brugen af halogenerede antiseptiske midler og oxidationsmidler (iodopyron, suliodopyron, iodinol, iodinat, chlorhexidin, hydrogenperoxid) tilladt, før celletransplantation - er strengt kontraindiceret på grund af deres cytotoksiske virkning. Methylenblåt og briljantgrøn er også giftige for celler.

For at undgå infektion, især når man arbejder med hypertrofiske ar, kan det kirurgiske felt behandles med neomycinsulfat, polymyxin eller gentamicin. De har ikke en cytotoksisk effekt på keratinocytter.

Som et resultat af en sådan behandling opnås en tredobbelt effekt.

1. Udjævning af arrets overflade.
2. Dannelse af et nyt lag af epidermis med normal tykkelse ovenpå.
3. Transformation af arvæv til dermallignende væv på grund af virkningen af cytokiner, vækstfaktorer og andre biologisk aktive molekyler, der udskilles af transplanterede celler og stimuleres af dem - keratinocytter, fibroblaster og makrofager.

Arret bliver mindre synligt, mere elastisk, porer og vellushår fremkommer i det, og pigmenteringen kan genoprettes på grund af tilstedeværelsen af melanocytter i IPC.

Alle disse positive aspekter af arret opstår dog ikke med det samme. I denne henseende er det nødvendigt at advare patienter om, at processen med at omdanne arvæv til hudvæv sker langsomt, og at det optimale resultat af en sådan behandling tidligst kan forventes efter 10-14 måneder. Umiddelbart efter afvisning af forbindingerne har de polerede overflader en udtalt polykromi, jo lysere, desto dybere poleringen er udført. Den mindste skade på huden ses ved polering af normotrofiske ar med en erbiumlaser. Farven på arrene og den omgivende hud genoprettes inden for 3 til 8 uger. På trods af sådanne forholdsregler forekommer der undertiden postoperativ hyperpigmentering, som kan forsvinde af sig selv inden for et par måneder.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ]